一种用于鉴别鸡匍匐性状的引物组合及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及分子生物学领域，具体地说，设及一种用于鉴别鸡甸筒性状的引物组 合及其应用。
【背景技术】
[0002] 到目前为止，在鸡体中已发现了八种矮小基因，它们分别位于性染色体和常染色 体上，其中性连锁矮小基因 dw研究较多，已对该基因进行了精确定位并明确其作用机制 (Agarwal，S.K.，L.A.Cogburn，and J.Burnside .1994.Dysfunctional growth hormone receptor in a strain of sex-linked dwarf chicken: evidence for a mutation in 化e intracellular domain. J.Endocrinol · 142:427-434.) D常染色体上的矮小型基因较 多，其中Cp基因（Cp: Creeper,甸旬型）是常染色体上一种重要的显性纯合致死基因 (Landauer，W.，and L.C. Dunn. 1930. Studies on the Creeper fowl · I .Genetics J.Genet· 23:397-413.),该基因控制鸡的甸旬性状。
[0003] Cutler(Cutler，I.E.1925.Reptilian fowls.J.Hered. 16:352-356.)首先发表甸 旬性状受到杂合基因型影响的假设。Landauer和Dunn(Landauer，W.，and L.C.Dunn.l930.S化dies on 化Θ Creeper fowl.I.Genetics.J.Genet.23:397-413.)通过 杂交试验，发现一种引起软骨不正常发育的矮小型鸡，命名为甸旬鸡(化e邱er fowl),并证 实甸旬性状的遗传基础是由单个孟德尔显性基因 Cp控制，在显性纯合子(Cp/Cp)条件下表 现为致死型，杂合子(Cp/+)表现甸旬型，隐性纯合子(+/+)表现为野生型，整个鹏化早期死 亡率为25%，胚胎死亡时间集中在鹏化的第4天。
[0004] 遗传学研究表明，Cp基因与单冠或者玫瑰冠连锁(Xandauer，W· 1932.Studies on the creeper fowl.V.The linkage of the genes for creeper and single? comb .J.Genet.26:285-290.；Landauer,W.1933.Creeper and single-comb linkage in fowl.Nature 132:606.;Taylor，L.W.1934.Creeper and single-comb linkage in the fowl .J.Hered .25:205-206 JnSomes和Jr.将Cp基因定位于第I连锁群，与玫瑰冠基因（R)的 连锁距离为0 · 4cM，与尾脂腺分离基因（U)的连锁距离为30cM( Somes，R · G ·，and Jr.1973.Linkage relationships in domestic fowl.J.Hered.64:217-221.)。Imsland等 通过连锁分析和高密度SNP研究表明，7号染色体上7.4Mb的倒位引起MNR2基因位置发生改 变，该基因倒位导致玫瑰冠表型，进一步证实玫瑰冠基因（R)位于7号染色体上（Imsland， F.，C.Feng，H.Boije，B.Bed'hom，V.Fillon，B.Dorshorst，C.J.民ubin,民.Liu，Y.Gao，X.Gu, Y.Wang，D.Gourichon，M.C.Zody，W.Zecchin，A.Vieaud，M.Tixier-Boichard，X.Hu, F.Ha11book,N.Li,and L.Andersson .2012. The 民ose-comb mutation in chickens constitutes a structural rearrangement causing both altered comb morphology and defective sperm motility.PLoS Genet.8:e100 2775.)D兴义矮脚鸡是国内稀有的地 方矮脚鸡品种之一，由于具有特殊的甸旬体型，受到国内外专家高度的重视和关注。控制这 一性状的关键基因是Cp(Creeper)基因，该基因是一种常染色体显性纯合致死基因。国际上 对Cp基因的研究已有80多年历史（Cairns, J.Μ. ,and Κ.Gayer. 1943. Identification of chick embryos homozygous for the Creeper factor .J.Exp .Zool.92:229-242.; Landauer,W.1944. Length of survival of homozygous creeper fowl embryos. Science 100:553-554.;Dinner,B.1971.Chemical analysis of embryonic Creeper chicken tibia.J.Dent.Res.50:704.;Fujio,Y.,and T.Shibuya.1974.Expression of lethality caused by Creeper gene in the chicken. Japan. J.Genet.49:87-91.)，兴义、米易等国 内地方鸡种由于携带该基因，导致运些地方鸡品种的解化率和生长发育的整齐度受到严重 影响。所W，研究控制甸筒性状Cp基因的遗传规律，有助于对兴义矮脚鸡和我国其他地方鸡 品种资源进行保护、研究和开发利用。按照常规育种方法，对甸筒性状的选育主要根据腔长 的长短来决定，周期较长，费用多。另外，常规的检测Cp纯合致死胚胎与正常死亡胚胎的形 态学和细胞学方法取样操作复杂，分析测定周期长，自动化程度不高，检测不够准确。而利 用分子标记辅助选择进行分子育种不但可W进行直接选择，而且可W在早期选择，大大缩 短育种周期，提高育种的准确性，降低育种费用。
【发明内容】
[0005] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种用于鉴别鸡甸筒性状 的引物组合及其应用。
[0006] 为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
[0007] 第一方面，本发明提供了一种用于鉴别鸡甸筒性状的引物组合，所述引物组合包 括沈Q ID No. 1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和沈Q ID No.4所示的引物序列。
[000引所述引物组合是经过Primer Premier 6.0软件设计，在确保引物特异性、灵敏度 和扩增效率的前提下，经过多重PCR实验扩增得到所需的目的条带，PCR产物经过纯化、连接 转化和测序，在大群体中验证后筛选得到的。
[0009] 所述引物组合在开发分子检测试剂盒、家禽分子育种与地方品种鸡资源开发和利 用方面具有显著的优势，能够对鸡甸筒性状(Creeper)进行快速、准确、高效的筛选和鉴定， 操作简单、价格低廉。该引物组合特异性强、灵敏度高、成本低廉、简便快速，适用范围广。采 用多重PCR方法具有其独特的优势，一次反应可W筛查Ξ种不同基因型个体，并能够准备检 测甸筒基因序列的存在或缺失。该多重引物组合有助于对甸筒体型鸡W及我国地方鸡品种 资源进行保护、研究和开发利用。
[0010] 第二方面，本发明提供了所述的引物组合在鉴别鸡甸筒性状中的应用。
[0011] W及所述的引物组合在制备鉴别鸡甸筒性状的试剂或试剂盒中的应用。
[0012] W及所述的引物组合在鸡甸筒性状辅助育种中的应用。
[0013] 进一步地，所述应用具体为：
[0014] W待测个体的基因组DNA为模板，利用所述的引物组合，采用多重PCR方法进行分 析;如果多重PCR扩增有一种产物，且序列大小为224bp，则待测个体为甸筒基因显性纯合子 (Cp/Cp)，表现为致死型；如果多重PCR扩增有两种产物，序列大小分别为438bp和224bp，则 待测个体为甸筒基因杂合子(印/+)，表现为甸筒性状;如果多重PCR扩增只有一种产物，序 列大小为438bp，则待测个体为隐形纯合子(+/+)，表现为野生型。
[0015] 作为优选，本发明提供一个扩增效果最佳的多重PCR反应体系，具体为:基因组DNA 80-100ng，10 X PCR缓冲液（含Mg2+)2.0化，dNTPs (2.5mM) 2.0化，Taq DNA聚合酶（2.51]/化） 1.化1^，(161尸和(161巧|物（10皿〇1/1)各0.241，尸和巧|物（10皿〇1/1)各0.化1，用(1地20补充反 应体系至20.0化。
[0016] 作为优选，本发明提供一个扩增效果最佳的多重PCR反应条件，具体为:94°C预变 性5min;循环流程为94°C变性30s，57°C退火30s，72°C延伸35s，共35个循环;最后72°C延伸 10min，-20°C长期保存。
[0017] 第Ξ方面，本发明提供一种鉴别鸡甸筒性状的方法。所述方法是通过检测个体是 否缺失Cp基因部分序列和7号染色体11.896kb缺失上下游序列（chr 7 :21798705- 21810600)。
[001引所述的Cp基因的缺失检测W基因组DNA为模板，采用多重PCR(multiplex-PCR assay)方法进行分析。
[0019] 具体为：?待测个体的基因组DNA为模板，利用所述的引物组合，采用多重PCR方法 进行分析;如果多重PCR扩增有两种产物，序列大小分别为438bp和224bp，则待测个体为甸 筒基因杂合子(Cp/+)，表现为甸筒性状。
[0020] 优选的多重PCR反应体系及多重PCR反应条件同前文所述。
[0021] 本发明的有益效果在于：
[0022] 本发明提供了一种利用多重PCR方法，W鸡基因组DNA为模板，采用专用引物对进 行鸡甸筒性状鉴别的方法，建立了 Cp基因型检测的规范方法，有助于改善我国地方鸡品种 的解化率和生长发育的整齐度，为兴义矮脚鸡和我国其他地方鸡品种资源的保护、研究和 开发利用提供了重要参考。实验证明本方法可W通过检查Cp基因部分序列和7号染色体缺 失序列的上下游序列（11.89化b，chr 7:21798705-21810600)，对鸡群进行Cp基因型筛查， 从而可W准确、快速地对个体进行Cp基因分型，并可对鸡群进行早期选择，缩短选择时间， 节约育种成本。本发明为鸡甸筒性状Cp基因的筛查和育种工作开展分子标记辅助选择，提 供了一个更加准确、快速、高效、简单易行、价格低廉的分子遗传标记检测方法。利用本发明 提供的方法和专用引物对对鸡甸筒性状进行分子遗传标记辅助选择，可W提高选择的准确 性，并可进行早期选择，大大降低了育种费用，为甸筒性状鸡品种的育种提供便利，对地方 鸡品种保护及其开发利用具有重要的意义。本发明提供的检测方法操作简单、准确度高，测 试时间短，价格便宜，并可实现自动化、智能化检测。另外，可W根据本发明方法建立规范的 Cp基因型检测方法，并可开发检测试剂盒，用于筛查携带Cp基因的个体，为甸筒性状鸡的育 种工作提供便利，对地方鸡品种保护及其开发利用具有重要的意义。
【附图说明】
[0023] 图1为本发明Cp基因型检测引物设计示意图；其中，缺失序列（chr7:21798705- 21810600)，delF/delR用于扩增缺失序列上下游序列，扩增片段大小为224bp;F/R引物用于 扩增Cp基因部分基因序列，扩增片段大小为438bp。
[0024] 图2为本发明实施例1中多重PCR引物对筛选与鉴定的电泳图；其中，Μ为Marker (600bp);泳道泳道 1-12为delF2/R2-F2/R2引物组合的PCR产物；泳道 13-25为delFl/Rl-F2/ R2引物组合的PCR产物；泳道26-34为delFl/Rl-Fl/Rl引物组合的PCR产物；泳道35- 48delF3/R3-Fl/Rl引物组合的目的片段；泳道49-60为delF3/R3-F2/R2引物组合的PCR产 物。
[0025] 图3为本发明实施例2中多重PCR方法进行不同个体Cp基因分型的电泳图；其中，泳 道1 (M)为60化P的Marker;泳道2-6为纯合基因型个体(Cp/Cp);泳道7-11为杂合基因型个体 (Cp/+);泳道12-16为为隐性纯合基因型(+/+)个体。
【具体实施方式】