新型人源化抗cd22抗体-单甲基阿里他汀e偶联物及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物制药技术领域，具体地说涉及一种新型人源化抗⑶22抗体-单甲 基阿里他汀E偶联物及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 研宄发现，在B淋巴细胞表面有很多特异性表达的决定簇分子（cluster of differentiation)，即 CD 分子，如：CD19, CD20, CD22, CD72 和 CD80 等；这些抗原分子 中，被作为药物靶点而进行广泛研宄，并且应用于临床的主要有CD20和CD22两个分子 (Cancer Res. 2012Nov 1;72(21) :5556-65. )。CD22,又称唾液酸结合的免疫球蛋白样凝集 素，是B细胞表面特异性表达的抗原分子，由于该分子只在B细胞和前B细胞膜表达，而在 祖B细胞和浆细胞膜表面没有表达，因此被认为是治疗非霍奇金淋巴瘤（Non-Hodgkin' s Lymphoma, NHL)的理想药物（Eur J Immunol. 20120ct;42 (10) :2792-802.) 〇
[0003] RFB4抗体是鼠源的抗人CD22抗原的单克隆抗体，与CD22有很好的亲和力和特 异性，但是由于鼠源抗体应用于人体会产生人抗鼠抗体（Human anti-mouse antibodies， HAMA)效应，从而限制了该抗体在临床的应用。我们采用"互补决定区（complementarity determining region,⑶R) "移植和计算机辅助设计方法，将RFB4抗体进行人源化改造，成 功获得了人源化的抗CD22单克隆抗体hRFB4,并获得了该抗体序列的专利（授权公告号CN 103214578 B)〇
[0004] 抗CD22抗体虽然具有较强的靶向功能，但对肿瘤的治疗效果有限，肿瘤抑制率仅 为10 % -20 %，鉴于此，抗⑶22抗体常被开发用于与细胞毒性药物偶联，利用抗⑶22抗体 的靶向性，将药物定向运输至靶细胞，并利用"弹头"药物较强的细胞毒性增强对肿瘤细胞 的杀伤作用。
[0005] 抗体药物偶联物（antibody drug conjugates, ADCs)由抗体、接头和药物三部 分组成，各组分的选择及不同偶联工艺的使用，对ADC的有效性及安全性有着极其重要 的影响。目前，国内尚无抗CD22抗体药物偶联物相关专利及文献报道，仅有少量将二肽 接头缴氨酸 -瓜氨酸（Val-Cit，vc)及影响微管聚合的单甲基阿里他汀E(monomethyl auristatin-E，MMAE)接头及药物组合应用于抗体药物偶联的报道（专利号：CN 103145847 B ;CN 103254317 B ;CN 103394083 A ;CN 1938046 B ;CN 102936281 B);现有工艺还不成 熟。
[0006] 国外现有的处于不同研发阶段的基于抗CD22抗体的抗体药物偶联物（ADCs)包括 Pfizer 公司的 Inotuzumab ozogamicin、Roche 公司的 Anti-CD22-MCC_DM1 和 Pinatuzumab vedotin〇
[0007] Inotuzumab ozogamicin在CMC-544抗体的基础上，使用具有酸不稳定性的腙键 接头，和能与DNA小凹槽结合进而引起双链DNA断裂的毒素 Calicheamicin (参考文献： Shor B et al.,Mol Immunol. 20140ct 7. pii : S0161-5890 (14) 00259-4. doi : 10. 1016 ； Kantarjian H et al·，Lancet Oncol. 2012Apr;13(4) :403-11.);腙键接头为现有ADC技术 中，稳定性相对欠缺的接头，此类接头为酸不稳定性接头，进入内含体及溶酶体内后，依靠 这些细胞器内的酸性环境进行降解，由于此类接头表现出有限的血浆稳定性，因此对药物 的安全性及有效性存在一定的负面影响：具有细胞毒性的药物可在到达靶细胞位点之前就 已经释放，进而对正常组织和细胞以及整个机体造成损伤，同时，ADC到达靶细胞之后，由于 药物的提前释放，导致有效释放至肿瘤细胞中的药物量减少，因此对靶细胞的杀伤能力下 降。
[0008] Anti-CD22-MCC-DMl 基于 HulOF4 抗体进行 ADC 开发，其中 Anti-CD22-MCC-DMl 通过不可切割的稳定的硫醚接头与抑制微管组装的美登素类毒素 DMl偶联（参考文献： Poison AG et al·，Leukemia. 2010S印；24 (9) :1566-73.专利号：US 8968741 Β2· ;EP 2446904 A2. ;EP 2447282 A2.)，不可切割的接头，依赖于溶酶体内的蛋白水解酶对ADC的 蛋白部分进行降解，释放出偶联有一个赖氨酸残基的药物，此种形式的药物具有较强的亲 水性，不能释放至靶细胞附近的其他细胞，因而不具备bystander效应，杀伤力略有欠缺， 此外，带有一个赖氨酸残基的药物同游离态的药物相比，其药效也会下降。
[0009] Pinatuzumab vedotin同样是基于HulOF4抗体进行ADC开发，使用可被溶 酶体内的蛋白酶如Cathepsin B等切割的二肽接头Val-Cit(vc)及影响微管聚合的 Auristatin类毒素 monomethyl auristatin-E (MMAE)(参考文献：Li D et al., Mol Cancer Ther. 2013Jul;12(7) :1255-65.专利号：US 20150010540 Al.)。此外，还有多种改造后的 抗 CD22 抗体 HulOF4 通过二肽接头 Val-Cit 或 Phe-Lys 与 pyrrolobenzodiazepine (PBD) 类药物进行偶联（专利号：US 20140030279A1.)。此类偶联中采用硫醇类还原剂二硫苏糖 醇（DTT)对抗体进行部分还原，此种还原剂虽然能有效还原二硫键，但无法在酸性条件下 进行，且常易与肽段形成加合物，使质谱图复杂难辨。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供了一种新型人源化抗CD22抗 体-单甲基阿里他汀E偶联物及其制备方法和应用，本发明选取Val-Cit及MMAE的接头及 药物组合与抗CD22抗体进行偶联，获得其抗体药物偶联物。与使用相同接头及药物组合的 以CD22为靶点的ADC Pinatuzumab vedotin及相关专利文件（专利号：EP 2478912A1.) 中所提供的技术方案不同，本发明所使用的抗体为具有专利的hRFB4抗体（授权公告号CN 103214578B)，同时在偶联工艺中使用膦类还原剂三羧乙基膦TCEP(Tris-(2-carboxyethy l)-phosphine hydrochloride)进行抗体的还原。相较于 Pinatuzumab vedotin 及相关 专利文件（专利号：EP 2478912 Al.)提供的偶联工艺中所使用的硫醇类还原剂二硫苏糖 醇（DTT)，TCEP能在较宽的pH范围内使用且反应条件较为温和、溶解性好、毒性较小，同时 TCEP不与蛋白质中的其他功能基团反应。基于此，本申请还对偶联工艺进行了进一步优化， 制备出平均偶联度在4左右，裸抗及偶联度为8的组分均低于5%，单体含量大于95%，且 体内外药效证实能特异性杀伤靶细胞的抗CD22抗体ADC。
[0011] 为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
[0012] 本发明提供了一种新型人源化抗CD22抗体-单甲基阿里他汀E偶联物，以及该偶 联物的制备方法；
[0013] 一种新型人源化抗⑶22抗体-单甲基阿里他汀E偶联物，包括：⑶22单抗 hRFB4分子偶联带有二肽接头Val-Cit及可自我降解的间隔单元PAB的毒素 MMAE，即 vc-PAB-MMAE，平均每个hRFB4分子偶联MMAE的分子数为3. 5-4. 5。
[0014] 其制备方法包括如下步骤：
[0015] 步骤一：在hRFB4-制剂缓冲液中加入2-4倍摩尔量的磷酸三氯乙酯TCEP ;水浴搅 拌反应，使hRFB4被还原，链间二硫键打开，样品于冰水浴中冷却至冰点以终止反应；所述 hRFB4-制剂缓冲液包含组氨酸盐酸盐、二水海藻糖和吐温20, pH为5. 5,反应在惰性气体保 护下进行；
[0016] 步骤二：将所述步骤一反应体系中被还原的hRFB4换液至PBS/D中，pH为6. 5 ;其 中D为二乙烯三胺五乙酸；
[0017] 步骤三：将所述步骤二得到的hRFB4中加入带有二肽接头Val-Cit及可自我 降解的间隔单元PAB的毒素 MMAE，即vc-PAB-MMAE，进行偶联反应；所述hRFB4与所述 vc-PAB-MMAE的摩尔比为1:4-8,反应在惰性气体保护下低于4°C进行，反应时间为l_4h ;
[0018] 步骤四：将偶联产物hRFB4-vc-MMAE换液到hRFB4-制剂缓冲液中，以去除所述步 骤三反应体系中的杂质；
[0019] 步骤五：将所述步骤四中的hRFB4_制剂缓冲液进行冻干处理；冷冻保存。
[0020] 优选地，根据上述方法制备出的hRFB4-vc_MMAE具备以下特征：裸抗及偶联度为8 的组分均低于5 %，单体含量大于95 %。
[0021] 更加优选地，根据上述方法制备出的hRFB4-vc-MMAE被应用于靶向治疗⑶22阳性 (CD22+)肿瘤药物中。
[0022] 更加优选地，所述步骤一和所述步骤三中的惰性气体为氩气或氮气。
[0023] 更加优选地，所述hRFB4-制剂缓冲液包含lOmmol/L组氨酸盐酸盐、质量百分比为 5%二水海藻糖和质量百分比为0. 01 %吐温20。
[0024] 更加优选地，所述步骤四中，所述换液包含脱盐柱或超滤换液系统。
[0025] 更加优选地，所述脱盐柱包含G-25脱盐柱。
[0026] 更加优选地，所述超滤换液系统采用30kD膜包超滤换液系统。
[0027] 其中，所述PBS为磷酸缓冲盐溶液，phosphate-buffered saline。
[0028] 其中，所述vc-PAB-MMAE简称vcMMAE ;由江阴康泰诺生物技术有限公司合成；MMAE 的全称为 monomethyl auristatin-E〇
[0029] 其中，所述hRFB4分子序列详见专利CN 103214578 B中。
[0030] 其中，所述G-25脱盐柱，不同规格型号的交联葡聚糖用英文字母G表示，G后面的 阿拉伯数为凝胶得水值的10倍，G-25为每克凝胶膨胀时吸水2. 5克，G-25的分离范围为 1000-5000Da，专为蛋白质脱盐而设计。
[0031] 本发明与现有技术相比具有以下优点：
[0032] 本发明通过抗体药物偶联技术，获得抗CD22单克隆抗体hRFB4的偶联物 hRFB4-vc-MMAE，为一种新型人源化抗CD22抗体-MMAE偶联物，该偶联物既保留了 hRFB4的 靶向性，又充分利用MMAE的抑制微管聚合能力，从而更为有效的起到靶向杀伤肿瘤细胞的 治疗效果；
[0033] 本发明所使用的Val-Cit(vc)二肽接头，克服了腙键接头在药物有效性及安全方 面的缺陷，同时，可降解的间隔单元PAB确保了释放后的药物为游离的药物MMAE本身，不携 带氨基酸残基，确保药物的有效性；
[0034] 与现有的偶联工艺相比，本发明在抗体还原反应体系中，使用膦类还原剂三羧乙 基勝（TCEP) (Tris-(2-carboxyethyl)-phosphine hydrochloride)进行抗体的半还原， TCEP能在较宽的pH范围内使用且反应条件较为温和、溶解性好、毒性较小，同时TCEP不与 蛋白质中的其他功能基团反应，可确保反应的可控性和结果的一致性；
[0035] 本发明还对偶联工艺进行了进一步优化，所制备出的偶联物，平均偶联度在4左 右，裸抗及偶联度为8的组分均低于5%，单体含量大于