间皮素抗体和引起有效的抗肿瘤活性的方法
【专利说明】
[0001] 交叉引用相关申请
[0002] 本申请要求2012年9月27日提交的美国临时申请号61/706, 396的权益，在此整 体引入该申请的内容。
技术领域
[0003] 本公开涉及单克隆抗体，如特异于间皮素的单域的单克隆抗体。本公开进一步涉 及该抗体的使用，如用于癌症的诊断和治疗。
【背景技术】
[0004] 由于间皮素在恶性间皮瘤中高度表达（Chang等，Cancer Res 52 :181_186,1992 ; Chang和 Pastan，proc Natl Acad Sci USA 93:136_140，1996)以及在其它实体肿瘤，如胃 癌、鳞状细胞癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、胆管癌、乳腺癌和卵巢癌症中高度表达，因此间皮 素被认为是一个治疗靶点。（Hassan 等，Clin. Cancer Res. 10 :3937-3942, 2004 ;McGuire 等，N. Engl. J. Med. 334 :1-6,1996 ;Argani 等，Clin. Cancer Res. 7 :3862-3868,2001 ; Hassan 等，Appl. Immunohistochem. Mol. Morphol. 13 :243-247,2005 ;Li 等，Mol. Cancer Ther. 7 :286_296, 2008 ;Yu 等，J Cancer I : 141-1749, 2010 ;Tchou 等，Breast Cancer Res Treat 133(2) :799-804, 2012;美国专利号 7, 081，518)。
[0005] 间皮素（MSLN)基因编码~70kDa的前体蛋白，该蛋白被加工形成~30kDa N 端蛋白和~40kDa的C端膜结合成熟间皮素（Hassan和Ho, Eur J Cancer 44:46-53， 2008)。在过去近20年里，开发了许多抗间皮素的单克隆抗体（mAb)，包括SSlP免疫毒素 和M0RAb-009 (也称阿麦妥昔单抗（Amatuximab))，该抗体目前在进行针对于间皮瘤和其它 癌症的临床试验的评估（Hassan 和 Ho，Eur J Cancer 44 :46_53, 2008 ;Ho，Biodrugs 25 : 275-284,2011)。SSlP是重组的免疫毒素，由与截短的假单胞菌外毒素融合的小鼠的抗间 皮素 Fv 组成，其介导细胞杀伤（Pastan 和 Hassan，Nat Rev Cancer 6:559-565, 2006)。关 于SSlP的联合化疗的临床试验目前正在进行。基于小鼠 SSlFv的嵌合（鼠/人）抗体 M0RAb-009在具有间皮素的肿瘤细胞上引起抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用（ADCC) (Hassan 等，Cancer Immure 7:20, 2007)。
[0006] 最近美国国家癌症研宄所（NCI)的研宄人员制备了两个完全人源的识别间皮素 的单克隆抗体（m912 和 HN1) (Feng 等，Mol Cancer Ther 8 :1113-1118, 2009 ;Ho 等，Int J Cancer 128 :2020-2030, 2011)。自噬菌体展示库分离HNl人源Fv，并且生成完全人源化 IgG。通过将HNl Fv融合到截短的假单胞菌外毒素 A(PE38)而产生HNl的免疫毒素 （Ho 等，Int J Cancer 128:2020-2030,2011)。HNl的IgG结合于与细胞表面相关联的间皮素 并且通过非常强的ADCC来对肿瘤细胞进行杀伤。HNl人源抗体识别重叠间皮素中的SSl 位点的构象表位，其表明HNl可以开发成基于SSl的单克隆抗体的完全人源化版本（如 M0RAb-009)。虽然已知的许多间皮素单克隆抗体都是可用的，但是没有一个可以展现出针 对于肿瘤细胞的补体依赖性细胞毒性（CDC)。因此，目前靶向间皮素的治疗由于缺乏具有强 效的CDC的抗间皮素的单克隆抗体而被阻碍。
[0007] ⑶C是治疗性抗体的重要的细胞杀伤机制（Weiner等，Nat Rev Immunol 10 : 317-327, 2010)。第一个被批准的癌症治疗的单克隆抗体，利妥昔单抗，对于其抗肿瘤活 性，部分依赖于CD C。在临床前的研宄中，它的抗肿瘤活性在CI q缺失的小鼠中完全丧 失（abolished) (Di Gaetano 等，J Tmmunol 171 :1581-1587, 2003)。在 B 细胞淋巴瘤的 异种移植模型中补体的耗尽也降低其活性（Cragg和Glennie，Blood 103:2738-2743， 2004)。目前认为当结合于位点的抗体靠近细胞膜时CDC才可能发生（Pawluczkowycz等， J Immunol 183 :749_758, 2009)。作为这一解释的依据，奥法木单抗（ofatumumab)，其比利 妥昔抗体更靠近细胞膜进行结合，而其⑶C的活性也更高（Pawluczkowycz等，J Immunol 183 :749-758, 2009)。几乎所有现有的间皮素单克隆抗体和免疫毒素（包括HNl和SSlP/ M0RAb-009)识别I区域，细胞表面的间皮素的N末端被推测为远离细胞膜（Kaneko等，J Biol Chem 284:3739-3749,2009)。
【发明内容】
[0008] 本发明公开了间皮素特异性人源单域（VH)抗体（简称为SDl和SD2)。SDl抗体结 合在人的间皮素的C末端的构象表位，并且对于表达间皮素的肿瘤细胞展现出很强的CDC 活性以及ADCC。SD2特异于全长的人的间皮素，但不能结合间皮素的C末端间皮素肽。
[0009] 本发明提供的是包含SDl或SD2的一个或者多个（诸如所有的三个）⑶R的单克 隆抗体。本发明提供的抗体包括免疫球蛋白分子，例如IgG抗体，以及抗体片段和单域（VH) 抗体。进一步提供组合物，所述组合物包含结合（例如特异性结合）于间皮素的抗体、编码 这些抗体的核酸分子、包括所述核酸分子的表达载体、以及表达所述核酸分子的分离的宿 主细胞。本发明还提供了免疫偶联物，所述免疫偶联物包含本文所公开的抗体和效应分子 (例如毒素）。也提供了包含所述抗体的融合蛋白，例如包含人的Fc的融合蛋白。
[0010] 在此提供的抗体和组合物可用于各种目的，例如用于确定表达间皮素的癌症的 诊断，所述癌症诸如为间皮瘤、前列腺癌、肺癌、胃癌、鳞状细胞癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌 (如三阴性乳腺癌）或卵巢癌。因此，在此提供了在受试对象中确定癌症的诊断的方法，所 述确定癌症的诊断通过使来自于被诊断为癌症的受试对象的样本与结合间皮素的单克隆 抗体进行接触，并检测所述样本与所述抗体的结合来进行。根据所述抗体与所述样本的结 合相对于所述所述抗体与对照样本的结合的增加来确定癌症的诊断。在一些实施方案中， 该方法进一步的包括使特异性识别所述特异性间皮素抗体的第二抗体与所述样本接触，以 及检测所述第二抗体的结合。
[0011] 同样地，在此提供了在受试对象中检测表达间皮素的癌症的方法。这一方法包括 使来自于受试对象的样本与本文所描述的单克隆抗体接触，以及检测所述抗体与所述样本 的结合。所述抗体与所述样本的结合相对对照样本的增加检测受试对象的癌症。在一些实 施方案中，该方法可以进一步包括使特异性识别所述特异性间皮素抗体的第二抗体与所述 样本接触，以及检测所述第二抗体的结合。
[0012] 本发明进一步提供对于具有表达间皮素的癌症的受试对象的治疗方法，所述癌症 例如为间皮瘤、前列腺癌、肺癌、胃癌、鳞状细胞癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌（如三阴性乳腺 癌）或卵巢癌，该方法通过以下来进行：选定患有表达间皮素的癌症的受试对象，并向受试 对象施用治疗有效量的间皮素特异性单克隆抗体或者包含所述抗体的免疫偶联物、融合蛋 白或组合物。
[0013] 本发明还提供了在受试对象中抑制肿瘤生长和抑制表达间皮素的癌症的转移的 方法，该方法通过选定患有表达间皮素的癌症的受试对象，并向该受试对象施用治疗有效 量的本文所公开的抗体、免疫偶联物、融合蛋白或组合物。
[0014] 通过下面参考附图的详细描述，本发明上述的和其它的目标、特征以及优点将变 得更加清晰。
【附图说明】
[0015] 图1A-1D :对应间皮素 C末端的人单域抗体的生成。（图1A)用于通过噬菌体展 示技术筛选人源抗体的肽的设计。提出了在膜结合间皮素中的三个功能区区：296-390 ; II区：391-486 ;111区487-598 (SEQ ID NO :9)。指示在细胞表面间皮素上的三个预测的N 连接聚糖（Asn388、Asn488和Asn515)。用于目前研宄的肽含有在间皮素 C末端的50个残 基（SEQ ID NO :9的残基539-588)。（图1B)工程化的人源抗体结构域（VH)噬菌体展示 库用于针对C末端间皮素肽（残基539-588)的四轮噬菌体筛选。（图1C)单克隆噬菌体 ELISA试验在第四轮筛选结束时被执行。选择SDl噬菌体克隆（克隆1)用于进一步分析， 因为其对全长间皮素和C末端多肽两者均以强的信号进行结合。（图1D)采用两个所选的 抗体噬菌体克隆（SD1和SD2)执行单克隆噬菌体ELISA试验。SDl克隆既结合全长人间皮 素（MSLN)又结合所述间皮素肽。而SD2克隆仅结合MSLN，不结合所述肽。
[0016] 图2A-2B :SD1人源SDl Fc融合蛋白的制备和分析。（图2A)非还原和还原条件下 的纯化的SDl-hFC蛋白（每一泳道4 μ g蛋白）的SDS-PAGE分析。SDl-hFc蛋白的纯度大 于95%。NR:非还原；R:还原。（图2B)A431/H9(在表皮样癌A431细胞系中的间皮素的强 制表达）（Ho 等，Clin Cancer Res 11 :3814-3820,2005)、NCI-H226(间皮瘤）和 KMBC(胆 管癌）的细胞提取物中的内源性间皮素蛋白的免疫沉淀。SDl被用于免疫沉淀细胞裂解物 中的内源性间皮素蛋白。C :无关的VH单域人源Fc融合体（fusion) ;IP :免疫沉淀；输入： 免疫沉淀之前的全细胞裂解物上的蛋白质印迹。
[0017] 图3A-3D :SDl-hFc的结合特性。（图3A)直接ELISA。SDl-hFc与全长的人间皮 素蛋白（MSLN)和肽结合，但不结合小鼠的间皮素（mMSLN)或BSA。（图3B)竞争性ELISA。 间皮素肽而不是SS1P、HN1或者含有50个残基的无关肽，和人的间皮素蛋白竞争与SDl-hFc 结合。（图3C)关于人的间皮素蛋白，SDl-hFc解离平衡Kd是13. 58nM，而对于所述肽是 16. 08nM (图 3D)。
[0018] 图4 :对表达间皮素的癌细胞和对照癌细胞上的SDl-hFc蛋白的流式细胞术分析。 SDl-hFc结合于稳定的间皮素 cDNA转染的A431/H9细胞系上，不结合A431细胞系。所述抗 体也结合目前研宄中所测试的四分之三的人类癌症细胞系。0VCAR8 :卵巢癌；NCI-H226 :间 皮瘤；EKVX 和 L55 :NSCLC ;KMBC，Mz-ChA-I 和 HuCCTl :胆管癌。
[0019] 图5A-5H :对表达间皮素的癌细胞，SDl-hFc引发CDC和ADCC。（图5A，5B)CDC检 测试验。在作为补体来源的正常的人血清（NHS，20% v/v)的存在下，将A431/H9(图5A)和 NCI-H226(图5B)细胞与增加的浓度的SDl-hFc -起培养（incubated)。在SDl-hFC存在 下，补体蛋白Clq结合H9(图5C)和NCI-H226(图5D)细胞，而在HNl或对照hFc融合蛋白 存在的条件下不结合。（图5E-5H)ADCC检测试验。在增加浓度的SDl-hFc的存在下，刚分 离的外周血单核细胞（PBMC)以50 : 1的比例与靶细胞A431/H9(图5E)或NCI-H226(图 5F)细胞一起进行培养。以不同的E : T比，将纯化的人的NK细胞与靶细胞A431/H9(图 5G)或NCI-H226 (图5H)，与50 μ g/ml SDl-hFc -起进行培养。通过LDH检测确定CDC和 ADCC 活性（*:p < 0· 05)。
[0020] 图6A-6D :SDl-hFc对肿瘤生长具有强抗肿瘤作用。（图6A)将A431/H9细胞接 种在裸鼠胁腹以形成大约7〇mm3大小的肿瘤。从第7天起，每隔一天用SDl-hFc (50mg/kg) 或者PBS处理小鼠。向下的箭头表示注射的日子。在第7-20天计算每一处理组的平均肿 瘤尺寸（％P < 0. 05)。（图6B)在作为小鼠补体的来源的正常小鼠血清（30% v/v)的存 在下，将A431/H9细胞与100 μ g/mL SDl-hFc -起培养。通过LDH检测测定⑶C活性（％p < 0. 05)。（图6C)在作为小鼠效应细胞的来源的纯化的小鼠 NK细胞的存在下，将A431/H9 细胞与100 μ g/mL SDl-hFc -起培养。通过LDH检测测定小鼠 ADCC活性（*:p < 0. 05)。 (图6D)鼠 NK细胞的纯度。
[0021] 图7Α-7Β :基于SDl的重组免疫毒素的制备和分析。（图7Α)在非还原条件下的纯 化的SD1-PE38(每一泳道4yg蛋白）的SDS-PAGE分析。SD1-PE38的纯度大于95%。IT :免 疫毒素。（图7B)利用WST-8检测以SD1-PE38免疫毒素处理后的A431/H9、A431、NCI-H226 和KMBC细胞。
[0022] 序列表
[0023] 通过使用标准字母缩写表示核苷酸碱基，以及使用三字母代码表示氨基酸，而示 出列于所附的序列表中的核酸和氨基酸序列，如37C.F.R. 1.822中定义。每个核酸序列只 有一条链被表示，而互补链被理解为通过任意参照所显示的链而被包括。序列表以2013年 9月11日创建的、大小26. 7KB的ASCII文本文件的形式提交，在此通过参考引入该文本。 在所附序列表中：
[0024] SEQ ID NO :1是SDl单域抗体的核苷酸序列。
[0025] SEQ ID NO :2是SDl单域抗体的氨基酸序列。
[0026] SEQ ID NO :3是假单胞菌外毒素（PE)的氨基酸序列。
[0027] SEQ ID NO :4是PE38的氨基酸序列。
[0028] SEQ ID NO :5是PE-LR的氨基酸序列。
[0029] SEQ ID NO :6 是 PE-LR/6X 的氨基酸序列。
[0030] SEQ ID NO :7是具有降低的免疫原性的PE的氨基酸序列。
[0031] SEQ ID NO :8 是 PE-LR/8M 的氨基酸序列。
[0032] SEQ ID NO :9是人的间皮素的氨基酸序列。
[0033] SEQ ID NOs :10-13 是引物序列。
[0034] SEQ ID NO : 14是SD2单域抗体的核苷酸序列。
[0035] SEQ ID NO : 15是SD2单域抗体的氨基酸序列。
【具体实施方式】
[0036] I.缩写
[0037] ADCC抗体依赖的细胞介导的细胞毒性
[0038] CAR嵌合抗原受体
[0039] ⑶C补体依赖的细胞毒性
[0040] cDNA 互补的 DNA
[0041] ⑶R互补决定区
[0042] CTL细胞毒性T淋巴细胞
[0043] ELISA酶联免疫吸附试验
[0044] EM效应分子
[0045] FACS荧光激活细胞分选
[0046] GPI糖基化磷脂酰肌醇
[0047] hFc 人的 Fc
[0048] HRP辣根过氧化物酶
[0049] Ig免疫球蛋白
[0050] i. V.静脉注射
[0051] Kd解离常数
[0052] LDH乳酸脱氢酶
[0053] mAb单克隆抗体
[0054] MAC膜攻击复合物
[0055] mMSLN小鼠间皮素
[0056] MSLN 间皮素
[0057] NHS正常人血清
[0058] PBMC外周血单核细胞
[0059] PCR聚合酶链式反应 [0060] PE假单胞菌外毒素
[0061] PE藻红蛋白
[0062] pfu空斑形成单位
[0063] RIPA放射免疫沉淀试验
[0064] VH可变重
[0065] VL可变轻
[0066] II.术语和方法
[0067] 除非另有说明，技术术语以常规用法使用。分子生物学中常用术语的定义可以 在以下中找到：Benjamin Lewin，Genes V，Oxford University Press 出版，1994(ISBN 0-19-854287-9) ;Kendrew等（编），The Encyclopedia of Molecular Biology，Blackwell Science Ltd.出版，1994 (ISBN 0-632-02182-9);和 Robert A. Meyers(编），Molecular Biology and Biotechnology ：a Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc. 出版，1995 (ISBN 1-56081-569-8)。
[0068] 为便于理解本公开的各实施方案，下面提供了对特定术语的解释：
[0069] 抗体：包含至少轻链或重链免疫球蛋白的可变区的多肽配体，其识别和结合（如 特异地识别和特异性结合）抗原表位，如间皮素、或其片段。免疫球蛋白分子由重链和轻链 组成，其中所述重链和轻链各自具有可变区，所述可变区称为可变重（Vh)区和可变轻（') 区。Vh区和I区两者一起负责结合抗体所识别的抗原。
[0070] 抗体包括完整的免疫球蛋白以及本领域公知的抗体的变体和部分，如单域抗体 (例如VH结构域抗体）、Fab片段、Fab'片段、F(ab)' 2片段、单链Fv蛋白（"scFv"）、和 二硫化物稳定的Fv蛋白（"dsFv"）。scFv蛋白是融合蛋白，其中免疫球蛋白的轻链可变 区和免疫球蛋白的重链可变区通过连接基团而结合，而在dsFvs中，这些链发生了突变，并 引入二硫键来稳定链的结合（association)。术语"抗体"还包括基因工程形式如嵌合抗 体（例如，人源化鼠抗体）和异源偶联抗体（如双特异性抗体）。也参见Pierce Catalog and Handbook，1994-1995(Pierce Chemical Co. , Rockford,IL) ；Kuby,J. , Immunology,3rd Ed.，W. H. Freeman&Co.，New York，1997。
[0071] 通常情况下，天然存在的免疫球蛋白具有通过二硫键而相互连接的重（H)链和轻 (L)链。有两种类型的轻链，Lambda(A)和KappaO )。主要有五个确定抗体分子的功能 活性的重链类（或同种型）：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE
[0072] 每个重链和轻链包含恒定区和可变区，（该区也被称为"域")。在组合中，重链和轻 链可变区特异性结合抗原。轻、重链可变区包含被三个高变区间隔开的"骨架（framework) " 区域，所述高变区也被称为"互补决定区"或"CDR"。根据Kabat等（见Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest, U. S. Department of Health andHuman Services，1991)和 ImMunoGeneTics 数据库（IMGT)(见 Lefranc，Nucleic Acids Res 29 : 207-9, 2001)限定骨架区和⑶R的范围。IMGT和Kabat数据库可在线使用。不同的轻链或 重链骨架区的序列在物种内（比如人类）是相对保守的。抗体的骨架区，即组成的轻链和 重链的结合骨架区，用于在三维空间定位和对齐CDR。
[0073] ⑶R主要负责结合抗原表位。每个链的⑶R通常被称为⑶R1、⑶R2和⑶R3,从 N-末端开始顺序编号，并且通常由特定⑶R所位于的链来识别。因此，Vh OTR3 (或H-⑶R3) 是位于其所被发现的抗体的重链的可变域，而'CDRl (或L-CDR1)则是来自其所被发现的 抗体的轻链的可变域。以结合间皮素的抗体为例，其具有特异性Vh区和V l区序列，并因此 具有特异性的CDR序列。具有不同的特异性（即，对不同抗原的不同结合位点）的抗体有 不同的CDR。虽然不同的抗体，其CDR是不同的，但在CDR内仅有有限数目的氨基酸位置直 接参与抗原结合。CDR内的这些位置被称为特异性决定残基（SDR)。
[0074] 引用"VH"或"VH"指的是免疫球蛋白的重链（包括Fv、scFv、dsFv或Fab的重链） 的可变区。引用"八"或"VL"指的是免疫球蛋白的轻链（包括Fv、scFv、dsFv或Fab的轻 链）的可变区。
[0075] "单克隆抗体"是由B淋巴细胞的单一克隆或由单一抗体的轻链和/或重链基因所 转染到的细胞所产生的抗体。单克隆抗体通过本领域技术人员已知的方法来制备，例如通 过制备来自骨髓瘤细胞与免疫脾细胞的融合的杂交抗体形成细胞来制备。单克隆抗体包括 人源化单克隆抗体。
[0076] "嵌合抗体"包含来自两种或多于两种的不同抗体分子的结构元素，所述不同的抗 体分子通常来源于不同动物物种。例如，嵌合抗体可以具有来自于一种物种（比如人类） 的骨架残基，以及来自其它物种（如特异性结合间皮素的小鼠抗体）的CDR(其通常赋予抗 原结合性）。
[0077] "人"的抗体（也被称为"全人源"抗体）包括人骨架区和来自于人的免疫球蛋白 的所有的CDR。在一个实例中，所述骨架区和CDR来自相同起源的人重链和/或轻链的氨基 酸序列。然而，来自于一个人抗体的骨架可以被设计成含有来自不同的人抗体的CDR。"人 源化"的免疫球蛋白是含有人骨架区和一个或多个来自于非人（例如，小鼠、兔、大鼠、或合 成的）免疫球蛋白的CDR的免疫球蛋白。提供CDR的非人类免疫球蛋白被称为"供体"，而 提供骨架的人的免疫球蛋白被称为"受体"。在一个实施例中，在人源化的免疫球蛋白中， 全部CDR是来自于供体免疫球蛋白。恒定区无需存在，但如果它们存在，它们必须与人免疫 球蛋白恒定区基本相同，即，至少约85-90 %，如95 %或更多是相