抗cyfra21-1单克隆抗体产生的杂交瘤的制作方法
【专利说明】
【技术领域】
[0001]本发明涉及CYFRA21-1单克隆抗体产生的杂交瘤。
[0002]【背景知识】
[0003]细胞角蛋白是构成细胞骨架的主要成分之一，所有的细胞角蛋白都具有高度保守的alpha螺旋杆状区域、高度变异的氨基和梭基末端区域。根据细胞角蛋白分子量、等电点，通过双向凝胶电泳可将人类上皮细胞角蛋白分离出20个条带，分别命名为CKl?CK20。CK19是分子量约为40，OOODa的I类角蛋白(酸性蛋白)。广泛分布在正常组织表面，如层状或鳞状上皮中。在恶性上皮细胞中，激活的蛋白酶加速了细胞的降解，使得大量细胞角蛋白片段释放入血。细胞角蛋白片段21-1 (Cytokeratin Fragment 21-1，CYFRA21-1)是CK19的可溶性片段，CYFRA21-1作为上皮细胞角蛋白的成分之一，编码基因位于第17号染色体。正常情况下，CK19片段以寡聚体的形式存在，含量极低。广泛分布于正常组织表面如复层上皮和鳞状上皮以及单层上皮细胞如腺泡、汗腺、乳腺导管、气管、子宫内膜、结肠和肝细胞等，在正常情况下，细胞角蛋白19在外周血、骨髓、淋巴结中无表达或低表达，在恶性上皮肿瘤中激活的蛋白酶加速了细胞的降解，使得大量可溶性的细胞角蛋白19片段被释放，造成组织液、体液中可溶性的细胞角蛋白19片段的浓度升高。CYFRA21-1无明显的器官组织特异性，亦无肿瘤特异性。但是，上皮细胞癌变时，其血中含量会升高。CYFRA21-1目前临床上主要用做肿瘤标志物，对肺癌的诊断有较大意义，尤其对非小细胞肺癌(non-small celllung cancer，NSCLC)的诊断具有重要价值。另外，CYFRA21-1对其他肿瘤，如侵袭性膀胱癌、头颈部、乳腺、宫颈、消化道肿瘤均有一定的阳性率。不同的角蛋白片段表达具有组织分布的特异性，鳞癌和腺癌主要表达CK19，小细胞未分化癌则主要表达CK18，或仅有少量表达CK19。肺炎、肺结核、支气管炎、支气管哮喘、肺气肿等疾病一般不引起CYFRA21-1升高。良性肝病、肾衰竭可引起轻微升高，但很少超过10ng/mL。CYFRA21-1的血清水平与年龄、性另O、吸烟与否和妊娠等无关。CYFRA21-1含量的可作为用于癌症的辅助诊断检测、分期分型、治疗监测、预后评价及治疗后复发的早期发现等。
【
【发明内容】
】
[0004]本发明的目的在于提供一种抗CYFRA21-1单克隆抗体以及建立一种简单且具高灵敏度的检测CYFRA21-1含量的方法，该方法可应用于癌症的检测。以解决现有的单克隆抗体检测CYFRA21-1的灵敏度不够或价格昂贵，不适合临床大规模的应用的缺点。
[0005]本发明获得了能够产生特异性识别CYFRA21-1的单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株10-2与杂交瘤细胞株13-2，此2株细胞株分别在2015年7月17日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:C201596与CCTCC N0:C201597。此外，经过鉴定，两株单克隆抗体分别识别CYFRA21-1的两个不同表位，通过10-2与13-2的结合建立了双抗体夹心酶联免疫反应方法，其是一种高灵敏度及高通量的检测系统。
[0006]因此，本发明提供了下面所述的I至3的内容:
[0007]1.抗CYFRA21-1的杂交瘤细胞株，其保藏号分别为CCTCC NO:C201596和CCTCCNO:C201597o
[0008]2.抗CYFRA21-1的单克隆抗体，分别由保藏号为CCTCC NO:C201596和CCTCC NO:C201597的杂交瘤细胞系所分泌，所述单克隆抗体命名为10-2和13_2。
[0009]3.如权利要求2所述的抗CYFRA21-1单克隆抗体的应用，即利用所述的单克隆抗体的双抗体夹心法ELISA检测CYFRA21-1，夹心法两两配对的抗体来源于保藏号为CCTCCNO:C201596杂交瘤分泌的抗体10_2和保藏号为CCTCC NO:C201597杂交瘤分泌的抗体13-2，其步骤包括:
[0010](I)以所述的两两配对的单克隆抗体10-2包被；
[0011](2)加入待测样品孵育；
[0012](3)以所述的两两配对的HRP标记的另一株单克隆抗体13-2作为二抗，加入反应体系；
[0013](4)洗涤后加入酶反应底物，以450nm读取OD值；
[0014](5)结果表明检测的灵敏度很高。
【【附图说明】】
[0015]附图1显示的是本发明中的杂交瘤所产生的抗CYFRA21-1单克隆抗体在ELISA方法中滴度测量结果。
[0016]附图2显示的是标记HRP的抗CYFRA21-1单克隆抗体滴度测量结果。
[0017]附图3显示的是夹心法ELISA(S-ELISA)系统的检测灵敏度。
【【具体实施方式】】
[0018]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外，应理解，在阐述了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动和修改，这些等价形式同样是本申请中权利要求书中所限定的范围。
[0019]实施例1:动物免疫
[0020]选择与所用的骨髓瘤细胞同源的8周龄左右的雄性Balb/C健康小鼠，抗原是蛋白量为30ug的CYFRA21-1与弗氏完全佐剂、PBS混合，完全乳化后，30ug每只每次，采取背部多点，及腋下、腹股沟免疫。免疫程序:经15天后进行第二次相同剂量与弗氏不完全佐剂混合免疫；再15天后进行第三次相同剂量与福氏完全佐剂混合免疫；10天后尾部取血用间接ELISA方法测血清滴度，用相同剂量的纯抗原不加佐剂加强免疫；3天后取脾细胞进行融入口 ο
[0021]实施例2:杂交瘤细胞的构建
[0022]1、骨髓瘤细胞株的培养及制备
[0023](I)本发明采用的是SP2/0骨髓瘤细胞株，该细胞株生长及融合效率均佳，倍增时间为10-12小时。融合时选择处于对数生长期、细胞形态和活性佳的细胞。骨髓瘤细胞在融合前应先在培养基上作适应培养，使细胞生长到最佳的状态(即对数生长期)；
[0024](2)将培养的SP2/0吸至50mL的管中，离心，弃上清，悬起，加1mL的培养基，吸取少量10倍稀释计数。
[0025]2、脾细胞的制备
[0026](I)将小鼠放在密封袋中，充CO2待其窒息死亡；
[0027](2)将小鼠消毒固定在解剖板上，在超净工作台中取脾，放在12mL培养基的培养皿中，剥掉粘连组织，研磨脾脏，直至剩白色组织为止，吸管全部吸起，再缓慢打出使组织块粘连的管壁上，离心，弃上清，加1mL的红细胞裂解液裂解lOmin，再加20_25mL的培养基终止其反应，离心后，弃上清，加1mL的培养基，吸取少量10倍稀释计数。
[0028]3、细胞融合
[0029]加强免疫后3天做细胞融合。
[0030]细胞融合是杂交瘤技术的中心环节，基本步骤是取处于对数生长期的Sp2/0细胞与脾细胞1: 10混和，通过聚乙二醇(PEG)法以获得杂交瘤细胞，命名为10-2和13-2。所获得的杂交瘤细胞悬浮在含有饲养细胞的HAT培养基中，然后加入到96孔板中，在37°C，5% CO2的培养箱中封闭培养12天。
[0031]实施例3:单克隆抗体的制备及筛选
[0032]1、单克隆抗体的制备
[0033]从实施例2中所获得的杂交瘤细胞的孔格中回收培养基的上清液，选取在ELISA方法中与CYFRA21-1抗原反应的单克隆抗体。
[0034]2、单克隆抗体的筛选
[0035](I)将10uL浓度为0.5ug/mL的CYFRA21-1抗原到96孔板的每个孔格中，于4°C过夜后使其固定于固相；
[0036](2)用150uL浓度为I %的牛血清白蛋白进行封闭2小时；
[0037](3)将10uL杂交瘤细胞的培养基上清液加入到每个孔格中，于37°C反应2小时，然后加入稀释10000倍的辣根过氧化物酶偶联的羊抗鼠抗体于37°C反应I小时；
[0038](4)使用四甲基联苯胺微孔过氧化物酶底物(TMB)作为底物进行显色20min ;
[0039](5)添加50uL浓度为0.lmol/L的硫酸终止反应后，测量450nm的吸光度；
[0040](6)选出吸光度大约为3的10-2和13-2，并通过有限稀释法进行亚克隆。
[0041]3、单克隆抗体的大量制备及和纯化
[0042]将亚克隆后的细胞用细胞培养转瓶进行扩大培养，约20天后，收集上清，用葡萄球菌A蛋白(Protein A)进行亲和层析纯化。得到的单克隆抗体分别命名为10_2与13_2。
[0043]4、单克隆抗体效价的测定
[0044]所筛选出的2种mAb的效价通过ELISA方法来测定。分别加入10-2、13-2 (1ug/mL)，在反应后，使用辣根过氧化物酶偶联的抗-小鼠抗体与TMB进行显色，两种mAb效价达到10 9以上(附图1所示)。
[0045]实施例4:单克隆抗体的标记及滴度的测定
[0046]将纯化出得各抗体按常规方法进行HRP标记，标记好的单克隆抗体的滴度通过下面的方法测定，将浓度为0.5ug/mL的CYFRA21-1抗原固定在96孔微板上(10uL/孔)。使用1%的牛血清白蛋白进行封闭2小时，加标记的单克隆抗体(第一孔稀释100倍)，从第二孔开始做4倍稀释，于室温下反应2小时。添加TMB后，反应在室温下进行20分钟，用0.lmol/L的硫酸中止反应。测量在450nm的吸光度，按实施例3中的方式获得针对固定在固相中的抗原的滴度。结果表明具有有效的滴度(附图2所示)。
[0047]实施例5:双抗体夹心ELISA检测CYFRA21-1方法的建立
[0048](I)以所述的两两配对的单克隆抗体之一包被，0.5ug/mL的单克隆抗体以10uL/孔的量加到微孔板土，于4°C孵育24小时固定于固相；
[0049](2)孔格使用含有 0.1 % Tween 20 的 pH 值为 7.4 的 20mM PBS (PBST)，以 200uL/孔的量洗涤2次。以150uL/孔的量加入I %牛血清白蛋白进行封闭2小时；
[0050](3)孔格用PBST以200uL/孔的量洗涤4次，加入由起始浓度10ug/mL连续4倍稀释CYFRA21-1抗原，于室温温育2小时，然后加入HRP标记的另一株抗体(I: 10000 ；10uL/孔)并于室温温育2小时；
[0051](4)添加TMB后，反应在室温下进行20分钟，加入0.lmol/L的硫酸来终止反应并测量450nm的吸光度；
[0052](5)结果表明检测的灵敏度很高(附图3所示)。
【主权项】
1.抗CYFRA21-1的杂交瘤细胞株，其保藏号分别为CCTCCNO:C201596和CCTCC NO:C201597。2.抗CYFRA21-1的单克隆抗体，分别由保藏号为CCTCCNO:C201596和CCTCC NO:C201597的杂交瘤细胞系所分泌，所述单克隆抗体命名为10-2和13_2。3.如权利要求2所述的抗CYFRA21-1单克隆抗体的应用，即利用所述的单克隆抗体的双抗体夹心法ELISA检测CYFRA21-1，夹心法两两配对的抗体来源于保藏号为CCTCC NO:C201596杂交瘤分泌的抗体10-2和保藏号为CCTCC NO:C201597杂交瘤分泌的抗体13_2，其步骤包括: (1)以所述的两两配对的单克隆抗体10-2包被； (2)加入待测样品孵育； (3)以所述的两两配对的HRP标记的另一株单克隆抗体13-2作为二抗，加入反应体系; (4)洗涤后加入酶反应底物，以450nm读取OD值； (5)结果表明检测的灵敏度很高。
【专利摘要】抗CYFRA21-1单克隆抗体产生的杂交瘤的制备，属于免疫分析医学领域。本发明提供了一种特异性识别CYFRA21-1的单克隆抗体，产生该单克隆抗体的杂交瘤，以及使用该单克隆抗体检测CYFRA21-1的高灵敏度的方法。CCTCC NO：C20159620150717
【IPC分类】C12N5/20, G01N33/68, G01N33/577, C07K16/18, G01N33/574
【公开号】CN105132382
【申请号】CN201510454286
【发明人】刘云成, 赵洪梅, 张 杰, 侯杰, 卢亚波, 董小芳
【申请人】大庆麦伯康生物技术有限公司
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2015年7月25日