具有抗肿瘤活性的人源化抗体的制作方法

专利名称：具有抗肿瘤活性的人源化抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有有效的抗肿瘤活性的人源化抗体。特别地，该人源化抗体特异性地结合并直接杀灭人结肠肿瘤细胞，并且在抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)试验中呈现出有效的免疫介导的抗人结肠癌细胞的细胞毒性活性。此外，本发明涉及这些人源化抗体在治疗和诊断中的用途。
背景技术：
碳水化合物结构可能是肿瘤特异性的或肿瘤相关的抗原，并且因此是许多产生抗体免疫策略的焦点。然而，产生抗碳水化合物特异性抗体是一项具有挑战性的任务，因为它们缺乏特异性、亲和性或只是IgM类的(Christensen等，2009)。此外，产生具有杀灭癌细胞能力的人源化抗碳水化合物抗体是一项具有挑战性的任务，从很少量的关于这些抗体的报道中反映出这一事实。只存在一个已经成功人源化的抗糖脂抗体的实例；该抗体在体外和体内识别神经节苷脂GM2并杀灭人肿瘤细胞(US专利6，423，511和6，872，392)。尽管没有人源化，但存在另两个已经工程化用于人类给药的碳水化合物结合抗体的实例。第一种，抗碳水化合物抗体RAV-12是在体外和体内显示出对抗人结肠癌细胞功效的嵌合鼠-人 IgG1 (Loo等，2007)。第二种，抗碳水化合物抗体HMMC-I已经在体外显示出对抗人卵巢癌的功效。HMMC-I是通过转染色体(transchromosomal)KM小鼠产生的完全人抗体(Nozawa等， 2004)。国际专利申请No.W02005/108430公开了称为SC104的抗癌小鼠单克隆抗体。 在此将该申请的公开内容引入作为参考。SC104结合的抗原的确切性质尚不清楚，但 W02005/108430表明了抗原是sialyltetraosyl碳水化合物。还公开了 SC104能够直接诱导细胞死亡，而不需要免疫效应细胞。

发明内容
在第一个方面中，本发明提供了 Vh抗体结合结构域，该结合结构域顺次包含第一个框架区(FRl)、第一个CDR(CDRl)、第二个框架区(FR2)、第二个CDR(CDR2)、第三个框架区 (FR3)、第三个CDR(CDRiB)和第四个框架区(FR4)，其中FRl 的序列是 XJQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVXfYSiy^SEQ ID NO 卯)，其中& 是 Q 或 E& 是 S 或 T
& 是 I、L或 V)(4是3 或T或与其至少90%或至少95%相似的序列，优选与其至少90%或至少95%相同的序列，CDRl的序列是SGYSWH(SEQ ID NO 96)或与其至少80%相似的序列，优选与其至少80%相同的序列，FR2 的序列是 WIRQ)(5PGKGLX6WX7G (SEQ ID NO :97)，其中X5 是 S 或 P& 是 Q 或EX7 是 M 或 I或与其至少90%相似的序列，优选至少与其90%相同的序列，CDR2 的序列是 HlHX8SGRPirX9PSDC1c1S (SEQ ID NO :98)，其中& 是 F、Y 或 WX9 是 N 或 DXltl 是 K、L、H、F、R 或 S或与其至少90%相似的序列，优选至少与其90%相同的序列，FR3 的序列是 RXn)(12ISX13)(14TAKNQFSLKLTSMTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO :99)，其中X11 是 V 或 IX12 是 T 或 SX13 是 R 或 KX14 是 E 或 D或与其至少90%或至少95%相似的序列，优选至少与其90%或至少95%相同的序列，附带条件是位置6的残基必须是R或K，CDR3的序列是KGKGSDDGLNY (SEQ ID NO 100)，或与其至少90 %相似的序列，优选与其至少90%相同的序列，FR4的序列是WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO 101)，或与其至少90%相似的序列，优选与其至少90%相同的序列。在第二个方面中，本发明提供了 Vh抗体结合结构域，该结合结构域包含框架序列以及位于框架序列内的第一个、第二个和第三个⑶R，其中框架区的序列与序列QVQLQESGP GLVKPSETLSLTCTVSGYSX3SffIRQPPGKGLQffIGRVTISX13ETAKNQFSLKLTSMTAADTAVYYCARffGQGTLVT VSS(SEQ ID NO :102)至少90%相同，优选至少95%相同；其中)(3是I、L或V，并且)(13是1 或K ；并且CDRl的序列是SGYSWH (SEQ ID NO :96)，或与其至少80%相似的序列，优选与其至少80%相同的序列；CDR2 的序列是 HlHX8SGRPirX9PSDC1c1S (SEQ ID NO :98)，其中& 是 F、Y 或 WX9 是 N 或 DX1。是 K、L、H、F、R 或 S或与其至少90%相似的序列，优选与其至少90%相同的序列；
CDR3的序列是KGKGSDDGLNY (SEQ ID NO 100)，或与其至少90 %相似的序列，优选与其至少90%相同的序列。在第三个方面中，本发明提供了 \抗体结合结构域，该结合结构域顺次包含第一个框架区(FRl)、第一个CDR(CDRl)、第二个框架区(FR2)、第二个CDR(CDR2)、第三个框架区 (FR3)、第三个CDR(CDRiB)和第四个框架区(FR4)，其中FRl 的序列是 EX15VLTQSPGTLSLSX16GERATLSC(SEQ ID NO :187)其中，X15 是 I 或 NX16 是 A 或 P或与其至少90%或至少95%相似的序列，优选与其至少90%或至少95%相同的序列，CDRl的序列是SASSSLSYIH(SEQ ID NO 188)，或与其至少90%相似的序列，优选与其至少90%相同的序列，FR2的序列是WYQQKPGQAPRLLIY(SEQ ID NO :189)，或与其至少90%相似的序列， 优选与其至少90%相同的序列，CDR2的序列是DTSNLAS (SEQ ID NO :190)，或与其至少80%相似的序列，优选与其至少80%相同的序列，FR3 的序列是 GIPDRFSGSGSG)(17DFTLTISRVEPEDFAVYYC (SEQ ID NO 191)，其中，X17 是 T 或 N或与其至少90%或至少95%相似的序列，优选与其至少90%或至少95%相同的序列，CDR3的序列是FQGSEYPLT(SEQ ID NO :192)，或与其至少80%相似的序列，优选与其至少80%相同的序列，FR4的序列是reQGTKLEIKR(SEQ ID NO 193)，或与其至少90%相似的序列，优选与其至少90%相同的序列。在第四个方面中，本发明提供了 \抗体结合结构域，该结合结构域包含框架序列以及位于框架序列内的第一个、第二个和第三个⑶R，其中框架区的序列与序列EIVLTQSPG TLSLSPGERATLSCWYQQKPGQAPRLLIYGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRVEPEDFAVYYCFGQGTKLEIKR(SEQ ID NO 194)至少90%相同，优选至少95%相同，并且CDRl的序列是SASSSLSYIH(SEQ ID NO :188)，或与其至少90%相似的序列， 优选与其至少90%相同的序列；CDR2的序列是DTSNLAS (SEQ ID NO :190)，或与其至少80%相似的序列，优选与其至少80%相同的序列；CDR3的序列是FQGSEYPLT(SEQ ID NO :192)，或与其至少80%相似的序列，优选与其至少80%相同的序列。在第五个方面中，本发明提供了 Vh抗体结合结构域，该结合结构域顺次包含第一个框架区(FRl)、第一个CDR(CDRl)、第二个框架区(FR2)、第二个CDR(CDR2)、第三个框架区 (FR3)、第三个CDR(CDRiB)和第四个框架区(FR4)，其中FRl 的序列是 EVQU!QWGAGLLKPSETLSLTCAVYGYSXw)(19(SEQ ID NO :201)，其中
父18是1、1^或 VX19 是 S 或 T或与其至少90%或至少95%相似的序列，优选与其至少90%或至少95%相同的序列，CDRl的序列是SGYSWH(SEQ ID NO :96)，或与其至少80%相似的序列，优选与其至少80%相同的序列，FR2 的序列是 WIRQPPGKGLEWX2CIG(SEQ ID NO :202)，其中是 M 或 I或与其至少90%相似的序列，优选与其至少90%相同的序列，CDR2 的序列是 HIHX21SGRPTY)(22PSIJ(23S(SEQ ID NO :98)，其中X21 是 F、Y 或 W是 N 或 D&3是1(、1^、!1、卩、1 或 S或与其至少90%相似的序列，优选与其至少90%相同的序列，FR3 的序列是 RX2J25IS)(26DTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO :203)，其中Xm 是 V 或 IXm 是 S 或 TXai 是 R 或 K或与其至少90%或至少95%相似的序列，优选与其至少90%或至少95%相同的序列，前提条件是位置6的残基必须是R或K，CDR3的序列是KGKGSDDGLNY (SEQ ID NO 100)，或与其至少90 %相似的序列，优选与其至少90%相同的序列，FR4的序列是WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO 101)，或与其至少90%相似的序列，优选与其至少90%相同的序列。在第六个方面中，本发明提供了 Vh抗体结合结构域，该结合结构域包含框架序列以及位于框架序列内的第一个、第二个和第三个CDR，其中框架区的序列与序列EVQLQQWGA gllkpsetlsltcavygysx18swirqppgkglewigrvtisx26dtsknqfslklssvtaadtavyycarwgqgtlvt
VSS(SEQ ID NO :204)至少90%相同，优选至少95%相同，其中&8是I、L或V，而&6是1 或K，并且CDRl的序列是SGYSWH (SEQ ID NO :96)，或与其至少80%相似的序列，优选与其至少80%相同的序列；CDR2 的序列是 HIHX21SGRPTY)(22PSIJ(23S(SEQ ID NO :98)，其中)(21 是 F、Y 或 W是 N 或 DX23 是 K、L、H、F、R 或 S或与其至少90%相似的序列，优选与其至少90%相同的序列；和CDR3的序列是KGKGSDDGLNY (SEQ ID NO 10)，或与其至少90%相似的序列，优选与其至少90%相同的序列。在第七个方面中，本发明提供了 \抗体结合结构域，该结合结构域顺次包含第一个框架区(FRl)、第一个CDR(CDRl)、第二个框架区(FR2)、第二个CDR(CDR2)、第三个框架区 (FR3)、第三个CDR(CDR3)和第四个框架区(FR4)，其中FRl 的序列是 EX27VLTQSPATLSLSPGERATLSC(SEQ ID NO :211)，其中，X27 是 I 或 N或与其至少90%或至少95%相似的序列，优选与其至少90%或至少95%相同的序列，CDRl的序列是SASSSLSYIH(SEQ ID NO 188)，或与其至少90%相似的序列，优选与其至少90%相同的序列，FR2的序列是WYQQKPGQAPRLLIY(SEQ ID NO :189)，或与其至少90%相似的序列， 优选与其至少90%相同的序列，CDR2的序列是DTSNLAS (SEQ ID NO :190)，或与其至少80%相似的序列，优选与其至少90%相同的序列，FR3 的序列是 GIPDRFSGSGSG)(28DFTLTISRLEPEDFAVYYC(SEQ ID NO :212)，其中是 T 或 N或与其至少90%或至少95%相似的序列，优选与其至少90%或至少95%相同的序列，CDR3的序列是FQGSEYPLT(SEQ ID NO :192)，或与其至少80%相似的序列，优选与其至少80%相同的序列，FR4的序列是FGGGTKVEIKR(SEQ ID NO 193)，或与其至少90%相似的序列，优选与其至少90%相同的序列。在第八个方面中，本发明提供了 \抗体结合结构域，该结合结构域包含框架序列以及位于框架序列内的第一个、第二个和第三个⑶R，其中框架区的序列与序列EIVLTQSPA TLSLSPGERATLSCWYQQKPGQAPRLLIYGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCFGGGTKVEIKR(SEQ ID NO 213)至少90%相同，优选至少95%相同，并且CDRl的序列为SASSSLSYIH(SEQ ID NO :188)，或与其至少90%相似的序列， 优选与其至少90%相同的序列，CDR2的序列是DTSNLAS (SEQ ID NO :190)，或与其至少80%相似的序列，优选与其至少80%相同的序列；和CDR3的序列是FQGSEYPLT(SEQ ID NO :192)，或与其至少80%相似的序列，优选与其至少80%相同的序列。本发明的结合结构域，作为抗体的一部分呈现时，将结合人结肠癌细胞系 Colo205。如将理解的，抗体由分别包含可变区和恒定区的两个重链和分别包含可变区和恒定区的两个轻链组成。当所述结合结构域是￥11结合结构域时，结合人结肠癌细胞系Colo205 的抗体将由两个所述Vh结合结构域，SEQ ID NO. 7的两个轻链和SEQ ID NO. 92或SEQ ID NO. 52的两个重链恒定结构域组成。以相似的方式，当所述结合结构域是&结合结构域时， 结合人结肠癌细胞系Colo205的抗体将由两个所述八结合结构域，SEQ ID NO. 93的两个八恒定结构域和SEQ ID NO. 94或SEQ ID N0. 50的两个重链组成。


图1-如通过流式细胞仪所示的，Use 104(SEQ ID NO :3/SEQ ID NO :1中所列的可变区)和嵌合SC104(SEQ ID NO :4/SEQ ID NO :2)抗体和人IgGl同种型对照对SC104抗原阳性(C170, Colo205)和SC104抗原阴性(HCT-116)人结肠癌细胞系的结合(左图)和直接杀灭(右图)活性，序列ID指的是序列号。嵌合SC104和鼠SC104抗体呈现出相当的抗原阳性人结肠癌细胞系的选择性结合和直接杀灭活性。两种抗体都没有结合和直接杀灭抗原阴性人结肠癌细胞系。每个点表示三个重复样品的平均值士SD。图2-人受体框架1U6A或IQLR上结合Kabat-限定CDR-Hl的SC104的人源化 (-□“)产生了没有结合SC104抗原阳性人结肠癌细胞系C170的非功能性抗体变体。使用抗原阳性细胞系C170通过流式细胞仪测定了使用嫁接至人受体1U6A(SEQ ID NO :7/SEQ ID NO 9,图 Α)或 IQLR(SEQ ID NO :8/SEQ ID NO :10，图 B)的 Kabat-限定 CDR-Hl 的人源化SC104变体的结合活性。嵌合SC104抗体(SEQ ID NO :4/SEQ ID NO 2)与人IgG1同种型阴性对照一起显示为比较对象。每个点表示三个重复样品的平均值士SD。图3-人受体框架1U6A或IQLR上结合AbM-限定CDR-Hl的SC104的人源化(-▲-) 产生了结合SC104抗原阳性人结肠癌细胞系C170的抗体变体。使用抗原阳性细胞系C170 通过流式细胞仪测定了结合嫁接至人受体1U6A(SEQ ID NO :7/SEQ ID N0:11，图Α)或 IQLR(SEQ ID NO :8/SEQ ID NO :12,图 B)的 AbM-限定 CDR-Hl 的人源化 SC104 变体的结合活性。嵌合SC104抗体(SEQ ID NO :4/SEQ ID NO 2)与人IgG1同种型阴性对照一起显示为比较对象。每个点表示三个重复样品的平均值士SD。图4-针对增强1U6A人源化SC104的结合活性的轻链和重链氨基酸置换的分析。 通过流式细胞仪，通过抗原阳性细胞系C170的结合活性试验，分析了每条链中置换的影响。嵌合SC104抗体(SEQ ID NO :4/SEQ ID NO 2)与人IgG1同种型阴性对照一起显示为比较对象。每个点表示三个重复样品的平均值士SD。A 含有 Kabat CDR-Hl 的嫁接；SEQ ID NO :9 是未取代的 VH，SEQ ID NO :15 含有 Vh 取代Q1E、Q46E、I48M、V67I、T68S、V71R和E72D，SEQ ID NO :7 指的是结合单个置换 A15P 的 Vl,而SEQ ID NO 16指的是含有三个置换I2N、A15P和T69N的Vl。B 含有 AbM CDR-Hl 的嫁接；SEQ ID NO 11 指的是不含置换的 VH, SEQ ID NO 13 含有VH置换Q1E、Q46E、I48M、V67I、T68S、V71R和E72D，SEQ ID NO :7 指的是结合单个置换 A15P的VL, SEQ ID NO 16指的是含有三个置换I2N、A15P和T69N的Vl。重链氨基酸置换(-□-或-〇_)增强了 ITOA-人源化SC104抗体变体与抗原阳性细胞系C170的结合活性。比较起来，轻链氨基酸置换似乎在增强人源化SC104的结合活性中不太重要。图5-含有AbM限定⑶R-Hl的1U6A人源化抗体中结合的六个单独Vh置换的分析。 通过流式细胞仪，通过抗原阳性细胞系C170的结合活性试验，分析了置换的影响。这些变化是Q46E或I48M或V67I或T68S或V71R或E72D，并且分别通过SEQ ID N0:19至 来描述。置换R71(SEQ ID NO :23)(-〇_)在增强人源化SC104的结合功效中最有利。嵌合 SC104抗体(SEQ ID NO :4/SEQ ID NO 2)与人IgG1同种型阴性对照一起显示为比较对象。 每个点表示三个重复样品的平均值士SD。图6_Vh置换R71 (- □-或-▲ _)增强了 AbM-和Kabat-限定CDR-Hl抗体变体与抗原阳性细胞系C170的结合活性，如通过流式细胞仪所测定的。嵌合SC104抗体(SEQ IDNO :4/SEQ ID NO 2)被显示为比较对象，人IgG1同种型被用作阴性对照。每个点表示三个重复样品的平均值士 SD。A 基于 IQLR 的 SC104 变体士 V71R 置换；AbM 限定 CDR-Hl 嫁接SEQ ID NO :12(-R) 和 SEQ ID NO :26(+R) ；Kabat 限定 CDR-Hl 嫁接:SEQ ID NO :10(-R)和 SEQ ID NO :27(+R)。B 基于 1U6A 的 SC104 变体士 V71R 置换；AbM 限定 CDR-Hl 嫁接:SEQ ID NO :11(_R) 和 SEQ ID NO :25(+R) ；Kabat 限定 CDR-Hl 嫁接:SEQ ID NO :9(-R)和 SEQ ID NO :28(+R)。图7-对含有Kabat限定CDR-Hl的IQLR人源化SC104变体中的Vh置换G27Y的结合活性的作用。在基于流式细胞仪的SC104抗原阳性细胞系C170的结合试验中检测时，该置换没有增强 IQLR 人源化 SC104 (SEQ ID NO :27 (+R)和 SEQ ID NO :29(+R+Y) (-□-或-▲-) vs含有Vh的AbM-⑶R-HlSEQ ID NO 26)的结合活性。为了比较，显示了不含R71的结合 Kabat-限定 CDR-Hl 的 IQLR 人源化变体，SEQ ID NO :10。嵌合 SC104 抗体(SEQ ID NO :4/ SEQ ID NO 2)被显示为比较对象，人IgG1同种型被用作阴性对照。每个点表示三个重复样品的平均值士 SD。图8-基于流式细胞仪的结合试验，证明了通过嵌合SC104的⑶R-H2内的F53置换从框架2:CDR-H2边界除去预计的强MHC II类结合肽序列时对结合活性的影响。将F53 转变成另一个芳香族残基，如W(SEQ ID N0:30)或Y(SEQ ID M :31) (-□-或-〇-)，对结合活性具有可以忽略的影响，而置换成优选的残基P(SEQ ID NO :32)，强烈地降低了与 SC104抗原阳性细胞系C170的结合活性。嵌合SC104抗体(SEQ ID NO :4/SEQ ID NO 2) 与人IgG1同种型阴性对照一起显示为比较对象。每个点表示三个重复样品的平均值士SD。图9-就与抗原阳性(C170，Colo205)或抗原阴性(HCT-116)人结肠癌细胞系的特异性和结合活性而言，将具有较低预测的免疫原性的人源化SC104变体(1TOA VL/VH SEQ ID NO :7/SEQ ID NO :50 ；IQLR VL/VH SEQ ID NO :8/SEQ ID NO :38)与具有较高预测的免疫原性的人源化抗体变体(1U6A VL/VH SEQ ID NO :7/SEQ ID NO :25 ；IQLR VL/VH SEQ ID NO 8/SEQ ID NO 26)进行比较，如通过流式细胞仪所测定的。嵌合SC104抗体(SEQ ID NO :4/ SEQ ID NO 2)与人IgG1同种型阴性对照一起显示为比较对象。每个点表示三个重复样品的平均值士 SD。图10-基于流式细胞仪的结合试验，证明了可变重链的1U6A框架1中位置四的残基 I (-〇-)(SEQ ID NO 50)和 L(- 口 -) (SEQ ID NO 62)而不是 C(- ▲ -) (SEQ ID NO 55)给予了具有较低预测的免疫原性的人源化SC104抗体变体最高的与SC104抗原阳性人结肠癌细胞系C170的结合活性。嵌合SC104抗体(SEQ ID NO :4/SEQ ID NO 2)与人IgG1 同种型阴性对照一起显示为比较对象。每个点表示三个重复样品的平均值士SD。图11-基于流式细胞仪的结合试验，证明了可变重链的1U6A框架3中位置71的正电荷残基R(SEQ ID NO :50) (-□-)，而不是负电荷残基D (SEQ ID NO :75) (-▲-)或中性残基W(SEQ ID NO 90) (- ■-)给予了具有较低预测的免疫原性的人源化SC104抗体变体最高的与SC104抗原阳性人结肠癌细胞系C170的结合活性。嵌合SC104抗体(SEQ ID NO :4/SEQ ID NO 2)与人IgG1同种型阴性对照一起显示为比较对象。每个点表示三个重复样品的平均值士 SD。图12-如使用SC104抗原阳性人结肠癌细胞系C170通过流式细胞仪所测定的，结合 1U6A 框架的 SC104 抗体变体(VL/VH SEQ ID NO :7/SEQ ID NO :50 禾口 SEQ ID NO :7/SEQ
18ID NO 25) (- □-或-■-)与相应的 IQLR 衍生的 SC104 变体(VL/VH SEQ ID NO :8/SEQ ID NO :38和SEQ ID NO :8/SEQ ID NO :26)相比，具有更有效的直接杀灭活性。嵌合SC104抗体(SEQ ID NO :4/SEQ ID NO 2)与人IgG1同种型阴性对照一起显示为比较对象。每个点表示三个重复样品的平均值士 SD。图13-如使用SC104抗原阳性人结肠癌细胞系C170通过LDH释放试验所测定的， 结合 1U6A 框架的人源化 SC104 抗体变体(Vl/Vh SEQ ID NO :7/SEQ ID NO :50 和 SEQ ID NO: 7/SEQ ID NO 25) (- □-或-■-)与相应的 IQLR 衍生的 SC104 变体(VL/VH SEQ ID NO :8/ SEQ ID NO :38和SEQ ID NO :8/SEQ ID NO :26)相比，具有较高的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性活性。嵌合SC104抗体(SEQ ID NO :4/SEQ ID NO 2)被显示为比较对象，而人IgG1 同种型被用作阴性对照。每个点表示三个重复样品的平均值士SD。图14-如使用SC104抗原阳性人结肠癌细胞系Colo205通过细胞生活力试验所测定的，结合 1U6A 框架的 SC104 抗体变体(VL/VH SEQ ID NO 7/SEQ ID NO :50 和 SEQ ID N0: 7/SEQ ID NO 25) (- □-或-■-)与相应的 IQLR 衍生的 SC104 抗体变体(VL/VH SEQ ID NO :8/SEQ ID NO :38禾口 SEQ ID NO :8/SEQ ID NO :26)相比，具有更有效的补体依赖性细胞毒性。嵌合SC104抗体(SEQ ID NO :4/SEQ ID NO 2)与人IgG1同种型阴性对照一起显示为比较对象。每个点表示三个重复样品的平均值士SD。图15-如使用SC104抗原阳性WiDr人结肠癌细胞系通过LDH释放试验所测定的， 几夫碱(kifunensin)处理的具有较低预测的免疫原性的人源化SC104抗体(SEQ ID N0 7/SEQ ID NO 50)(-〇-)与未处理的抗体(-▲-)相比，具有较高的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性活性。每个点表示三个重复样品的平均值士SD。图16-如使用SC104抗原阳性Colo201人结肠癌细胞系通过LDH释放试验所测定的，Potelligent 工程化的具有较低预测的免疫原性的人源化SC104抗体(SEQ ID NO -J/ SEQ ID NO 94)(-〇-)与未处理的抗体(SEQ ID NO :7/SEQ ID NO :50)相比，具有较高的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性活性。每个点表示三个重复样品的平均值士SD。图17-用具有较低预测的免疫原性的人源化SC104抗体(SEQ ID NO :7/SEQ ID NO 50)处理带有HD9异种移植肿瘤的小鼠，与介质对照处理相比，导致明显降低的生长。 上图6-10只小鼠组中，平均士SEM肿瘤体积。星号表示处理组之间的显著差异，ρ < 0. 05， Marm-Whitney测试。下图研究结束时的平均和单独的肿瘤重量。P值是通过Marm-Whitney 测试测定的。图18-用具有较低预测的免疫原性的Potelligent⑧工程化的人源化SC104抗体 (-O “) (SEQ ID NO :7/SEQ ID NO :94)处理带有Colo201异种移植肿瘤的小鼠，与介质对照处理相比，导致明显降低的肿瘤体积。10只小鼠组中的平均士SEM。星号表示处理组之间的显著差异，ρ < 0. 05，t-测试。发明详述本发明涉及人源化抗癌结合结构域。这些结合结构域是基于小鼠抗体 SC104(W02005/108430)并且包含修饰的人框架序列，以提高结合和活性，并且降低预测的免疫原性。如本领域技术人员已知的，在此产生和描述的序列可以进一步被修饰，以通过亲和性突变来提高结合和提高Fc-介导的效应子功能。在此所述的结合结构域可以单独使用或结合使用，用于人癌症的诊断和/或治疗，例如结直肠癌、胰腺癌、卵巢癌和肺癌。
在第一个方面中，本发明提供了 Vh抗体结合结构域，该结合结构域顺次包含第一个框架区(FRl)、第一个CDR(CDRl)、第二个框架区(FR2)、第二个CDR(CDR2)、第三个框架区 (FR3)、第三个CDR(CDRiB)和第四个框架区(FR4)，其中FRl 的序列是 XJQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVXfYSiy^SEQ ID NO 卯)，其中X1 是 Q 或 EX2 是 S 或 T父3是1、1^或 VX4 是 S 或 T或与其至少90%或至少95%相似的序列，优选与其至少90%或至少95%相同的序列，CDRl的序列是SGYSWH(SEQ ID NO 96)或与其至少80%相似的序列，优选与其至少80%相同的序列，FR2 的序列是 WIRQ)(5PGKGLX6WX7G (SEQ ID NO :97)，其中)(5是3 或 PX6 是 Q 或 E父7是] 或 I或与其至少90%相似的序列，优选至少与其90%相同的序列，CDR2 的序列是 HlHX8SGRPirX9PSDC1c1S (SEQ ID NO :98)，其中X8 是 F、Y 或 WX9 是 N 或 DX1。是 K、L、H、F、R 或 S或与其至少90%相似的序列，优选至少与其90%相同的序列，FR3 的序列是 RXn)(12ISX13)(14TAKNQFSLKLTSMTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO :99)，其中X11 是 V 或 I父12是丁或SX13 是 R 或 KX14 ^ E ^ D或与其至少90%或至少95 %相似的序列，优选至少与其90 %或至少95 %相同的序列，附带条件是位置6的残基必须是R或K，CDR3的序列是KGKGSDDGLNY(SEQ ID NO :100)，或与其至少90%相似的序列，优选与其至少90%相同的序列，FR4的序列是WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO 101)，或与其至少90%相似的序列，优选与其至少90%相同的序列。在第二个方面中，本发明提供了 Vh抗体结合结构域，该结合结构域包含框架序列以及位于框架序列内的第一个、第二个和第三个⑶R，其中框架区的序列与序列QVQLQESGP GLVKPSETLSLTCTVSGYSX3SffIRQPPGKGLQffIGRVTISX13ETAKNQFSLKLTSMTAADTAVYYCARffGQGTLVT VSS(SEQ ID NO :102)至少90%相同，优选至少95%相同；其中)(3是I、L或V，并且)(13是1 或K ；并且CDRl的序列是SGYSWH (SEQ ID NO :96)，或与其至少80%相似的序列，优选与其至少80%相同的序列；CDR2 的序列是 HlHX8SGRPirX9PSDC1c1S (SEQ ID NO :98)，其中X8 是 F、Y 或 WX9 是 N 或 DX1。是 K、L、H、F、R 或 S或与其至少90%相似的序列，优选与其至少90%相同的序列；CDR3的序列是KGKGSDDGLNY(SEQ ID NO :100)，或与其至少90%相似的序列，优选与其至少90%相同的序列。FRl、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3 和 FR4 的优选序列如下FRl 选自 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSIS(SEQ ID NO 103)，QVQLQESGPGLVKPS ETLSLTCTVSGYSIT(SEQ ID NO 104),QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSLS(SEQ ID NO :105)， QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSLT(SEQ ID NO 106), QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSVS( SEQ ID NO 107), QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSVT(SEQ ID NO :108)，QVQLQESGPGLVKPS ETLSLTCTVTGYSIS(SEQ ID NO 109),QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVTGYSIT(SEQ ID NO :110)， QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVTGYSLS(SEQ ID NO :111), QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVTGYSLT( SEQ ID NO :112), QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVTGYSVS(SEQ ID NO :113)，QVQLQESGPGLVKPS ETLSLTCTVTGYSVT(SEQ ID NO :114),EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSIS(SEQ ID NO :115)， EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSIT(SEQ ID NO :116), EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSLS( SEQ ID NO :117), EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSLT(SEQ ID NO :118)，EVQLQESGPGLVKPS ETLSLTCTVSGYSVS(SEQ ID NO :119),EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSVT(SEQ ID NO :120)， EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVTGYSIS(SEQ ID NO :121), EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVTGYSIT( SEQ ID NO :122), EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVTGYSLS(SEQ ID NO :123)，EVQLQESGPGLVKPS ETLSLTCTVTGYSLT(SEQ ID NO 124),EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSTGYSVS(SEQ ID NO :125) 和 EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVTGYSVT(SEQ ID NO :126)。CDRl 是 SGYSWH (SEQ ID NO :96)；FR2 选自 WIRQSPGKGLQWIG(SEQ ID NO :127), WIRQSPGKGLQWMG (SEQ ID NO :128)， WIRQSPGKGLEffIG(SEQ ID NO :129),WIRQSPGKGLEWMG(SEQ ID NO :130),WIRQPPGKGLQffIG(SEQ ID NO :131), WIRQPPGKGLQWMG(SEQ ID NO :132), WIRQPPGKGLEffIG(SEQ ID NO :133)和 WIRQPPGKGLEWMG(SEQ ID NO :134)；CDR2 选自 HIHFSGRPTYNPSLSS(SEQ ID NO :135), HIHFSGRPTYNPSLKS (SEQ ID NO :136)，HIHFSGRPTYNPSLLS(SEQ ID NO : 137)，HIHFSGRPTYNPSLHS(SEQ ID NO :138)，HIHFSGRPTYNPSLFS(SEQ ID NO : 139)，HIHFSGRPTYNPSLRS(SEQ ID NO:
140)， HlHffSGRPTYNPSLSS(SEQID NO 141), HIHffSGRPTYNPSLKS (SEQ ID NO142)，HIHffSGRPTYNPSLLS (SEQIDNO 143)，HIHffSGRPTYNPSLHS (SEQIDNO:144)HIHffSGRPTYNPSLFS (SEQIDNO:145)，HIHffSGRPTYNPSLRS(SEQIDNO ；:146)HIHYSGRPTYNPSLSS (SEQIDNO:147)，HIHYSGRPTYNPSLKS (SEQIDNO :148)HIHYSGRPTYNPSLLS(SEQIDNO:149)，HIHYSGRPTYNPSLHS(SEQIDNO:150)HIHYSGRPTYNPSLFS(SEQIDNO:151)，HIHYSGRPTYNPSLRS(SEQIDNO:152)HIHFSGRPTYDPSLSS (SEQIDNO153)，HIHFSGRPTYDPSLKS (SEQIDNO:154)HIHFSGRPTYDPSLLS (SEQIDNO155)，HIHFSGRPTYDPSLHS(SEQIDNO156)，HIHFSGRPTYDPSLFS (SEQIDNO157)，HIHFSGRPTYDPSLRS(SEQIDNO158)，HlHffSGRPTYDPSLSS(SEQIDNO159)，HIHffSGRPTYDPSLKS(SEQIDNO160)，HIHffSGRPTYDPSLLS(SEQIDNO161)，HIHffSGRPTYDPSLHS(SEQIDNO162)，HIHffSGRPTYDPSLFS(SEQIDNO163)，HIHffSGRPTYDPSLRS(SEQIDNO164)，HIHYSGRPTYDPSLSS (SEQIDNO165)，HIHYSGRPTYDPSLRS(SEQIDN0；166)，HIHYSGRPTYDPSLLS(SEQIDNO 167)，HIHYSGRPTYDPSLHS(SEQIDNO168)，
HIHYSGRPTYDPSLFS(SEQ ID NO :169)和 HIHYSGRPTYDPSLRS(SEQ ID NO :170)；
FR3 选自 RVTISRETAKNQFSLKLTSMTAADTAVYYCAR (SEQ ID NO 171)，RVTISRDTAKNQFS LKLTSMTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO :172)，RVTISKETAKNQFSLKLTSMTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO: 173), RVTISKDTAKNQFSLKLTSMTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO :174)，RVSISRETAKNQFSLKLTSMTAAD TAVYYCAR(SEQ ID NO :175),RVSISRDTAKNQFSLKLTSMTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO : 176)，RVSIS KETAKNQFSLKLTSMTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO :177), RVSISKDTAKNQFSLKLTSMTAADTAVYYCAR(S EQ ID NO :178), RITISRETAKNQFSLKLTSMTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO :179)，RIITSRDTAKNQFS LKLTSMTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO :180)，RITISKETAKNQFSLKLTSMTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO: 181)，RIITSKDTAKNQFSLKLTSMTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO 182)，RISISRETAKNQFSLKLTSMTAAD TAVYYCAR(SEQ ID NO :183),RISISRDTAKNQFSLKLTSMTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO : 184)，RISIS KETAKNQFSLKLTSMTAADTAVYYCAR (SEQ ID NO 185)和 RISISKDTAKNQFSLKLTSMTAADTAVYYCAR (SEQ ID NO 186)，CDR3 是 KGKGSDDGLNY(SEQ ID NO 100)，禾口FR4 是 WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO : 101)。在第三个方面中，本发明提供了 VL抗体结合结构域，该结合结构域顺次包含第一个框架区(FRl)、第一个CDR(CDRl)、第二个框架区(FR2)、第二个CDR(CDR2)、第三个框架区 (FR3)、第三个CDR(CDRiB)和第四个框架区(FR4)，其中FRl 的序列是 EX15VLTQSPGTLSLSX16GERATLSC(SEQ ID NO :187)其中，X15 ^ I ^ NXjA或P或与其至少90%或至少95%相似的序列，优选与其至少90%或至少95%相同的序列，CDRl的序列是SASSSLSYIH(SEQ ID NO 188)，或与其至少90%相似的序列，优选与其至少90%相同的序列，FR2的序列是WYQQKPGQAPRLLIY(SEQ ID NO :189)，或与其至少90%相似的序列， 优选与其至少90%相同的序列，CDR2的序列是DTSNLAS (SEQ ID NO :190)，或与其至少80%相似的序列，优选与其至少80%相同的序列，FR3 的序列是 GIPDRFSGSGSG)(17DFTLTISRVEPEDFAVYYC(SEQ ID NO :191)，其中，X17 是 T 或 N或与其至少90%或至少95%相似的序列，优选与其至少90%或至少95%相同的序列，CDR3的序列是FQGSEYPLT(SEQ ID NO :192)，或与其至少80%相似的序列，优选与其至少80%相同的序列，FR4的序列是reQGTKLEIKR(SEQ ID NO 193)，或与其至少90%相似的序列，优选与其至少90%相同的序列。在第四个方面中，本发明提供了 \抗体结合结构域，该结合结构域包含框架序列以及位于框架序列内的第一个、第二个和第三个⑶R，其中框架区的序列与序列EIVLTQSPG TLSLSPGERATLSCWYQQKPGQAPRLLIYGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRVEPEDFAVYYCFGQGTKLEIKR(SEQ ID NO 194)至少90%相同，优选至少95%相同，并且CDRl的序列是SASSSLSYIH(SEQ ID NO :188)，或与其至少90%相似的序列， 优选与其至少90%相同的序列；CDR2的序列是DTSNLAS (SEQ ID NO :190)，或与其至少80%相似的序列，优选与其至少80%相同的序列；CDR3的序列是FQGSEYPLT(SEQ ID NO :192)，或与其至少80%相似的序列，优选与其至少80%相同的序列。FRl、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3 和 FR4 的优选序列如下FRl 选自 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSC(SEQ ID NO :195)，EIVLTQSPGTLSLSAGERATLSC(SEQ ID NO 196),ENVLTQSPGTLSLSPG ERATLSC(SEQ ID NO 197)和 ENVLTQSPGTLSLSAGERATLSC(SEQ ID NO :198)。CDRl 是 SASSSLSYIH(SEQ ID NO :188)；FR2 是 WYQQKPGQAPRLLIY(SEQ ID NO :189)；CDR2 是 DTSNLAS(SEQ ID NO :190)；FR3 是 GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRVEPEDFAVYYC(SEQ ID NO :199)或 GIPDRFSGSGSGN DFTLTISRVEPEDFAVYYC(SEQ ID NO :200)；CDR3 是 FQGSEYPLT(SEQ ID NO :192)禾口FR4 是 FGQGTKLEIKR(SEQ ID NO :193)。在第五个方面中，本发明提供了 VH抗体结合结构域，该结合结构域顺次包含第一个框架区(FRl)、第一个CDR(CDRl)、第二个框架区(FR2)、第二个CDR(CDR2)、第三个框架区 (FR3)、第三个CDR(CDR3)和第四个框架区(FR4)，其中FRl 的序列是 EVQU!QWGAGLLKPSETLSLTCAVYGYSXw)(19(SEQ ID NO :201)，其中父18是1、1^或 VX19 是 S 或 T或与其至少90%或至少95%相似的序列，优选与其至少90%或至少95%相同的序列，CDRl的序列是SGYSWH(SEQ ID NO :96)，或与其至少80%相似的序列，优选与其至少80%相同的序列，FR2 的序列是 WIRQPPGKGLEWX2CIG(SEQ ID NO :202)，其中&。是 M 或 I或与其至少90%相似的序列，优选与其至少90%相同的序列，
CDR2 的序列是 HIHX21SGRPTY)(22PSIJ(23S(SEQ ID NO :98)，其中)(21是卩、￥ 或WX22 ^ N ^ D&3是1(、1^、!1、卩、1 或 S或与其至少90%相似的序列，优选与其至少90%相同的序列，FR3 的序列是 RX2J25IS)(26DTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO :203)，其中X24 ^ V ^ IX25 ^ S ^ TXa^R 或 K或与其至少90%或至少95%相似的序列，优选与其至少90%或至少95%相同的序列，前提条件是位置6的残基必须是R或K，CDR3的序列是KGKGSDDGLNY (SEQ ID NO 100)，或与其至少90 %相似的序列，优选与其至少90%相同的序列，FR4的序列是WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO 101)，或与其至少90%相似的序列，优选与其至少90%相同的序列。在第六个方面中，本发明提供了 Vh抗体结合结构域，该结合结构域包含框架序列以及位于框架序列内的第一个、第二个和第三个CDR，其中框架区的序列与序列EVQLQQWGA gllkpsetlsltcavygysx18swirqppgkglewigrvtisx26dtsknqfslklssvtaadtavyycarwgqgtlvt
VSS(SEQ ID NO :204)至少90%相同，优选至少95%相同，其中‘是I、L或V，而&6是1 或K，并且CDRl的序列是SGYSWH (SEQ ID NO :96)，或与其至少80%相似的序列，优选与其至少80%相同的序列；CDR2 的序列是 HIHX21SGRPTY)(22PSIJ(23S (SEQ ID NO :98)，其中X21 是 F、Y 或 WX。是 N 或 DX23 是 K、L、H、F、R 或 S或与其至少90%相似的序列，优选与其至少90%相同的序列；和CDR3的序列是KGKGSDDGLNY (SEQ ID NO 100)，或与其至少90 %相似的序列，优选与其至少90%相同的序列。FRl、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3 和 FR4 的优选序列如下FRl 选自EVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGYSIS(SEQ ID NO 205), EVQLQQffGAGLLKPSETLSLTCA VYGYSIT(SEQ ID NO :206)，EVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGYSLS(SEQ ID NO :207)，EVQLQQff GAGLLKPSETLSLTCAVYGYSLT(SEQ ID NO 208), EVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGYSVS(SEQ ID NO 209)和 EVQUIQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGYSVT(SEQ ID NO :210)；CDRl 是 SGYSWH (SEQ ID NO 96)；FR2 是 WIRQPPGKGLEWIG(SEQ ID NO :133)或 WIRQPPGKGLEWMG (SEQ ID NO :134)；CDR2 选自 HIHFSGRPTYNPSLSS (SEQ ID NO 135)，HIHFSGRPTYNPSLKS (SEQ ID NO :136)，HIHFSGRPTYNPSLLS(SEQ ID NO 137)，HIHFSGRPTYNPSLHS(SEQ IDNO 138), HIHFSGRPTYNPSLFS(SEQID NO :139)，HIHFSGRPTYNPSLRS(SEQ ID NO 140), HlHffSGRPTYNPSLSS(SEQ ID NO:141), HIHffSGRPTYNPSLKS (SEQ ID NO:142)，HIHffSGRPTYNPSLLS (SEQIDNO 143)，HIHffSGRPTYNPSLHS(SEQIDNO:144)，HIHffSGRPTYNPSLFS (SEQIDNO ；:145)，HIHffSGRPTYNPSLRS(SEQIDNO:146)，HIHYSGRPTYNPSLSS(SEQIDNO :147)，HIHYSGRPTYNPSLKS (SEQIDNO:148)，HIHYSGRPTYNPSLLS(SEQIDNO:149)，HIHYSGRPTYNPSLHS (SEQIDNO:150)，HIHYSGRPTYNPSLFS (SEQIDNO ::151)，HIHYSGRPTYNPSLRS(SEQIDNO152)，HIHFSGRPTYDPSLSS (SEQIDNO :153)，HIHFSGRPTYDPSLKS (SEQIDNO154)，HIHFSGRPTYDPSLLS (SEQIDNO :155)，HIHFSGRPTYDPSLHS(SEQIDNO156)，HIHFSGRPTYDPSLFS (SEQIDNO:157)，HIHFSGRPTYDPSLRS(SEQIDNO158)，HlHffSGRPTYDPSLSS (SEQIDNO:159)，HIHffSGRPTYDPSLKS(SEQIDNO160)，HIHffSGRPTYDPSLLS(SEQIDNO:161)，HIHffSGRPTYDPSLHS(SEQIDNO162)，HIHffSGRPTYDPSLFS(SEQIDNO ::163)，HIHffSGRPTYDPSLRS(SEQIDNO164)，HIHYSGRPTYDPSLSS (SEQIDNO :165)，HIHYSGRPTYDPSLRS(SEQIDNO166)，HIHYSGRPTYDPSLLS(SEQIDNO ；:167)，HIHYSGRPTYDPSLHS(SEQIDNO168)，HIHYSGRPTYDPSLFS(SEQ IDNO 169)和 HIHYSGRPTYDPSLRS(SEQ ID NO :170)；FR3选自 RVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO :218)，RVTISKDTSKNQFS LKLSSVTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO :219)，RVSISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO: 220)，RVSISKDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO :221)，RITISRDTSKNQFSLKLSSVTAAD TAVYYCAR(SEQ ID NO :222)，RITISKDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO 223),RISIS RDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO 224), RISISKDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR(S EQ ID NO :225)。CDR3 是 KGKGSDDGLNY (SEQ ID NO :100)。FR4 是 WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 101)。在第七个方面中，本发明提供了 \抗体结合结构域，该结合结构域顺次包含第一个框架区(FRl)、第一个CDR(CDRl)、第二个框架区(FR2)、第二个CDR(CDR2)、第三个框架区 (FR3)、第三个CDR(CDRiB)和第四个框架区(FR4)，其中FRl 的序列是 EX27VLTQSPATLSLSPGERATLSC(SEQ ID NO :211)，其中，)(27 是 I 或 N或与其至少90%或至少95%相似的序列，优选与其至少90%或至少95%相同的序列，CDRl的序列是SASSSLSYIH(SEQ ID NO 188)，或与其至少90%相似的序列，优选与其至少90%相同的序列，FR2的序列是WYQQKPGQAPRLLIY(SEQ ID NO :189)，或与其至少90%相似的序列， 优选与其至少90%相同的序列，CDR2的序列是DTSNLAS (SEQ ID NO :190)，或与其至少80%相似的序列，优选与其至少90%相同的序列，FR3 的序列是 GIPDRFSGSGSG)(28DFTLTISRLEPEDFAVYYC(SEQ ID NO :212)，其中是 T 或 N或与其至少90%或至少95%相似的序列，优选与其至少90%或至少95%相同的序列，CDR3的序列是FQGSEYPLT (SEQ ID NO :192)，或与其至少80%相似的序列，优选与其至少80%相同的序列，FR4的序列是FGGGTKVEIKR(SEQ ID NO 193)，或与其至少90%相似的序列，优选与其至少90%相同的序列。在第八个方面中，本发明提供了 \抗体结合结构域，该结合结构域包含框架序列以及位于框架序列内的第一个、第二个和第三个⑶R，其中框架区的序列与序列EIVLTQSPA TLSLSPGERATLSCWYQQKPGQAPRLLIYGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCFGGGTKVEIKR (SEQ ID NO 213)至少90%相同，优选至少95%相同，并且CDRl的序列为SASSSLSYIH(SEQ ID NO :188)，或与其至少90%相似的序列， 优选与其至少90%相同的序列，CDR2的序列是DTSNLAS (SEQ ID NO :190)，或与其至少80%相似的序列，优选与其至少80%相同的序列；和CDR3的序列是FQGSEYPLT (SEQ ID NO :192)，或与其至少80%相似的序列，优选与其至少80%相同的序列。FRl、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3 和 FR4 的优选序列如下FRl 选自 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC (SEQ ID NO :214)或 ENVLTQSPATLSLSPGERATLSC(SEQ ID NO :21 。CDRl 是 SASSSLSYIH(SEQ ID NO :188)。FR2 是 WYQQKPGQAPRLLIY(SEQ ID NO :189)。CDR2 是 DTSNLAS(SEQ ID NO 190)。FR3 是 GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC(SEQ ID NO :216)或 GIPDRFSGSGSGN DFTLTISRLEPEDFAVYYC(SEQ ID NO :217)。CDR3 是 FQGSEYPLT(SEQ ID NO 192)。FR4 是 FGGGTKVEIKR(SEQ ID NO :193)。在本发明的优选实施方案中，本发明的Vh和\抗体结合结构域进一步包含恒定结构域。恒定结构域可以是人或非人灵长类动物恒定区，优选人恒定区。在一个实施方案中， 重链恒定结构域的序列是 ASTKNPDVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO 52)；或ASTKGPSVFPLAPSSK STSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SLSPGK(SEQ ID NO 92)；或ASTKNPDVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO 53)；禾口轻链恒定结构域的序列为TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAI^Q SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO 93) 在本发明进一步优选的实施方案中，提供了包含第一个方面的V1^n第二个方面的 Vl或第三个方面的Vh和第四个方面的\的抗体。本发明的结合结构域和抗体特异性地结合癌细胞，该癌细胞表达由SC104结合的抗原，癌症特别是结直肠癌和非结直肠癌，如卵巢、胰腺、前列腺和肺癌。因此，在另一个方面中，本发明提供了治疗受试者癌症的方法，其中癌症选自结直肠、卵巢、胰腺、前列腺和肺癌，该方法包括将治疗有效量的根据本发明的结合结构域或抗体给药于受试者。本发明还提供了检测样品中癌细胞存在的方法，该方法包括将细胞样品接触根据本发明的结合结构域或抗体，并且检测根据本发明的结合结构域或抗体与细胞的结合。如所知的，可以使用本领域公知的方法来改进本发明中研发和描述的序列，以提高结合，例如，通过亲和性成熟，或通过除去预测的MHC II类结合基序来降低免疫原性。可以通过调节其功能性特征，如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)、血清半衰期、生物分布以及与Fc受体的结合，或这些的任意组合，来进一步增强在此研发和描述的序列的治疗实用性。可以通过蛋白质工程、糖工程或化学方法来实现这种调节。根据所需的治疗应用，可以有利地提高或降低这些活性中的任一种。用于抗体亲和性成熟的各种方法是本领域已知的。这些中的许多是通过诱变，以及随后的为了提高的亲和性而进行选择和/或筛选的基于产生变体蛋白的组或文库的一般策略。诱变通常在DNA水平进行，例如，通过易出错PCRCThie，Voedisch等，2009)、基因改组(shuffling) (Kolkman和Stemmer，2001)、使用诱变化学物质或辐射、使用具有易出错复制机制的“突变子”株(Greener，1996)或控制天然亲和性成熟机制的体细胞超突变方法(Peled，Kuang等，2008)。还可以在RNA水平进行诱变，例如，通过使用Q β复制酶 (Kopsidas, Roberts等，2006)。可以筛选提高的变体蛋白的基于文库的方法可以基于各种展示技术，如噬菌体、酵母、核糖体、细菌或哺乳动物细胞，并且是本领域公知的(Benhar， 2007)。可以通过更定点/更有预测性的方法来实现亲和性成熟，例如，通过定向诱变或通过来自3D蛋白建模的发现指导的基因合成(参见，例如，Queen, Schneider等，1989或US 专利 6，180，370 或 US 专利 5，225，539)。Ferrara, Brunker 等，2006 ；Li, Sethuraman 等，2006 ；Stavenhagen, Gorlatov 等， 2007 ；Shields，Namenuk 等，2001 ；Shinkawa，Nakamura 等，2003 和 W02008/006554 已经描述了提高ADCC的方法。在优选的形式中，本发明的抗体具有降低的岩藻糖水平。Idusogie，Wong 等，2001 ;Dall ‘ Acqua，Cook 等，2006 ;Michaelsen，Aase 等， 1990 ；Brekke，Bremnes 等，1993 ；Tan，Shopes 等，1990 ；Norderhaug，Brekke 等，1991 已经描述了提高CDC的方法。描述提高ADCC和CDC方法的参考文献包括Natsume，化等，2008。在此通过交叉参考包括这些参考文献每一篇的公开内容。用于调节抗体血清半衰期和生物分布的各种方法是基于改变抗体和新生Fc受体 (FcRn)之间的相互作用，新生Fc受体是在保护IgC免受分解代谢并且维持高血清抗体浓度中起关键作用的受体。Dall'Acqua等描述了 IgGl的Fc区中增强与Fcfoi的结合亲和性的置换，由此提高血清半衰期 all，Acqua, Woods等，200 ，并且用M252Y/S254T/T256E 的三个置换进一步证明了增强的生物利用率和ADCC活性的调节(Dall’ Acqua,Kiener等， 2006)。还可以参见 U. S.专利 No. 6，277，375 ；6，821，505 ；和 7，083，784。Hinton 等描述了位置250和428的给予提高的体内半衰期的恒定结构域氨基酸置换(Hinton，Johlfs等， 2004)。(Hinton，Xiong 等，2006)。还可以参见 U. S.专利 No. 7，217，797。Petkova 等描述了位置307，380和434的给予提高的体内半衰期的恒定结构域氨基酸置换(Petkova，Akilesh 等，2006)。还可以参见 Shields 等(Shields, Namenuk 等，2001)和 W02000/42072。调节与Fc受体的结合以及随后通过这些受体介导的功能(包括Fcfoi结合和血清半衰期)的恒定结构域氨基酸置换的其他实例描述于U. S.专利申请No. 20090142340 ；20090068175 ；和 20090092599ο已知连接抗体分子的多糖影响抗体与Fc受体和多糖受体的相互作用，并且由此影响抗体活性，包括血清半衰期(Kaneko，Nimmerjahn等，2006 Jones, Papac等，2007 ； 和Kanda，Yamada等，2007)。因此，调节所需抗体活性的特定糖型(glycoform)可以给予治疗优势。产生工程化糖型的方法是本领域已知的，并且包括但不限于U. S.专利 No. 6，602, 684 ；7，326，681 ；7，388，081 ；和 W02008/006554 所述的那些。通过添加聚乙二醇(PEG)延长半衰期已经广泛用于延长蛋白质的血清半衰期，例如，由 Fishburn (Fi shburn，2008)所综述的。如将被认识的，可以在本发明的序列内制得保守性氨基酸置换。“保守性置换”意思是具有相似特性的氨基酸。如本说明书中所用的，将以下的氨基酸组看成是保守性置换H、R 禾口 K ；D、E、_Q;V、I 禾口 L ；C 和 M ；S、T、P、A 禾口 G ；禾口F、Y 和 W。如将看到的，本说明书使用术语“％相似”和“％相同”来描述许多序列。如所理解的，术语“ ％相同，，意思是在特定区域的两个序列的比较中，两个序列在相同位置具有特定数目的相同残基。术语“％相似”具有相似的意思，但除了两个序列之间的相同氨基酸数目之外，还必须关注氨基酸不相同但是上述保守性置换的位置。在整个说明书中，词语“包括(comprise) ”或变形，如“包括(comprises) ”或“包括(comprising) ”，将理解为意味着包括所述要素、整体或步骤，或要素、整体或步骤的组， 但不排除任何其他要素、整体或步骤，或要素、整体或步骤的组。本说明书中提及的所有出版物在此引入作为参考。本说明书中已经包括的文献、 法案、材料、装置、论文等的任何讨论仅仅是用于提供本发明内容的目的。没有当作允许这些物质的任一或全部形成现有技术的基础或是本发明相关领域中的公知常识的部分，因为在本申请的每个权利要求的优先权日之前，其存在于澳大利亚或别处。为了可以更好地理解本发明的性质，现在将通过参考以下实施例来描述其优选形式。
具体实施例方式实施例1嵌合SC104抗体的产生将鼠SC104重链可变区(Vh)SEQ ID NO 1电子(in silico)格式化至人IgGl主链上(人IgGl重链CHl，铰链，CH2&CH3结构域，如NCBI登录号AAH7M19及其衍生物)，以产生嵌合SC104重链SEQ ID NO :2。相似地，将SC104轻链可变区(Vj SEQ ID NO :3电子 (in silico)格式化至人IgGl主链上(如NCBI登录号P01834及其衍生物)，以形成相应的嵌合SC104轻链SEQ ID NO :4。DNA构建体的格式化和产生将所得到的重链和轻链氨基酸序列回翻译成DNA序列。在编码重链多肽信号序列 SEQ ID NO 5的核苷酸序列中的上游包括了 5，-Vh-特异性限制位点AscI。将TthlllI限制位点引入编码3’ -Vh区氨基酸TVSS的多核苷酸序列中。5’ -Vl-特异性限制位点BsiWI 结合编码轻链多肽信号序列SEQ ID NO :6的核苷酸序列的上游。在编码位于\区C-端的氨基酸RT的核酸序列的3-端包括RsrII限制位点。为了在CHO细胞中表达，然后使用 GeneOptimizer 技术(GeneArtJIH)将这些序列优化。随后通过合成的寡核苷酸(GeneArt，德国)的装配，从头合成可变区。将添加的限制位点用于将可变区克隆至含有合适IgGl恒定区的基于谷氨酰胺合成酶(GS)中国仓鼠卵巢(CHO)的基因表达系统载体中(Lonza，UK)。将所得到的含重链和含轻链的载体用于共同转染CHO-KlSV细胞，以产生抗体。抗体构建体的细胞培养和瞬时表达将CHO-KlSV(Lonza，UK)细胞以 2X IO5 个细胞 /ml_4X IO6 个细胞 /ml 在 Freestyle CHO化学限定的细胞生长培养基anvitrogen )中培养，并且培养物补充6mM终浓度的L-谷氨酰胺anvitrogen )。将细胞在36. 5 °C、10 % CO2和140rpm 下培养。在转染前一天，将100ml培养体积以5X IO5个细胞/ml接种于500ml开口 Erlenmeyer 烧瓶(Corning )中。第二天，在 15mL Corning 试管中制备 ^iL 的 OptiPRO SFManvitrogen )，并与100 μ g的每种抗体链混合。将所得到的混合物通过 0. 2ym 13mm注射器端过滤装置(Millipore )过滤至含有200 μ lFreestyle Max试剂 (Invitrogen )的新鲜15mL Corning 试管中。将混合物在室温下培养10分钟，然后加入之前接种的CH0-K1SV细胞中。7天后，通过在3000g下离心10分钟来收集上清液，然后通过0. 2 μ m膜过滤至无菌容器中(Corning⑧过滤装置)。抗体的纯化将从转染的CHO细胞收集的上清液调节至pH7. 4，然后装载至HiTrap ProteinA 柱上(lmL, GE Healthcare)。用 30mL 的 IX PBS (pH7. 4)洗涤柱子。使用 0. IM pH3 的柠檬酸来进行洗脱。使用kba 脱盐柱(Pierce )将洗脱的抗体脱盐至IX PBS中(pH7. 4)。 通过A28tl值测定抗体浓度。基于流式细胞仪的结合试验在96V-孔平板(Eppendorf)中，用100 μ 1缓冲液(PBS加1 % FCS)中各种浓度的鼠SC104、嵌合SC104或人源化变体和人IgG1同种型(Sigma-Aldrich )在黑暗中在冰上培养活的肿瘤细胞和对照细胞OX105，如通过蓝排除法所判断的)，重复三份。用缓冲液将细胞洗涤两次，接着在含有分别用于检测嵌合或鼠抗体的山羊抗人IgG(Fe-特异性的， Sigma-Aldrich ，缀合 FITC)或山羊抗鼠 IgG (Fe-特异性的，Sigma-Aldrich ，缀合 FITC) 的100 μ 1缓冲液中培养20min。洗涤后，将细胞重悬浮于缓冲液中，并在Cell Lab Quanta SC MPL上(Beckman Coulter)，通过流式细胞仪，使用EV、侧面散射和FL-I门控，来分析抗体结合；在获取过程中，通过在下面垫个冷包(Eppendorf)来冷却96-孔平板中的细胞。将结果表达为平均荧光强度(MFI)；通过GraphPad Prism 软件，使用非线性回归分析，计算了曲线斜率值。基于流式细胞仪的直接杀灭试验在96V-孔平板(Eppendorf)中，用80 μ 1缓冲液(PBS加1 % FCS)中各种浓度的鼠SC104、嵌合SC104或人源化变体和人IgG1同种型(Sigma-Aldrich )在黑暗中在室温下将活的肿瘤细胞O X 105，如通过蓝排除法所判断的)培养2. 5至3小时，重复三份。向每个孔中，加入20 μ 1缓冲液中的0. 15g 7AAD (BD ι Bioscience)，并且将细胞再培养20min, 接着在Cell Lab Quanta SC MPL上(Beckman Coulter)，通过流式细胞仪，使用EV、侧面散射和FL-I门控，来测定细胞生活力；在获取过程中，通过在下面垫个冷包(Eppendorf)来冷却96-孔平板中的细胞。将结果表达为7AAD+细胞的百分比；通过GraphPad Prism 软件，使用非线性回归分析，计算了曲线斜率值。嵌合SC104抗体具有有效且特异性的与人结肠肿瘤细胞的结合并直接杀灭人结肠肿瘤细胞的活性测试嵌合和鼠亲本SC104抗体与人结肠癌细胞系C170(ECACC登录号97071507) 和Colo205(ATCC登录号CCL_22》的结合；之前使用流式细胞仪试验已经显示出鼠SC104 抗体强烈结合这些细胞系(Durrant,Harding等，2006)。图1(左图)显示了 SC104抗体与 C170和Colo205的结合，但人IgG1同种型对照没有，鼠和嵌合SC104抗体在一定的抗体浓度范围内都呈现出相似的结合强度。相反，没有一个抗体结合人结肠癌系HCT-116(ATCC登录号CCL-M7)，由此将其定义为SC104抗原阴性。已知鼠SC104抗体诱导结肠肿瘤细胞的直接杀灭，不需要免疫效应细胞或补体 (Durrant, Harding等，2006)。实际上，鼠和嵌合SC104抗体都显示出有效直接的抗原阳性细胞C170和Colo205杀灭，但人IgG1同种型对照没有；相反，抗体没有显示超过抗原阴性细胞HCT-116的背景杀灭(图1，右图)。使用不同抗原阴性人结直肠肿瘤细胞(HCT15，ATCC登录号CCL-225)、人非肿瘤细胞(MRC5，ATCC登录号CCL-171)或来自正常人捐献者的外周血单核细胞的其他实验显示出对于鼠和/或嵌合SC104抗体没有结合和没有直接杀灭活性(数据未显示)。总之，嵌合 SC104抗体与亲本鼠SC104抗体相比较时，具有相似的效力和特异性。因此，将嵌合SC104 抗体用作参照，来测试随后产生的人源化SC104抗体变体的活性。实施例2SC104的人源化通过3D建模选择合适的人框架受体使用晶体结构数据库(参见，例如，Research Collaboratory for StructuralBioinformatics(RCSB)蛋白质数据库，http//www, rcsb. otr/pdb/home/home. do 世界蛋白质数据库的一部分，http //www, wwpdb. org)和软件包Discovery Studio ￥1.7仏(3沈1巧8@，旧六)，构建了鼠5(104重链可变区(Vh)和轻链可变区(Vl)的独立3D模型。简而言之，通过Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)询问蛋白质数据库，使用鼠SC104重链可变区或轻链可变区搜寻，以鉴定伴随晶体结构信息的相似多肽序列的抗体。随后基于与鼠SC104可变区共享的氨基酸序列同一性和鉴定的晶体结构，将这些结构用于构建同源性模型。使用这些鼠％和\模型，从与鼠抗体那些共享框架结构同源性的蛋白质数据库中独立鉴定出合适的人Vh和\受体框架。为了确保正确的重链和轻链配对， 通过人源化过程进行相同抗体晶体结构的Vh和\人受体框架。优选具有更好鼠-人重链框架区结构同源性的人受体抗体，其优于具有更好鼠-人轻链框架同源性的那些。这些包括Pdb登录号1U6A和1QLR。对人框架受体进行评价，以测试是否这些结构能够合适地支持 SC104 CDR0人源化抗体构建体的格式化最初，鉴于CDR嫁接技术(参见，例如(Queen, Schneider等，1989)或US专利 6，180，370或US专利5，225，539)是基于这种分类，根据Kabat的方法(参见Kabat，1991) 限定鼠SC104互补性决定区(CDR)。在后一种人源化尝试中，使用AbM命名法(参见，例如 (Dubel,2007)和其中结合的参考文献)限定重链的CDRl (CDR-Hl)，表1。使用DNAMar 软件包(版本8 ;Lasergene ，USA)将⑶R电子(in silico)格式化至选定的人框架上。将 Vh区格式化至含有CH1、铰链、CH2&CH3结构域(如，NCBI登录号AAH72419及其衍生物)的人IgGl重链上。伴随地，使用相应的人IgGl轻链恒定区(如NCBI登录号P01834及其衍生物)，将\区格式化。结合Kabat限定⑶R-Hl的人源化SC104变体出人意料地产生无功能抗体将人受体框架1U6A和IQLR用于SC104人源化。将鼠SC104轻链CDR格式化至 1U6A和IQLR轻链框架区上。通过用脯氨酸置换除去1U6A框架序列中位置15的不常见丙氨酸残基(A15P)，产生SEQ ID NO :7。按照以上所述的，将基于IQLR的人源化SC104轻链格式化，以产生SEQ ID NO :8。将相应的基于1U6A的SC104重链格式化，以含有Kabat限定CDR-H1，SEQ ID NO :9。伴随地，将基于IQLR的SC104重链格式化，以含有Kabat-限定 ⑶R-Hl，SEQ ID NO :10。在CHO细胞中共同表达基于1U6A的轻链和重链组合SEQ ID NO 7和SEQ ID NO :9。在CHO细胞中还共同表达了基于IQLR的轻链和重链组合SEQ ID NO 8 和SEQ ID NO=IO0通过蛋白A亲和性色谱纯化所得到的抗体，并且使用流式细胞仪测试活细胞结合活性。令人惊讶地，这些都结合了 Kabat-限定⑶R-Hl的人源化抗体变体不能结合SC104抗原阳性细胞(图2)。结合AbM-限定⑶R-Hl的人源化SC104变体令人惊讶地产生功能性抗体结合Kabat-限定⑶R-Hl人源化时出人意料的失败后，应用了 AbM-限定⑶R-Hl命名法(表1)。随后，将基于1U6A-和IQLR的SC104重链格式化，以结合AbM-限定⑶R-H1， 分别为SEQ ID NO :11和12。在CHO细胞中共同表达基于1U6A的轻链和重链组合SEQ ID NO :7和SEQ ID NO 110在CHO细胞中还共同表达了基于IQLR的轻链和重链组合SEQ ID NO :8和SEQ ID N0:12。通过蛋白A亲和性色谱纯化所得到的抗体，并且使用流式细胞仪测试活细胞结合活性。令人惊讶地，这些都结合了 AbM-限定⑶R-Hl的人源化抗体变体结合了 SC104抗原阳性细胞(图3)。提高人源化SC104的结合活性图3显示了与使用嵌合SC104观察到的相比，人源化SC104抗体具有次最佳结合活性。这些数据表明为了使人源化SC104在结合活性中不具反应损失，一个或多个框架氨基酸置换是重要的。为了解决这一问题，比较了鼠SC104和1U6A的框架多肽序列。使用鼠SC104可变区3D模型，将框架之间的氨基酸差异电子(in silico)标记并查阅。鉴定了六个Vh和三个Vl氨基酸(包括置换A15P，以除去1U6A受体框架中发现的该位置的不常见丙氨酸残基)，用于进一步的体外研究，来测试它们对人源化抗体的结合活性的贡献。使用 IQLR-人源化SC104进行了相似的分析，由此标记了四个Vh和两个\氨基酸，用于体外测试。IQLR人源化SC104中为体外研究标记的所有位置与已经在1U6A人源化SC104中鉴定的那些相同。随后将尝试聚焦于只使用1U6A受体鉴定在增强人源化SC104效力中关键的残基。人源化Vh框架中需要的预测置换对于增强结合活性比人源化\中预测的那些更
重要重新合成编码基于1U6A的SC104重链的AbM-和Kabat-限定CDR-Hl变体的基因， 以引入总共六个氨基酸残基置换-Q46E、I48M、V67I、T68S、V71R、E72D (Kabat编号)。这分别产生了 SEQ ID NO 13 (AbM CDR-H1) ^P 15 (Kabat CDR-Hl)。通过以上所示的方法，将另外两个氨基酸置换-QlE和S25T标记为优先性低于上述六个，其中并且也引入SEQ ID NO 13中，产生了 SEQ ID NO 14，为含有总共八个氨基酸置换的AbM-限定⑶R-Hl变体。相应的AbM-和Kabat-嫁接的重链序列-SEQ ID NO 11和9，分别用作未置换对照。将基于1U6A的轻链格式化，引入三个置换_I2N、A15P、T69N (Kabat编号)_以形成 SEQ ID N0:16。将相应的轻链序列SEQ ID NO :7用作最小置换的对照。将重链和轻链的置换和未置换或最小置换的组合共同表达，并且在基于流式细胞仪的细胞结合试验中测定其活性。在含有Kabat-限定⑶R-Hl的嫁接中，两个人源化SC104抗体变体SEQ ID NO :7/ SEQ ID N0:15和SEQ ID NO :16/SEQ ID NO :15共享相同的引入了上述六个氨基酸置换的重链(SEQ ID N0:15)。这些抗体展示出相似的阳性结合活性，与是否与含有置换(SEQ ID NO 16)或最小置换(SEQ ID NO 7)的轻链配对无关。相反，将重链变成含有Kabat-限定 ⑶R-Hl并且没有氨基酸置换，如SEQ ID NO :9，则消除了结合，与是否使用轻链SEQ ID NO 7或SEQ ID N0:16无关，图4A。相似地，含有单个或所有三个置换(分别为SEQ ID NO 7 和16)的轻链与包含AbM-限定CDR-Hl的重链(参见，例如，SEQ ID NO 11和13，分别表示未置换和含置换的重链)配对时没有明显地影响人源化SC104抗体变体的有效结合活性， 图4B。当重链SEQ ID NO: 13转换成重链SEQ ID NO 14时，观察到了与图4B相似的趋势， 并且使用嵌合SC104(SEQ ID NO :4/SEQ ID NO :2)进行了相同的基于流式细胞仪的结合试验，结果未显示。该数据表明置换QlE和S25T没有负责通过重链SEQ ID N0:13和14与其未置换对应物SEQ ID NO :11相比所示的有效结合活性。因此，没有进一步研究置换QlE和 S25T。此外，这些数据证明了 1U6A重链中的一个或多个置换对于产生具有增强的结合活性的人源化SC104变体的重要性。将1U6A人源化SC104的重链中的置换在位置-I48M、V67I、T68S和V71R-引入 Kabat-嫁接的IQLR重链序列中(SEQ ID N0:10)，产生SEQ ID N0:17。相似地，在IQLR人源化SC104轻链-I2N和T69N-中形成置换，以产生SEQ ID NO :18。用未置换(SEQ ID NO: 8)或含置换(SEQ ID NO 18)轻链表达时，含有AbM-限定CDR-Hl (SEQ ID NO 12)的抗体活性没有受到显著影响。表达具有含有上述置换的Kabat-限定CDR-Hl (SEQ ID NO 17)的 1QLR-SC104变体与未置换的IQLR伴侣SEQ ID NO :8产生了具有低结合活性的人源化变体。 用SEQ ID NO :17与完全置换的轻链SEQ ID NO :18共同表达时产生的抗体观察到的可忽略的结合活性表明轻链中的置换对于IQLR-人源化SC104的结合活性是不利的。除了之前所述的那些，这些抗体变体的结合数据概括于表2中。Vh框架中R71的存在对于产生高活性人源化SC104是重要的单独的1U6A重链可变区框架置换Q46E、I48M、V67I、T68S、V71R和E72D与Q1E — 起格式化至SEQ ID NO :11中，以产生SEQ ID N0:19至24。将所得到的重链与轻链SEQ ID NO 7共同表达，并且通过基于流式细胞仪的结合试验来比较所得到的人源化SC104变体。 具有Q46E、I48M、V67I、T68S和E72D的人源化SC104抗体变体彼此间呈现出相似的结合活性，但与嵌合SC104抗体相比时，明显较低，图5。相反，携带V71R置换的人源化SC104抗体变体(由SEQ ID NO 23编码)显示出与嵌合SC104抗体相似的增强结合活性。这些数据表明除了 AbM-限定CDR-Hl以外，R71对于高效力的人源化形式的SC104是重要的。重新格式化含R71的重链来引入置换E1Q，SEQ ID NO :25，在与轻链SEQ ID NO :7共同表达时， 没有改变所得到抗体的高水平的结合活性(未显示)。R71增强了包含AbM-和Kabat-限定CDR-Hl的SC104人源化变体的结合活性将鉴定为对于使用人受体1U6A人源化的SC104的有效结合活性为关键的置换 V71R引入基于IQLR的SC104变体中，变体含有分别如SEQ ID NO 26和27中详细描述的 AbM-或Kabat-限定CDR-Hl。为了比较，还将V71R引入了基于1U6A的SC104变体SEQ ID NO 10中，其包含Kabat-限定⑶R-Hl，以形成SEQ ID NO :28。在CHO细胞中共同表达基于IQLR的轻链和重链组合SEQ ID NO 8和SEQ ID NO 26或SEQ ID NO :27。在CHO细胞中还共同表达了基于1U6A的轻链和重链组合SEQ ID NO 7和SEQ ID NO :28。通过蛋白A 亲和性色谱纯化所得到的抗体，并且通过流式细胞仪测试对抗原阳性细胞系C179的活细胞结合活性。如通过流式细胞仪测量的，置换V71R显著增强了基于IQLR的含有AbM-限定 CDR-Hl的SC104对抗原阳性细胞系C170的活细胞结合活性，对相应的Kabat-限定嫁接的抗体，程度较低，图6A。比较中，如通过流式细胞仪测量的，置换V71R显著增强了 Kabat-和 AbM-限定⑶R-Hl基于1U6A的SC104变体对抗原阳性细胞系C170的活细胞结合活性，图 6B。增强其中⑶R-Hl的AbM-和Kabat限定不同的区域中人源化SC104变体的结合活
性的氨基酸置换的鉴定与Kabat-嫁接的对应物相比，AbM限定重链⑶Rl在CDR的氨基末端包括其他五个捐献者氨基酸残基，表1。这种含有AbM-限定CDR-Hl的SC104变体相对于其Kabat嫁接的对应物一致的增强效力是令人惊讶的。表3比较了来自捐献者(包括在AbM CDR-Hl嫁接物中)、1U6A和IQLR受体序列的这五个氨基酸，比较捐献者和1U6A序列，显示出非保守性差异G27Y最可能引起增强含有AbM-限定CDR-Hl的人源化变体相对于嵌合体的效力，因为T30S是保守性改变。将该置换G27Y结合至Kabat嫁接的1QLR-SC104变体SEQ ID NO 27 (+R)，以产生SEQ ID N0:29(+R+Y)。在CHO细胞中共同表达该重链和基于IQLR的轻链SEQ ID NO :8，并且按照之前所述的纯化所得到的抗体。为了比较，在通过流式细胞仪的抗原阳性细胞系C170的比较性活细胞结合活性中，包括结合Kabat-限定⑶R-Hl但不含R71 的IQLR人源化抗体(SEQ ID NO 10)和第二个结合AbM-限定CDR-Hl并含有R71的变体 (SEQ ID N0J6)，图7。出人意料地，通过轻链和重链组合SEQ ID NO :8和SEQ ID NO 29 产生的合成的人源化抗体变体不具有结合活性。实施例3具有较低预测的免疫原性的SC104变体对于预测的T细胞表位(Epibase ，Algonomics，比利时)，电子(in silico)筛选鼠SC104可变区氨基酸序列。鉴定了两个预测的II类主要组织相容性复合体(II类MHC) 结合肽。这些位于重链中的框架(FR)2 ⑶R-H2和⑶R-H2 :FR3边界处。这些是特别令人感兴趣的，因为对于它们的去除预测涉及置换CDR氨基酸残基，这可以改变抗体结合效力。重链Vh区预测的II类MHC结合肽去除预测表明了用色氨酸(SEQ ID NO 30)或酪氨酸(SEQ ID NO :31)，或优选脯氨酸 (SEQ ID NO 32)置换CDR-H2序列HIHFSGRPTYNPSLSS的位置4的苯丙氨酸残基时，鼠Vh区中的FR2:⑶R-H2 II类MHC结合肽的强度将降低。这些重链与轻链SEQ ID NO :4在CHO 细胞中共同表达，并且按照之前所述的通过蛋白A色谱纯化所得到的抗体。令人惊讶地，使用嵌合SC104的比较性的基于流式细胞仪的结合试验揭示了置换F53W和F53Y对通过嵌合 SC104观察到的有效结合活性具有可以忽略的影响，而置换F53P明显降低了所得到抗体的结合效力，图8。此外，电子(in silico)免疫原性预测(通过软件ftx)Pred，Singn，H 禾口 Raghava， G. P. S. ) (2001)， ProPred-Prediction of HLA-DR binding sites. Bioinformatics,17 (12),1236-37。http://www. imtech. res. in/raghava/propred/)禾口 / 或 SYFPETHI(Rammensee, Bachmann 等，1999) ；http//www, syfpeithi. de/Scripts/ MHCServer. dll/EpitopePrediction. htm)表明了 SC104CDR-H2 嫁接至人受体主链 1U6A 或 IQLR中时，这种预测的II类MHC结合肽的强度降低。第二种预测的在⑶R-Hl :FR3边界的II类MHC结合肽的存在预测存在于鼠和人源化SC104抗体序列中。具有较低预测的免疫原性的SC104变体基于基于ITOA-和IQLR-基的SC104的受体框架，产生了新的人源化变体，对其去除了潜在的II类主要组织相容性复合体结合序列。简而言之，只预测人源化轻链可变区具有容许的(即，种系)II类MHC结合序列，而预测IQLR和1U6A的重链可变区分别具有一个和两个强结合的II类主要组织相容性复合体结合序列。紧接着通过Kabat的方法限定CDR-Hl之前，还预测了更多的较弱结合的推定II类MHC结合序列。产生了置换策略，目的在于去除这些预测的II类MHC结合表位。构建了如构建了如SEQ ID NO 33至SEQ ID NO 38列出的一组基于IQLR的具有预测的较低免疫原性的SC104重链可变区变体。还构建了如SEQ ID NO 39至SEQ ID NO 50列出的一组基于1U6A的具有预测的较低免疫原性的SC104重链可变区变体。在CHO细胞中进行了基于IQLR的轻链SEQ ID NO :8与变体SEQ ID N0:33至SEQ ID NO :38中每一个的共同表达，并且按照之前详述的来纯化所得到的抗体。相似地，在CHO细胞中进行了基于1U6A的轻链SEQ ID NO 7与变体SEQ ID NO 39至SEQ ID NO :50中每一个的共同表达，并且按照之前详述的来纯化所得到的抗体。在活细胞流式细胞仪试验中，将具有较低预测的免疫原性的人源化SC104抗体变体的对表达SC104抗原的人结肠癌细胞(C170，Colo205)的结合活性与嵌合SC104比较。在每种情况中，观察到与嵌合抗体相当的结合活性。SC104抗体结合也是细胞类型特异性的， 因为较低预测的免疫原性SC104变体没有结合SC104抗原阴性人结肠癌细胞HCT116 ；图9 中显示了较低预测的免疫原性SC104变体的有效且特异性结合的实例。重链可变区中给予具有较低预测的免疫原性的SC104变体最佳结合活性的关键残基的鉴定紧接着Kabat-限定⑶R-Hl之前的横跨框架区中的氨基酸位置沈至30的序列 GY27SI29S结合至受体框架1U6A或IQLR中时，给予了具有较低预测的免疫原性的SC104变体高结合活性(图9)。相反，序列GY27SF29S结合至基于IQLR受体框架的构建体中时，令人惊讶地导致了差的结合活性(图7)，表明Y27不是涉及给予高结合活性的唯一残基。随后通过改变ITOA-人源化重链SEQ ID NO 50的这个位置存在的氨基酸来研究了位置四的不同氨基酸残基对结合活性的影响。将重链变体与轻链SEQ ID NO :7在CHO细胞中共同表达， 按照之前所述的，通过蛋白A亲和性色谱来纯化，并通过流式细胞仪来测试。示例性结合数据显示于图10中，而表4概括了所有测试置换的结合活性。令人惊讶地，只有位置四的残基 I(SEQ ID NO 50), L (SEQ ID NO :62)或 V(SEQ ID NO :70)给予了具有较低预测的免疫原性的人源化SC104抗体变体最佳的结合活性，而大部分置换，包括I29F (SEQ ID NO :58)， 导致了差的对SC104抗原阳性人癌细胞C170的结合活性。之前已经证明了可变重链的框架3中的R71在产生具有最佳高结合活性的人源化变体中的重要性，图6。为了进一步提高基于1U6A的具有较低预测的免疫原性的SC104变体的结合活性，将位置71的残基进行置换，以产生一组重链变体。随后将这些变体与轻链 SEQ ID N0:7在CHO细胞中共同表达，按照之前所述的，通过蛋白A亲和性色谱来纯化，并通过流式细胞仪来测试。示例性结合数据显示于图11中，而表5概括了所有测试置换的结合活性。出乎意料地，只有位置71的正电荷残基R和K(分别为SEQ ID NO 50和81)给予了人源化SC104抗体变体对SC104抗原阳性人结肠癌细胞系C170的最高结合活性。CDR-H2中N-X-S基序的修饰已知N-连接的糖基化牵涉蛋白质产物异质性，并且潜在地影响免疫原性。对鼠可变区进行了潜在N-连接的糖基化位点的分析(参见，例如(如，2007)或R. Gupta,E. Jung和 S. Brunak 的 http //www, cbs. dtu. dk/services/NetNGlyc 的软件预测算法 NetNGlyc)。该分析鉴定出⑶R-H2序列内的N-X-S基序，NPS。通常，N-X-S基序表示推定的N-连接的糖基化位点，然而，当X是脯氨酸残基时，该规则例外，这种情况下也是如此(参见，例如(Gavel 和von Heijne, 1990))。无论如何，进行了分析，以观察⑶R-H2中的这种N残基关于保持结合活性的方面是否容许改变。将嵌合SC104序列中的NPS序列改变成DPS，产生了 SEQ ID NO :51ο将轻链SEQ ID NO :4和重链SEQ ID NO :51在CHO细胞中共同表达，并且随后纯化所得到的产物(按照之前所述的)。在基于流式细胞仪的对SC104抗原阳性细胞系C170的结合试验中，比较了所得到的抗体。与嵌合SC104比较时，通过⑶R-H2内N — D置换去除 N-X-S基序对所得到抗体的结合效力具有可忽略的影响。实施例4
基于流式细胞仪的直接杀灭试验按照实施例1中所述的，使用嵌合SC104、人源化SC104抗体变体或人IgG1同种型(Sigma-Aldrich 测试了活的肿瘤细胞O X 105，如通过蓝排除法判断的)。除了 SEQ ID NO :8/SEQ ID NO :26 和 SEQ ID NO :8/SEQ ID NO :38 的基于 IQLR 的变体组合外，选择由轻链和重链组合 SEQ ID NO :7/SEQ ID NO :25 禾口 SEQ ID NO :7/SEQ ID NO :50 组成的基于 1U6A的人源化SC104抗体变体，用于进一步的研究。具有较低预测的免疫原性的新人源化SC104抗体变体具有有效的对抗人结肠癌细胞的直接杀灭活性具有较低预测的免疫原性的人源化SC104抗体变体显示出有效的人结肠癌细胞的直接杀灭活性，而不需要免疫效应细胞。图12显示出使用C170肿瘤细胞通过这些人源化SC104抗体变体、嵌合SC104抗体和人同种型对照直接杀灭的实例。使用Colo205肿瘤目标细胞测试时，获得了相似的结果(数据未显示)。令人惊讶地，与IQLR框架衍生的SC104 抗体变体(SEQ ID NO :8/SEQ ID NO :28 禾口 SEQ ID NO :8/SEQ ID NO :38)相比，1U6A 衍生的 SC104 抗体变体(SEQ ID NO :7/SEQ ID NO :25 和 SEQ ID NO :7/SEQ ID NO :50)显示出更有效的直接杀灭活性。鉴于这些SC104抗体变体相似的结合活性，因此这种直接杀灭活性的差异是出乎意料的(图9)。实施例5抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)试验使用Lymphopi^p ，根据制造商的实验方案(Axis-Siield PoCAS)，从正常人捐献者的Buffy Coat制剂(由澳大利亚红十字血液服务中心提供)纯化效应(外周血单核细胞)细胞。将活的效应细胞(5 X IO6个/ml)在RPMI 1640 (Gibco )加10 % FCS中，在 37°C禾口 10% CO2下培养过夜。用PBS接着培养基(RPMI 1640w/o酚红，Gibco ，加0. 5% FCS)洗涤肿瘤目标细胞和效应细胞，重悬浮于培养基中，并在96-孔U孔平板(Corning )中，在200 μ 1试验中，用各种浓度的抗体(嵌合SC104、人源化SC104或人IgG1同种型， Sigma-Aldrich #15154)培养，重复三份，试验由以下终浓度的物质组成目标细胞， IX IO5个细胞/ml ；效应细胞，2. 5 X IO6个细胞/ml ；抗体范围10至0. 001ug/ml。对于对照， 在Triton .-X(Sigma-Aldrich )的不存在(最小目标)或存在(最大目标)下只培养目标细胞，并且在抗体的不存在下培养目标和效应细胞(背景)。将平板在160xg下离心2min，并在潮湿的(X)2气体和37°C下培养4小时。使用乳酸脱氢酶释放试验测量了细胞死亡。简而言之，将平板在250xg下旋转5min，并根据制造商的指导，使用细胞毒性检测试剂盒(Roche)，将100 μ 1细胞上清液测试乳酸脱氢酶释放。为了最小化污染细胞携带，将上清液通过96-孔0. 2微米Acroft^p 平板(Pall)过滤。通过在492nm处阅读吸光度来定量LDH释放，并使用以下的等式来计算百分比细胞毒性100X [样品-平均(背景)]/平均(最大目标-最小目标)；通过GraphPad Prism 软件，使用非线性回归分析计算了 EC5tl 值。补体依赖性细胞毒性(⑶C)试验在96孔平孔平板中(Corning )，在150 μ 1试验中，在培养基(RPMI1640w/o, 酚红，Gibco ，加5% FCS)中培养活的肿瘤目标细胞，使用人补体血清(Sigma-Aldrich #S1764)和各种浓度的抗体(嵌合SC104，人源化SC104或人IgG1同种型，Sigma-Aldrich ，#15154)，重复三份，试验由以下终浓度的物质组成目标细胞，13. 3X IO4个细胞/ml，补体，15% ；抗体范围10至O.Olug/ml。对于对照，在补体不存在(目标背景)或存在(目标&补体背景)下只培养目标细胞，并且只在培养基中培养补体(补体背景)。将平板在 160xg下离心2min，并在潮湿的(X)2气体和37°C下培养2_3小时。根据制造商的指导，使用 CellTiter 96 试剂盒(Promega )测量细胞死亡，包括另外3_4小时的培养时间段。通过在492nm处阅读吸光度来定量目标细胞的死亡，并使用以下公式来计算百分比细胞毒性 100X [样品-平均(目标&补体背景)]/[平均(补体背景)_平均(目标&补体背景)]； 通过GraphPad Prism. 软件，使用非线性回归分析计算了 EC5tl值。具有较低预测的免疫原性的新人源化SC104抗体变体具有有效的对抗人结肠肿瘤细胞的细胞毒性在抗体依赖性细胞介导的细胞毒性和补体依赖性细胞毒性试验中，测试了具有较低预测的免疫原性的人源化SC104变体对抗结肠肿瘤细胞的细胞毒性。使用正常人捐献者的外周血单核细胞，人源化SC104抗体变体和嵌合SC104抗体，但不是人同种型对照，具有有效的对抗C170肿瘤细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性活性(图13)。使用来自其他人捐献者的外周血单核细胞获得了相似的结果(数据未显示)。图14显示了使用人补体， 相同组的人源化SC104抗体变体和嵌合SC104抗体，而不是人同种型对照，具有有效的对抗 Colo205肿瘤细胞的补体依赖性细胞毒性活性。此外，所有其他具有较低预测的免疫原性的人源化SC104抗体变体具有有效的对抗Colo205肿瘤细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性和补体依赖性细胞毒性活性(数据未显示)。与有差别的直接细胞杀灭数据一致，与IQLR 衍生的SC104抗体变体相比，1U6A衍生的SC104抗体变体显示出更高的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性和补体依赖性细胞毒性活性。鉴于不同SC104抗体变体相似的结合活性，免疫介导的细胞毒性活性中的这种等级是出乎意料的(表6)。实施例6免疫组织化学实验方案使用免疫组织化学筛选含有来自10-12名不同捐献者的每种肿瘤类型样品的多肿瘤人组织微矩阵对生物素化人源化SC104抗体变体的结合。生物素化的人IgG1同种型用于阴性对照染色。将该组织微矩阵切片接受一系列的不同抗原恢复策略，包括温度、压力和PH的改变。此外，进行一抗的连续稀释，以获得噪声比最佳的可能信号。通过基于染色强度和阳性细胞百分比的四步等级中的视觉观察，将抗体的免疫反应性分级。人源化SC104抗体变体结合各种人癌症类型分析来自不同人病人的各种不同癌症类型与具有较低预测的免疫原性的人源化 SC104抗体(SEQ ID NO :7/SEQ ID NO :50)的结合。人源化SC104抗体，而不是人同种型对照，结合了人结肠癌组织，证明了所用的结合条件的特异性(数据未显示)。表7概括了在结肠癌中发现了阳性膜染色(75% )。令人惊讶地，在胰腺癌中发现了阳性染色(70% )，卵巢癌(25% )和肺癌(16. 7% )中程度较低。相反，在分析的有限样品大小的肾癌中，没有观察到染色。这些结果表明具有较低预测的免疫原性的人源化SC104抗体对于指出结直肠、 胰腺、卵巢和肺恶性肿瘤的肿瘤诊断是有用的。此外，可以设想具有较低预测的免疫原性的人源化SC104抗体对于人的结直肠、胰腺、卵巢和肺癌的治疗性处理是有用的。可以在鼠肿瘤异种移植模型中评价这种体内抗肿瘤功效。
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实施例7SC104抗体的效应子功能增强可以通过提高抗体依赖性细胞介导的细胞毒性或补体依赖性细胞毒性或通过结合抗体依赖性细胞介导的细胞毒性和补体依赖性细胞毒性来增强抗体的效应子功能。ADCC 增强使用抗体Fc区的标准化修饰，将SC104抗体变体和嵌合SC104工程化，以增强抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性。标准方法包括例如抗体Fc区的蛋白质工程化或糖-工程化。作为蛋白质工程化的实例，按照Lazar等，2006 (Lazar，Dang等，2006)所述的，在恒定重链序列中产生突变。具体地，将S122D、S181A、I215E突变引入Fc序列SEQ ID NO 52中，以形成SEQ ID N0:53。按照实施例2中所述的，在CHO细胞中表达，并通过蛋白A色谱纯化后，在ADCC试验中测试各种具有增强的Fc-区SEQ ID NO :52的人源化抗体和嵌合抗体。按照实施例5中所述的，测量了 ADCC功能。作为糖工程化的实例，根据Zhou等(Zhou，Shankara等，2008)，用 kifunensin (0. 25 μ g/ml)将产生人源化SC104抗体变体或嵌合SC104抗体的CHO细胞培养8至10天。随后，按照实施例2中所述的来纯化抗体，并且按照实施例5中所述的来测量ADCC功能。糖工程化的另一个实例使用了Shinkawa T.等，2003 (J Biol Chem 278 =3466-73) 中所述的Potelligent 方法。如同标准恒定区主链上的IgG1那样表达人源化抗体变体的可变轻链和重链区。恒定重链的序列是GenBank P01857. 1，并且恒定轻链的序列是NCBI登录号P01834。按照实施例5中所述的来测量ADCC功能。效应子增强的SC104抗体变体和嵌合SC104抗体具有提高的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性在一系列的实验中，使用蛋白质工程化或糖工程化来提高具有低预测的免疫原性的嵌合SC104抗体和SC104抗体变体的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。与未修饰的抗体相比，Fc-工程化的(SEQ ID NO 53)或kifunensin处理过的SC104人源化抗体变体和嵌合SC104抗体显示出提高的对抗Colo205肿瘤细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。图 15显示出通过kifunensin处理的具有较低预测的免疫原性的人源化SC104抗体(SEQ ID NO :7/SEQ ID NO :50)明显提高杀灭人结肠癌细胞WiDr (ATCC登录号CCL-218)的实例。图 16显示了通过Potelligent 处理的具有较低预测的免疫原性的人源化SC104抗体(SEQ ID NO :7/SEQ ID NO :94，恒定重链的序列和恒定轻链的序列分别是GenBank P01857. 1和 NCBI登录号P01834)明显提高杀灭人结肠癌细胞Colo201 (ATCC登录号CCL-224)的实例。实施例8预防性鼠异种移植HD9肿瘤模型将雌性BALB/c裸鼠皮下接种2 X IO6个人结肠癌Η ^9细胞(ATCC登录号ΗΤΒ-38)。 肿瘤细胞接种同一天(第0天)，基于体重，将小鼠随机分成两个处理组(n = 10/组)。每组用介质对照(PBS，10mg/kg)或人源化SC104抗体(10mg/kg)通过腹腔内处理。每周给予介质对照和人源化SC104抗体两次，持续四周。使用以下公式每周计算肿瘤体积三次体积 (mm3)=长度 X 直径 2X π/6。
在研究过程中，由于过度的体重减轻，必须剔出一些小鼠，导致介质对照(n = 6) 和抗体(n = 9)处理组的小鼠数量减少。在研究终止时(第27天)，从所有小鼠尸检中去除肿瘤，清洁皮肤并称重。治疗性鼠异种移植Colo201肿瘤模型将雌性无胸腺裸鼠皮下接种5X106个人结肠癌Colo201细胞(ATCC登录号 CCL-224)。肿瘤体积达到 IlOmm3后(第0天)，将小鼠随机分成两个处理组(n= 10/组)。 每组用介质对照(PBS，10mg/kg)或人源化的Potelligent 工程化(按照实施例7中所述的)的SC104抗体(10mg/kg)通过腹腔内处理。每周给药介质对照和人源化Potelligent 工程化SC104抗体两次，持续38天。使用以下公式每周计算肿瘤体积两次体积(mm3)= 1/2 (a2Xb)，其中“a”是最小的直径，“b”是最大的直径。具有较低预测的免疫原性的人源化SC104抗体在体内的有效抗肿瘤功效与预防性肌四肿瘤模型中的介质对照处理相比，用具有较低预测的免疫原性的人源化SC104抗体(SEQ ID NO :7/SEQ ID NO :50)处理带有肿瘤的小鼠导致了明显减小的肿瘤体积和肿瘤重量(图17)。此外，在治疗性Colo201处理模型中，具有较低预测的免疫原性的人源化Potelligent .-工程化SC104抗体(SEQ ID NO :7/SEQ ID NO :94)显示出明显的抗肿瘤活性(图18)。可以设想具有较低预测的免疫原性的人源化SC104抗体变体作为单一治疗或结合其他治疗性抗肿瘤剂(例如，化疗、小分子或生物制剂)，对于人的结直肠癌的治疗是有用的。表1. SC104 的 CDR 序列
权利要求
1.一种Vh抗体结合结构域，该结合结构域顺次包含第一个框架区(FR1)、第一个CDR(CDRl)、第二个框架区(FR2)、第二个CDR(CDR2)、第三个框架区(FR3)、第三个 CDR(CDR3)和第四个框架区(FR4)，其中(i)FRl的序列是 XJQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVXfYS^yCjSEQ ID N0:%)，其中 X1是Q或EX2是S或T &是I、L或V X4是S或T或与其至少90%或至少95%相似的序列，优选与其至少90%或至少95%相同的序列；(ii)CDRl的序列是SGYSWH(SEQID NO 96)或与其至少80%相似的序列，优选与其至少80%相同的序列；(iii)FR2的序列是 WIRQX5PGKGL)(6WX7G(SEQ ID NO :97)，其中 X5是S或PX6是Q或E X7是M或I或与其至少90%相似的序列，优选至少与其90%相同的序列；(iv)CDR2的序列是 HIHX8SGRPITX9PSIJ(1(iS(SEQ ID NO :98)，其中 &是F、Y或WX9是N或DX1。是K、L、H、F、R 或 S或与其至少90 %相似的序列，优选至少与其90 %相同的序列，(v)FR3 的序列是 RXn)(12ISX13)(14TAKNQFSLKLTSMTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO :99)，其中父工工是乂或IX12是T或S X13是R或K X14是E或D或与其至少90 %或至少95 %相似的序列，优选至少与其90 %或至少95 %相同的序列， 附带条件是位置6的残基必须是R或K ；(vi)CDR3的序列是KGKGSDDGLNY(SEQ ID NO :100)，或与其至少90%相似的序列，优选与其至少90%相同的序列，(vii)FR4的序列是WGQGTLVTVSS(SEQID NO :101)，或与其至少90%相似的序列，优选与其至少90%相同的序列。
2.一种Vh抗体结合结构域，该结合结构域包含框架序列以及位于框架序列内的第一个、第二个和第三个CDR，其中框架区的序列与序列qvqlqesgpglvkpsetlsltctvsgysx3swi RQPPGKGLQWIGRVTISX13ETAKNQFSLKLTSMTAADTAVYYCARWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO :102)至少 90%相同，优选至少95%相同；其中&是I、L或V，并且X13是R或K ；并且⑶Rl的序列是SGYSWH(SEQ ID NO :96)，或与其至少80%相似的序列，优选与其至少80%相同的序列；CDR2 的序列是 HIHX8SGRPirX9PSLX1(lS(SEQ ID NO :98)，其中 &是F、Y或W X9是N或DX1。是K、L、H、F、R 或 S或与其至少90%相似的序列，优选与其至少90%相同的序列； CDR3的序列是KGKGSDDGLNY(SEQ ID NO :100)，或与其至少90%相似的序列，优选与其至少90%相同的序列。
3.如权利要求1或权利要求2所述的Vh抗体结合结构域，其中FRl的序列选自QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSIS(SEQIDNO103)QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSIT(SEQIDNO104)QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSLS(SEQIDNO105)QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSLT(SEQIDNO106)QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSVS(SEQIDNO107)QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSVT(SEQIDNO108)QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVTGYSIS(SEQIDNO109)QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVTGYSIT(SEQIDNO110)QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVTGYSLS(SEQIDNO111)QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVTGYSLT(SEQIDNO112)QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVTGYSVS(SEQIDNO113)QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVTGYSVT(SEQIDNO114)EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSIS(SEQIDNO115)EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSIT(SEQIDNO116)EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSLS(SEQIDNO117)EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSLT(SEQIDNO118)EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSVS(SEQIDNO119)EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSVT(SEQIDNO120)EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVTGYSIS(SEQIDNO121)EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVTGYSIT(SEQIDNO122)EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVTGYSLS(SEQIDNO123)EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVTGYSLT(SEQIDNO124)EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSTGYSVS(SEQ ID NO :125)禾口 EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVTGYSVT(SEQ ID NO :126)。
4.如权利要求1至3任一项所述的￥11抗体结合结构域，其中⑶Rl的序列是SGYSWH(SEQ ID NO 96)。
5.如权利要求1至4任一项所述的VH抗体结合结构域，其中FR2的序列选自WIRQS PGKGLQffIG(SEQ ID NO 127), WIRQSPGKGLQWMG (SEQ ID NO 128), WIRQSPGKGLEffIG(SEQ ID NO 129), WIRQSPGKGLEffMG(SEQ ID NO 130), WIRQPPGKGLQffIG(SEQ ID NO: 131), WIRQPPGKGLQffMG(SEQ ID NO 132), WIRQPPGKGLEffIG(SEQ ID NO :133)禾口WIRQPPGKGLEWMG(SEQ ID NO :134)。
6.如权利要求1至5任一项所述的VH抗体结合结构域，其中CDR2的序列选自 HIHFSGRPTYNPSLSS(SEQ ID NO 135)，HIHFSGRPTYNPSLKS(SEQ ID NO: 136)，HIHFSGRPTYNPSLLS (SEQ IDNO 137)，HIHFSGRPTYNPSLHS (SEQ ID NO: 138)，HIHFSGRPTYNPSLFS(SEQ ID NO 139)，HIHFSGRPTYNPSLRS(SEQ ID NO: 140), HlHffSGRPTYNPSLSS(SEQ ID NO 141), HIHffSGRPTYNPSLKS(SEQ ID NO: 142), HIHffSGRPTYNPSLLS(SEQ ID NO 143), HIHffSGRPTYNPSLHS(SEQ ID NO: 144), HIHffSGRPTYNPSLFS (SEQID NO 145), HIHffSGRPTYNPSLRS(SEQ ID NO :146)，HIHYSGRPTYNPSLSS (SEQIDNO :147)，HIHYSGRPTYNPSLKS(SEQIDNO 148)，HIHYSGRPTYNPSLLS (SEQIDNO:149)，HIHYSGRPTYNPSLHS(SEQIDNO150)，HIHYSGRPTYNPSLFS(SEQIDNO:151)，HIHYSGRPTYNPSLRS(SEQIDNO152)，HIHFSGRPTYDPSLSS(SEQIDNO:153)，HIHFSGRPTYDPSLKS(SEQIDNO154)，HIHFSGRPTYDPSLLS (SEQIDNO155)，HIHFSGRPTYDPSLHS(SEQIDNO156)，HIHFSGRPTYDPSLFS(SEQIDNO 157)，HIHFSGRPTYDPSLRS (SEQIDNO 158)，HlHffSGRPTYDPSLSS(SEQIDNO159)，HIHffSGRPTYDPSLKS (SEQIDNO160)，HIHffSGRPTYDPSLLS (SEQIDNO161)，HIHffSGRPTYDPSLHS (SEQIDNO162)，HIHffSGRPTYDPSLFS (SEQIDNO163)，HIHffSGRPTYDPSLRS(SEQIDNO164)，HIHYSGRPTYDPSLSS(SEQIDNO165)，HIHYSGRPTYDPSLKS (SEQIDNO166)，HIHYSGRPTYDPSLLS (SEQIDNO167)，HIHYSGRPTYDPSLHS(SEQIDNO168)，HIHYSGRPTYDPSLFS(SEQ ID NO 169)和 HIHYSGRPTYDPSLRS(SEQ ID NO :170)。
7.如权利要求1至6任一项所述的Vh抗体结合结构域，其中FR3的序列选自RVTISR ETAKNQFSLKLTSMTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO :171)，RVTISRDTAKNQFSLKLTSMTAADTAVYYCAR(SE Q ID NO 172), RVTISKETAKNQFSLKLTSMTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO :173)，RVTISKDTAKNQFSL KLTSMTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO :174)，RVSISRETAKNQFSLKLTSMTAADTAVYYCAR(SEQ ID N0: 175), RVSISRDTAKNQFSLKLTSMTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO :176)，RVSISKETAKNQFSLKLTSMTAAD TAVYYCAR(SEQ ID NO :177),RVSISKDTAKNQFSLKLTSMTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO :178)，RITIS RETAKNQFSLKLTSMTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO :179)，RIITSRDTAKNQFSLKLTSMTAADTAVYYCAR(S EQ ID NO :180), RITISKETAKNQFSLKLTSMTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO :181)，RIITSKDTAKNQFS LKLTSMTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO :182), RISISRETAKNQFSLKLTSMTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO: 183)，RISISRDTAKNQFSLKLTSMTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO :184)，RISISKETAKNQFSLKLTSMTAAD TAVYYCAR(SEQ ID NO 185)和 RISISKDTAKNQFSLKLTSMTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO :186)。
8.如权利要求1至7任一项所述的Vh抗体结合结构域，其中CDR3的序列是 KGKGSDDGLNY(SEQ ID NO :100)。
9.如权利要求1至8任一项所述的Vh抗体结合结构域，其中FR4的序列是 WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO :101)。
10.如权利要求1至9任一项所述的Vh抗体结合结构域，进一步包含恒定结构域。
11.如权利要求10所述的Vh抗体结合结构域，其中恒定结构域具有序列ASTKNPDVFP LAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNH KPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDEL TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO 52)；或ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP REPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO 92)；或ASTKNPDVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKAKGQP REPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO 53)
12.—种\抗体结合结构域，该结合结构域顺次包含第一个框架区(FRl)、 第一个⑶R (⑶Rl)、第二个框架区(FR2)、第二个⑶R (⑶R2)、第三个框架区(FR3)、第三个CDR(CDR3)和第四个框架区(FR4)，其中(i)FRl的序列是 EX13VLTQSPGTLSLSX14GERATLSC (SEQ ID NO :187)其中，X13是I或N，X14是A或P，或与其至少90 %或至少95 %相似的序列，优选与其至少90 %或至少95 %相同的序列，(ii)CDRl的序列是SASSSLSYIH(SEQID NO :188)，或与其至少90%相似的序列，优选与其至少90%相同的序列，(iii)FR2的序列是WYQQKPGQAPRLLIY(SEQID NO :189)，或与其至少90%相似的序列， 优选与其至少90%相同的序列，(iv)CDR2的序列是DTSNLAS(SEQ ID NO 190)，或与其至少80%相似的序列，优选与其至少80%相同的序列，(v)FR3 的序列是 GIPDRFSGSGSG)(15DFTLTISRVEPEDFAVYYC(SEQ ID NO :191)，其中，X15是T或N或与其至少90 %或至少95 %相似的序列，优选与其至少90 %或至少95 %相同的序列，(vi)CDR3的序列是FQGSEYPLT(SEQID NO 192)，或与其至少80%相似的序列，优选与其至少80%相同的序列，(vii)FR4的序列是reQGTKLEIKR(SEQID NO :193)，或与其至少90%相似的序列，优选与其至少90%相同的序列。
13.一种\抗体结合结构域，该结合结构域包含框架序列以及位于框架序列内的第一个、第二个和第三个CDR，其中框架区的序列与序列EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCWYQQKPGQAP RLLIYGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRVEPEDFAVYYCFGQGTKLEIKR(SEQ ID NO :194)至少 90%相同， 优选至少95%相同，并且CDRl的序列是SASSSLSYIH(SEQ ID NO :188)，或与其至少90%相似的序列，优选与其至少90%相同的序列；⑶R2的序列是DTSNLAS (SEQ ID NO :190)，或与其至少80%相似的序列，优选与其至少 80%相同的序列；CDR3的序列是FQGSEYPLT(SEQ ID NO :192)，或与其至少80%相似的序列，优选与其至少80%相同的序列。
14.如权利要求12或权利要求13所述的\抗体结合结构域，其中FRl的序列选自 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSC(SEQ ID NO 195), EIVLTQSPGTLSLSAGERATLSC(SEQ ID NO: 196), ENVLTQSPGTLSLSPGERATLSC(SEQ ID NO 197)和 ENVLTQSPGTLSLSAGERATLSC(SEQ ID NO :198)。
15.如权利要求12至14任一项所述的\抗体结合结构域，其中CDRl的序列是 SASSSLSYIH(SEQ ID NO :188)。
16.如权利要求12至15任一项所述的\抗体结合结构域，其中FR2的序列是 WYQQKPGQAPPLLIY(SEQ ID NO :189)。
17.如权利要求12至16任一项所述的\抗体结合结构域，其中CDR2的序列的序列是 DTSNLAS(SEQ ID NO :190)。
18.如权利要求12至17任一项所述的\抗体结合结构域，其中FR3的序列的序列是 GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRVEPEDFAVYYC(SEQ ID NO 199)或 GIPDRFSGSGSGNDFTLTISRVEPEDF AVYYC(SEQ ID NO :200)。
19.如权利要求12至18任一项所述的\抗体结合结构域，其中CDR3的序列的序列是 FQGSEYPLT(SEQ ID NO :192)。
20.如权利要求12至19任一项所述的\抗体结合结构域，其中FR4的序列的序列是 FGQGTKLEIKR(SEQ ID NO :193)。
21.如权利要求12至20任一项所述的\抗体结合结构域，进一步包含恒定结构域。
22.如权利要求21所述的\抗体结合结构域，其中恒定结构域具有序列TVAAPSVFIFP PSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEV THQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO :93)。
23.一种抗体，其包含如权利要求1至9任一项所述的Vh结合结构域和权利要求12至 20任一项所述的\结合结构域。
24.如权利要求23所述的抗体，其中Vh结合结构域和/或\结合结构域进一步包含恒定结构域。
25.如权利要求M所述的抗体，其中Vh结合结构域的恒定结构域具有以下序列ASTK NPDVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTY ICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLP PSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO 52)；或ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDff LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seq id no :9 ；或ast knpdvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqt yicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpdvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevk fnwyvdgvevhnaktkpreeqynatyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapeektiskakgqprepqvytl ppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvm healhnhytqkslslspgk(seq id no :53)。
26.如权利要求m或权利要求25所述的抗体，其中\结合结构域的恒定结构域具有序列 tvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltl skadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec(seq id no :9；3)。
27.一种vh抗体结合结构域，该结合结构域顺次包含第一个框架区(fr1)、第一个cdr(cdrl)、第二个框架区(fr2)、第二个cdr(cdr2)、第三个框架区(fr3)、第三个 cdr(cdr3)和第四个框架区(fr4)，其中(i)FRl的序列是 EVQU!QWGAGLLKPSETLSLTCAVYGYSXw)(19(SEQ ID NO :201)，其中父^是1、1^或vxw是s或t或与其至少90 %或至少95 %相似的序列，优选与其至少90 %或至少95 %相同的序列，(ii)CDRl的序列是SGYSWH(SEQ ID NO :96)，或与其至少80%相似的序列，优选与其至少80%相同的序列，(iii)fr2的序列是 wirqppgkglewx2cig(seq id no :202)，其中x2tl是m或i或与其至少90 %相似的序列，优选与其相同的序列，(iv)CDR2的序列是 HIHX21SGRPTY)(22PSIJ(23S(SEQ ID NO :98)，其中X21 是 F、Y 或 W知是n或d&3是1(、1^、!1、卩、1 或 s或与其至少90%相似的序列，优选与其至少90%相同的序列，(v)FR3 的序列是 RXm)(25IS)(26DTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO :203)，其中xm是v或ixm是s或tx26是r或k或与其至少90 %或至少95 %相似的序列，优选与其至少90 %或至少95 %相同的序列， 前提条件是位置6的残基必须是R或K，(vi)CDR3的序列是KGKGSDDGLNY(SEQ ID NO :100)，或与其至少90%相似的序列，优选与其至少90%相同的序列，(vii)FR4的序列是WGQGTLVTVSS(SEQID NO :101)，或与其至少90%相似的序列，优选与其至少90%相同的序列。
28.一种Vh抗体结合结构域，该结合结构域包含框架序列以及位于框架序列内的第一个、第二个和第三个cdr，其中框架区的序列与序列evqlqqwgagllkpsetlsltcavygysx18sw irqppgkglewigrvtisx26dtsknqfslklssvtaadtavyycarwgqgtlvtvss(seq id no :204)至少90%相同，优选至少95%相同，其中乂18是I、L或V，而)^6是1 或K，并且⑶Rl的序列是SGYSWH(SEQ ID NO :96)，或与其至少80%相似的序列，优选与其至少80%相同的序列；CDR2 的序列是 HIHX21SGRPTY)(22PSIJ(23S(SEQ ID NO :98)，其中 X21 是 F、Y 或 W 知是N或D &3是1(、1^、!1、卩、1 或 S或与其至少90%相似的序列，优选与其至少90%相同的序列；和 CDR3的序列是KGKGSDDGLNY(SEQ ID NO :100)，或与其至少90%相似的序列，优选与其至少90%相同的序列。
29.如权利要求27或权利要求28所述的Vh抗体结合结构域，其中FRl的序列选自EV QLQQffGAGLLKPSETLSLTCAVYGYSIS(SEQ ID NO 205)，EVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGYSIT(SE Q ID NO 206),EVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGYSLS(SEQ ID NO 207),EVQLQQffGAGLLKPSETL SLTCAVYGYSLT(SEQ ID NO 208),EVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGYSVS(SEQ ID NO :209)和 E VQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGYSVT(SEQ ID NO :210)。
30.如权利要求27至四任一项所述的￥11抗体结合结构域，其中CDRl的序列是 SGYSffH(SEQ ID NO 96)。
31.如权利要求27至30任一项所述的Vh抗体结合结构域，其中FR2的序列是 WIRQPPGKGLEffIG(SEQ ID NO :133)或 WIRQPPGKGLEWMG(SEQ ID NO :134)。
32.如权利要求27至31任一项所述的Vh抗体结合结构域，其中⑶R2的序列选自 HIHFSGRPTYNPSLSS(SEQ ID NO 135)，HIHFSGRPTYNPSLKS(SEQ ID NO: 136)，HIHFSGRPTYNPSLLS(SEQ ID NO 137)，HIHFSGRPTYNPSLHS(SEQ ID NO: 138)，HIHFSGRPTYNPSLFS(SEQ ID NO 139), HIHFSGRPTYNPSLRS(SEQ ID NO: 140), HlHffSGRPTYNPSLSS(SEQ ID NO :141), HIHffSGRPTYNPSLKS(SEQ ID NO:142)， HIHffSGRPTYNPSLLS(SEQIDNO 143)，HIHffSGRPTYNPSLHS (SEQIDNO144)，HIHffSGRPTYNPSLFS(SEQIDNO:145)，HIHffSGRPTYNPSLRS (SEQIDNO146)，HIHYSGRPTYNPSLSS(SEQIDNO :147)，HIHYSGRPTYNPSLKS (SEQIDNO 148)，HIHYSGRPTYNPSLLS (SEQIDNO:149)，HIHYSGRPTYNPSLHS(SEQIDNO 150)，HIHYSGRPTYNPSLFS(SEQIDNO:151)，HIHYSGRPTYNPSLRS (SEQIDNO ；152)，HIHFSGRPTYDPSLSS (SEQIDNO153)，HIHFSGRPTYDPSLKS (SEQIDNO 154)，HIHFSGRPTYDPSLLS (SEQIDNO155)，HIHFSGRPTYDPSLHS(SEQIDNO156)，HIHFSGRPTYDPSLFS(SEQIDNO157)，HIHFSGRPTYDPSLRS (SEQIDNO158)，HlHffSGRPTYDPSLSS(SEQIDNO159)，HIHffSGRPTYDPSLKS (SEQIDNO 160)，HIHffSGRPTYDPSLLS (SEQIDNO161)，HIHffSGRPTYDPSLHS (SEQIDNO 162)，HIHffSGRPTYDPSLFS(SEQIDNO163)，HIHffSGRPTYDPSLRS (SEQIDNO ；164)，HIHYSGRPTYDPSLSS(SEQIDNO165)，HIHYSGRPTYDPSLRS (SEQIDNO 166)，HIHYSGRPTYDPSLLS (SEQIDNO167)，HIHYSGRPTYDPSLHS (SEQIDNO168)，HIHYSGRPTYDPSLFS(SEQ ID NO :169)和 HIHYSGRPTYDPSLRS(SEQ ID NO :170)。
33.如权利要求27至32任一项所述的Vh抗体结合结构域，其中FR3的序列选自RVTI SRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO :218)，RVTISKDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR( SEQ ID NO 219),RVSISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO 220),RVSISKDTSKNQFS LKLSSVTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO 221), RITISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO: 222)，RITISKDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO223)，RISISRDTSKNQFSLKLSSVTAAD TAVYYCAR(SEQ ID NO :224)，RISISKDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR(SEQ ID NO :225)。
34.如权利要求27至33任一项所述的￥11抗体结合结构域，其中CDR3的序列是 KGKGSDDGLNY(SEQ ID NO :100)。
35.如权利要求27至34任一项所述的Vh抗体结合结构域，其中FR4的序列是 WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO :101)。
36.如权利要求27至35任一项所述的Vh抗体结合结构域，进一步包含恒定结构域。
37.如权利要求36所述的Vh抗体结合结构域，其中恒定结构域具有序列ASTKNPDVFP LAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNH KPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDEL TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO 52)；或 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTMLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTS GVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO :9 ；或ASTKNPDVF PLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVN HKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO :53)。
38.一种VL抗体结合结构域，该结合结构域顺次包含第一个框架区(FR1)、第一个CDR(CDRl)、第二个框架区(FR2)、第二个CDR(CDR2)、第三个框架区(FR3)、第三个 CDR(CDR3)和第四个框架区(FR4)，其中(i)FRl的序列是 EX23VLTQSPATLSLSPGERATLSC(SEQ ID NO :211)，其中，X23是I或N，或与其至少90%或至少95%相似的序列，优选与其至少90%或至少95%相同的序列；(ii)CDRl的序列是SASSSLSYIH(SEQID NO 188)，或与其至少90%相似的序列，优选与其至少90%相同的序列，(iii)FR2的序列是WYQQKPGQAPRLLIY(SEQID NO :189)，或与其至少90%相似的序列， 优选与其至少90%相同的序列，(iv)CDR2的序列是DTSNLAS(SEQ ID NO 190)，或与其至少80%相似的序列，优选与其至少80%相同的序列，(v)FR3 的序列是 GIPDRFSGSGSGX24DFTLTISRLEPEDFAVYYC(SEQ ID N0:211)，其中XM是T或N或与其至少90 %或至少95 %相似的序列，优选与其至少90 %或至少95 %相同的序列，(vi)CDR3的序列是FQGSEYPLT(SEQID NO 192)，或与其至少80%相似的序列，优选与其至少80%相同的序列，(vii)FR4的序列是FGGGTKVEIKR(SEQID NO :193)，或与其至少90%相似的序列，优选与其至少90%相同的序列。
39.一种\抗体结合结构域，该结合结构域包含框架序列以及位于框架序列内的第一个、第二个和第三个CDR，其中框架区的序列与序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCWYQQKPGQAP RLLIYGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCFGGGTKVEIKR(SEQ ID NO :213)至少 90%相同， 优选至少95%相同，并且CDRl的序列为SASSSLSYIH(SEQ ID NO :188)，或与其至少90%相似的序列，优选与其至少90%相同的序列，⑶R2的序列是DTSNLAS (SEQ ID NO :140)，或与其至少80%相似的序列，优选与其至少 80%相同的序列；和CDR3的序列是FQGSEYPLT(SEQ ID NO :192)，或与其至少80%相似的序列，优选与其至少80%相同的序列。
40.如权利要求38或权利要求39所述的\抗体结合结构域，其中FRl的序列选自 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC(SEQ ID NO :214)或 ENVLTQSPATLSLSPGERATLSC(SEQ ID NO: 215)。
41.如权利要求38至40任一项所述的\抗体结合结构域，其中CDRl的序列是 SASSSLSYIH(SEQ ID NO :188)。
42.如权利要求38至41任一项所述的\抗体结合结构域，其中FR2的序列是 WYQQKPGQAPRLLIY(SEQ ID NO :189)。
43.如权利要求38至42任一项所述的\抗体结合结构域，其中CDR2的序列的序列是 DTSNLAS(SEQ ID NO :190)。
44.如权利要求38至43任一项所述的\抗体结合结构域，其中FR3的序列的序列是 GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC(SEQ ID NO :216)或 GIPDRFSGSGSGNDFTLTISRLEPEDF AVYYC(SEQ ID NO :217)。
45.如权利要求38至44任一项所述的\抗体结合结构域，其中CDR3的序列的序列是 FQGSEYPLT(SEQ ID NO :192)。
46.如权利要求38至45任一项所述的\抗体结合结构域，其中FR4的序列的序列是 FGGGTKVEIKR(SEQ ID NO :193)。
47.如权利要求38至46任一项所述的\抗体结合结构域，进一步包含恒定结构域。
48.如权利要求47所述的\抗体结合结构域，其中恒定结构域具有序列TVAAPSVFIFP PSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEV THQGLSSPVTKSFNRGE C(SEQ ID NO :93)。
49.一种抗体，其包含如权利要求27至35任一项所述的Vh结合结构域和如权利要求 38至46任一项所述的\结合结构域。
50.如权利要求49所述的抗体，其中Vh结合结构域和/或\结合结构域进一步包含恒定结构域。
51.如权利要求50所述的抗体，其中Vh结合结构域的恒定结构域具有序列ASTKNPDV FPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNV NHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRD ELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO 52)；或 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTMLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAL TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT PPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO 92)；或ASTKNPD VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICN VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR DELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAL HNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO :53)。
52.如权利要求50或权利要求51所述的抗体，其中\结合结构域的恒定结构域具有序列 TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTL SKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTK SFNRGEC(SEQ ID NO :93)。
53.一种包含两个轻链和两个重链的抗体，其中轻链的序列如SEQ ID NO :7中所示，而重链的序列如SEQ ID NO 50中所示。
54.一种包含两个轻链和两个重链的抗体，其中轻链的序列如SEQ ID NO :7中所示，而重链的序列如SEQ ID NO 94中所示。
55.如权利要求23至沈或49至M任一项所述的抗体，其中抗体具有降低的岩藻糖水平。
56.一种治疗受试者癌症的方法，其中癌症选自结直肠、卵巢、胰腺、前列腺和肺，该方法包括将治疗有效量的根据权利要求1至阳任一项的结合结构域或抗体给药于受试者。
57.一种检测样品中癌细胞存在的方法，该方法包括将细胞样品接触根据权利要求1 至55任一项的结合结构域或抗体并检测结合结构域或抗体与细胞的结合。
全文摘要
本发明提供了具有抗肿瘤活性的人源化抗体及其结合结构域。特别地，该人源化抗体特异性结合并直接杀灭人结肠肿瘤细胞，并且在体外使用抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)试验以及在体内使用鼠肿瘤模型呈现出有效的对抗人结肠癌细胞的免疫介导的细胞毒性活性。
文档编号A61K39/395GK102395604SQ201080011960
公开日2012年3月28日 申请日期2010年3月16日 优先权日2009年3月16日
发明者A·G·多伊尔, A·W·克拉克, M·波利亚德, N·A·金茨勒, P·A·延尼格斯 申请人:赛福伦澳大利亚私人有限公司