一种乳源革兰氏阳性菌的脉冲场凝胶电泳分型方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，特别设及一种乳源革兰氏阳性菌的脉冲场凝胶电泳分 型方法。
【背景技术】
[0002] 脉冲场凝胶电泳(PFGE，化Ised Field Gel Electrophoresis)是一种分离大分子 DNA的方法。在普通的凝胶电泳中，大的DNA分子(〉10化)移动速度接近，很难分离形成足W 区分的条带。在脉冲场凝胶电泳中，电场不断在两种方向（有一定夹角，而不是相反的两个 方向）变动。DNA分子带有负电荷，会朝正极移动。相对较小的分子在电场转换后可W较快转 变移动方向，而较大的分子在凝胶中转向较为困难。因此小分子向前移动的速度比大分子 快。脉冲场凝胶电泳可W用来分离大小从10化到10Mb的DNA分子。现今，PFGE作为一种基因 分型技术得到广泛的应用。目前，较多关于PFGE的应用集中在致病菌基因分型W及溯源方 面，而从已有的报道看出运些致病菌大多为革兰氏阴性菌，鲜有关于PFGE在革兰氏阳性菌 应用中的报道。
[0003] 革兰氏阳性菌大部分为耐热芽抱杆菌，运些耐热芽抱杆菌在食品尤其是乳制品生 产中会造成重大损失。主要在乳制品企业生产中表现在耐受传统的己氏杀菌(72°C/15s)， 有些甚至能耐受超高溫杀菌(UHT，140-145°C/2-5s)而存活下来，对生产加工甚至最终产品 有重要影响。例如，枯草芽抱杆菌对特殊菌体进行促芽抱和微胶囊包被处理，在抱子状态下 稳定性好，能耐氧化;耐挤压;耐高溫，能长期耐60°C高溫，在120°C溫度下能存活20分钟。
[0004] 目前，适合于革兰氏阴性菌的PFGE技术无法对革兰氏阳性菌进行准确的基因分 型，PFGE在乳源革兰氏阳性菌研究尚未有研究。因此，开展乳源革兰氏阳性菌PFGE研究应用 一方面能为运类菌进行基因分型；另一方面能进行溯源研究，控制耐热芽抱菌对生产加工 和广品影响，减少企业损失。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明提供了一种乳源革兰氏阳性菌的脉冲场凝胶电泳分型方法。该 脉冲场凝胶电泳分型方法可对乳源革兰氏阳性菌进行准确分型。
[0006] 为了实现上述发明目的，本发明提供W下技术方案：
[0007] 本发明提供了一种乳源革兰氏阳性菌的脉冲场凝胶电泳分型方法，包括如下步 骤：
[000引将乳源革兰氏阳性菌裂解、DNA酶切后，采用脉冲场凝胶电泳技术对DNA片段进行 分离，所述脉冲场凝胶电泳的初始转换时间为1.8~2.5s，终末转换时间为8~1 Os。
[0009] 在本发明提供的一些实施例中，脉冲场凝胶电泳技术的初始转换时间为2.2s，终 末转换时间为10s。
[0010] 作为优选，脉冲场凝胶电泳的梯度电压为5~7V/cm，电泳液溫度为12~16°C，电压 角度为100°~120°，初始电流为140~170mA。
[0011] 在本发明提供的一些实施例中，脉冲场凝胶电泳技术的梯度电压为6V/cm，电泳液 溫度为14°C，电压角度为120°，初始电流为170mA。
[0012] 作为优选，脉冲场凝胶电泳的运行时间为15~16h。
[0013] 在本发明提供的一些实施例中，脉冲场凝胶电泳运行时间为15h。
[0014] 作为优选，裂解采用的裂解液为细胞裂解液、蛋白酶K和溶菌酶的混合物。
[0015]作为优选，队吐/mg/mg计，细胞裂解液、蛋白酶K与溶菌酶的用量为5: (1~3): (7~ 9)。
[0016] 优选地，WmL/mg/mg计，细胞裂解液、蛋白酶K与溶菌酶的用量为5:2:8。
[0017] 作为优选，裂解采用的裂解液与乳源革兰氏阳性菌的菌悬液的体积比为（40~ 60):4，乳源革兰氏阳性菌的菌悬液的0D值为4~5。
[0018] 优选地，裂解采用的裂解液与乳源革兰氏阳性菌的体积比为51:4,乳源革兰氏阳 性菌的菌悬液的0D值为4~4.5。
[0019] 作为优选，裂解的溫度为50~55°C，时间为2~化，转速为50~70巧m。
[0020] 优选地，裂解的溫度为54°C，时间为地，转速为60巧m。
[0021] 作为优选，DM酶切采用的限制性内切酶为Xbal内切酶。
[0022] 在本发明提供的一些实施例中，DNA酶切的溫度为37°C，时间为2~地。
[0023] 作为优选，将乳源革兰氏阳性菌裂解之前还包括初步裂解的步骤，初步裂解采用 的裂解液为细胞裂解液、蛋白酶K和溶菌酶的混合物。
[0024] 作为优选，WmL/mg/mg计，初步裂解中，细胞裂解液、蛋白酶K与溶菌酶的用量为1: (4~6):(18~22)。
[002引优选地，WmL/mg/mg计，初步裂解中，细胞裂解液、蛋白酶K与溶菌酶的用量为1:5: 20 0
[0026] 作为优选，初步裂解中，裂解采用的裂解液与乳源革兰氏阳性菌的菌悬液的体积 比为(4~6): 4，乳源革兰氏阳性菌的菌悬液的0D值为4~5。
[0027] 优选地，初步裂解中，裂解采用的裂解液与乳源革兰氏阳性菌的体积比为5:4,乳 源革兰氏阳性菌的菌悬液的0D值为4.5。
[002引作为优选，初步裂解的溫度为36~38°C，时间为30~50min。
[0029] 优选地，初步裂解的溫度为37°C，时间为30min。
[0030] 在本发明提供的一些实施例中，乳源革兰氏阳性菌为枯草芽抱杆菌、苏云金芽抱 杆菌、地衣芽抱杆菌或蜡样芽抱杆菌中的一种或几种。
[0031] 在本发明提供的一些实施例中，乳源革兰氏阳性菌的脉冲场凝胶电泳分型方法包 括如下步骤：
[0032] 1、初步裂解：
[00削向400化乳源革兰氏阳性菌的菌悬液中加入:细胞裂解液、蛋白酶K、溶菌酶，W体 积:0的十，细胞裂解液、蛋白酶K、溶菌酶，用量分别为400μLν(4~5)、20μLν(4~5)、80μLν (4 ~5)，放入37°C水浴30min。
[0034] 2、制胶：
[0(X3日]配置1 % Seakem Go 1 d: 1 % SDS，微波溶解，放置在55 °C水浴中待用；将制得的胶与 菌液混合均匀，混合时避免气泡产生，凝固，得到胶块。
[0036] 3、裂解：
[0037] 混合裂解液制备:细胞裂解液、蛋白酶Κ、溶菌酶，W体积:OD计，细胞裂解液、蛋白 酶K、溶菌酶，用量分别为5mL/(4~5)、20μLν(4~5)、80μLν(4~5)。胶块裂解:将胶块与混合 裂解液混合，54 °C水浴4h，转速60巧m。
[0038] 4、胶块清洗：
[0039] 包括孤出0清洗、TE缓冲液清洗。
[0040] 5、胶块内DNA酶切：
[0041 ] 采用Xbal内切酶对胶块内DNA进行酶切，在37 °C水浴中解育2~4小时。
[0042] 6、电泳：
[0043] 配制l%SeaKem Gold(SKG)胶、加样、电泳；
[0044] 电泳条件设置:梯度电压为6V/cm，电泳液溫度为14°C，电压角度为120°，初始转换 时间为2.2s，终末转换时间为1 Os，初始电流为170mA，运行时间为15h。
[0045] 7、图像处理：
[0046] 电泳结束后，取出胶，染色，脱色，对电泳胶块进行拍照。
[0047] 在本发明提供的另一些实施例中，乳源革兰氏阳性菌的脉冲场凝胶电泳分型方法 包括如下步骤：
[004引 1、初步裂解：
[0049]向400化乳源革兰氏阳性菌的菌悬液中加入体积:〇的十，细胞裂解液、蛋白酶K、 溶菌酶，用量分别为400μ^ 4.5、20μL74.5、80μL74.5，放入 37 °C 水浴 30min。
[00加]2、制胶：
[0051 ] 配置1 % Seakem Go 1 d: 1 % SDS，微波溶解，放置在55 °C水浴中待用；将制得的胶与 菌液混合均匀，混合时避免气泡产生，凝固，得到胶块。
[0052] 3、裂解：
[0053] 混合裂解液制备：W体积:0D计，细胞裂解液、蛋白酶K、溶菌酶，用量分别为5mL/ 4.5、20yL/4.5、80yL/4.5;
[0054] 胶块裂解:将胶块与混合裂解液混合