抗her2人源化抗体mil41、其制备方法及用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种抗HER2人源化抗体，以及编码所述人源化抗体的核酸分子。本发 明还涉及所述核酸分子用于制备所述抗HER2人源化抗体的用途，以及所述人源化抗体用 于制备抗肿瘤药物的用途。
【背景技术】
[0002] HER2 (ERBB2)是I型跨膜酪氨酸激酶受体家族成员，在许多上皮来源的肿瘤细胞 中过表达，如25-30%的乳腺癌、25-32%的卵巢癌、30-40%的原发性肾细胞癌等，是肿瘤靶向 药物研制的重要靶点。
[0003] Genentech公司研发的人源化抗体帕妥珠（Pertuzumab，也被称作2C4,商品名 Per jeta)，通过结合HER2,阻断了 HER2与HER3之间的联系，而HER2与HER3是HER家族初 始致癌信号传导的最强二聚体形式，这种相互作用在许多不同类型肿瘤的增殖和形成中均 起重要作用。Pertuzumab对HER2低水平表达的肿瘤细胞也有作用。帕妥珠单抗在2012年 6月8日通过了美国FDA的认证，用于治疗HER2阳性的转移性乳腺癌。
[0004] 通过检索相关的文献以及专利（中国发明专利【申请号】200580031905. 4)，我们获 悉Pertuzumab在生产过程中存在序列异构体VHS的问题，这会影响最终产品的纯度。本发 明研究的目的是获得无 VHS异构体或低VHS异构体含量的抗体产品。
【发明内容】
[0005] 本发明的发明人通过计算机设计、优化和大量的实验摸索，惊奇地发现通过改变 抗体帕妥珠的核苷酸序列，以及接下来的克隆、表达策略，可以克服该抗体在表达中出现的 VHS异构体现象，从而大大提高产品的纯度。具体地，本发明包括以下几个方面：
[0006] 本发明第一方面涉及编码抗HER2人源化抗体的核酸分子，其轻链的核苷酸序列 如SEQ ID NO :1所示，其重链的核苷酸序列如SEQID NO :2所示。
[0007] 本发明第二方面涉及重组载体，其含有本发明第一方面任一项的核酸分子。
[0008] 在本发明中，所述载体可以为克隆载体或表达载体。所述载体含有本发明第一方 面所述的核酸分子，所述载体可以通过例如将上述核酸分子插入克隆载体或表达载体而得 到，或者可以通过人工合成得到。
[0009] 所述表达载体例如为原核表达载体，真核表达载体，噬菌体载体或病毒载体。其 中所述原核表达载体例如为PET载体、PGEX载体，所述真核表达载体例如为pcDNA3. 1、 pEGFP_Cl、pPIC9K，所述噬菌体载体例如为λ噬菌体载体入8丨、入8卜入8，所述病毒载体例 如为逆转录病毒、慢病毒、腺病毒或腺相关病毒载体。
[0010] 在本发明的实施方案中，所述载体为真核表达载体PTGS-FRT-DHFR。
[0011] 在本发明的实施方案中，将真核表达载体pTGS-FRT-DHFR做了进一步改造。在本 发明的实施方案中，所述改造方法为去除潮霉素选择标签，并加入谷氨酰胺合成酶表达盒 子。在本发明的具体实施方案中，所述表达载体为载体GS。
[0012] 在本发明中，在所述真核表达载体pTGS-FRT-DHFR或载体GS中连接SEQ ID NO :1 和SEQ ID NO :2的序列后，即得到重组载体。
[0013] 本发明第三方面涉及重组细胞，其含有本发明第二方面任一项的重组载体。
[0014] 根据本发明第三方面任一项的重组细胞，其为哺乳动物细胞。在本发明的实施方 案中，所述哺乳动物细胞为适合表达人源化抗体的细胞，例如来源于人、鼠或猴的哺乳动物 细胞。在本发明的实施方案中，所述哺乳动物细胞为CHO细胞。
[0015] 在本发明的实施方案中，所述哺乳动物细胞为CHO-Kl细胞。
[0016] 在本发明的具体实施方案中，所述CHO-Kl细胞是经过目标培养基驯化后的细胞。
[0017] 在本发明的实施方案中，所述目标培养基是指无血清、化学成分确定的动物细胞 培养基。
[0018] 在本发明的实施方案中，所述目标培养基中含有PluroniC F-68、葡萄糖、培养基 干粉Maxgrow202、碳酸氢钠、氯化钠和HEPES ;
[0019] 在本发明的具体实施方案中，所述目标培养基的成分为PluronicF-681. Og/L、葡 萄糖8. 8g/L、培养基干粉Maxgrow2027· 44g/L、碳酸氢钠 I. 98g/L、氯化钠3. 47g/L和IM HEPES15ml/L，并调节pH至7. 0 ±0. 1。在本发明的具体实施方案中，所述目标培养基用于细 胞驯化和种子培养。在本发明的实施方案中，所述目标培养基为表1-1的种子培养基。
[0020] 在本发明的实施方案中，所述驯化培养的方法为本领域所公知，例如先将细胞在 含有10%小牛血清的目标培养基中贴壁培养，按照50%的比例逐级去除血清，例如小牛血清 浓度从10%逐级降至5%、2. 5%、1. 25%、直至完全不含血清，然后继续传代数次，至宿主细胞 完全悬浮，成倍增长稳定，最终获得能够在目标培养基中生长的稳定宿主细胞。
[0021] 本发明的第四方面涉及抗HER2人源化抗体，其由本发明第一方面任一项的核酸 分子、第二方面任一项的重组载体、或者第三方面任一项的重组细胞制备得到。
[0022] 在本发明的实施方案中，所述抗HER2人源化抗体中VHS异构体的含量为0~ 〇· 4%，例如为 0 ~0· 2%、0 ~(λ 1%。
[0023] 在本发明的实施方案中，所述抗HER2人源化抗体中NGHC异构体的含量为0. 2%~ 1%，例如为 0. 3% ~0. 75%。
[0024] 在本发明的实施方案中，所述VHS异构体的定量方法为电荷变量分析法(也即阳 离子交换分析法)。
[0025] 在本发明的实施方案中，所述NGHC异构体的定量方法为还原型的毛细管凝胶电 泳分析法（CE-SDS)。
[0026] 本发明的第五方面涉及本发明第四方面任一项的抗HER2人源化抗体的制备方 法，其包括利用本发明第一方面任一项的核酸分子、第二方面任一项的重组载体、或者第三 方面任一项的重组细胞制备该抗HER2人源化抗体的步骤。
[0027] 根据本发明第五方面任一项的制备方法，其具体包括以下步骤：
[0028] 1)将本发明第一方面的核酸分子的核苷酸序列克隆入表达载体中，得到重组表达 载体，优选地，所述重组表达载体是在载体pTGS-FRT-DHFR的基础上改造获得，优选地，所 述改造是指去除潮霉素选择标签，并加入谷氨酰胺合成酶表达盒子；
[0029] 2)将重组表达载体转入宿主细胞，例如CHO-Kl细胞中，得到重组宿主细胞，优选 地，所述宿主细胞是经过目标培养基驯化后的CHO-Kl细胞；
[0030] 3)将步骤2)获得的重组宿主细胞在目标培养基中进行培养，获得能够高效表达抗 体的单克隆细胞株。
[0031] 4)逐步放大培养步骤3)获得的单克隆细胞株，收获培养上清；
[0032] 5)将步骤4)获得的培养上清进行纯化，获得本发明第四方面任一项的抗HER2人 源化抗体。
[0033] 在本发明的实施方案中，所述重组表达载体是GS载体。
[0034] 在本发明的实施方案中，所述目标培养基是指无血清、化学成分确定的动物细胞 培养基。
[0035] 在本发明的实施方案中，所述目标培养基中含有Pluronic F-68、葡萄糖、培养基 干粉Maxgrow202、碳酸氢钠、氯化钠和HEPES ;
[0036] 在本发明的具体实施方案中，所述目标培养基的成分为PluronicF-681. Og/L、葡 萄糖8. 8g/L、培养基干粉Maxgrow2027. 44g/L、碳酸氢钠 I. 898g/L、氯化钠3. 47g/L和IM HEPES15ml/L，并调节pH至7. 0 ± 0. 1。在本发明的具体实施方案中，所述目标培养基用于细 胞驯化和种子培养。在本发明的实施方案中，所述目标培养基为表1-1的种子培养基。
[0037] 在本发明的实施方案中，所述驯化培养的方法为本领域所公知，例如先将细胞在 含有10%小牛血清的目标培养基中贴壁培养，按照50%的比例逐级去除血清，例如小牛血清 浓度从10%逐级降至5%、2. 5%、1. 25%、直至完全不含血清，然后继续传代数次，至宿主细胞 完全悬浮，成倍增长稳定，最终获得能够在目标培养基中生长的稳定宿主细胞。
[0038] 在本发明的实施方案中，步骤3)的具体方法为：将步骤2)获得的重组宿主细胞在 目标培养基中进行培养，向培养基中加入适当浓度的MSX (例如75 μ M MSX)，在培养箱中培 养一段时间，挑选出可以在此培养基中存活并表达抗体的细胞，然后进行亚克隆筛选，获得 能够高效表达抗体的单克隆细胞株。
[0039] 在本发明的实施方案中，步骤4)的具体方法为：将能够高效表达抗体的单克隆细 胞株经过目标培养基多步扩大培养，培养基为生产培养基：种子培养基为1 :1，培养周期为 12-14天，培养第3、6、9天加入10%体积的流加培养基，培养结束后收获上清。
[0040] 在本发明的具体实施方案中，所述种子培养基即为目标培养基。
[0041] 在本发明的实施方案中，所述生产培养基中含有氢氧化钠、培养基干粉 Maxpr〇302、维生素 Β12、硫酸亚铁、磷酸二氢钠一水合物、葡萄糖、L-半胱氨酸盐酸盐一水 合物、Pluronic F-68、氯化钠、HC1、碳酸氢钠和HEPES。
[0042] 在本发明的具体实施方案中，所述生产培养基中含有氢氧化钠0. 8g/L、培养 基干粉Maxpro30211. 5g/L、lg/L维生素 B12贮存液（1-2) ml/L、10g/L硫酸亚铁贮存液 (0· 4-0. 6) ml/L、磷酸二氢钠一水合物0· 35g/L、葡萄糖8. 8g/L、L-半胱氨酸盐酸盐一水合 物（0· 3-0. 375)g/L、Pluronic F-681g/L、氯化钠 I. 55g/L、5M HC15. 6ml/L、碳酸氢钠 I. 22g/ L和IM HEP