gtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatg atctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggta cgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtca gcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctccca gcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccg ggaagagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagt gggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctc tacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctct gcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa (SEQ ID NO :2)，其中带有下划线的 序列为可变区序列。
[0079] 抗体MIL41的轻链氨基酸序列为：
[0080] DIQMTQSPS SLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAffYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGT DFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO ：3)；
[0081] 抗体MIL41的重链氨基酸序列为：
[0082] EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFT LSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO :4)。
[0083] 实施例2抗体MIL41基因的克隆
[0084] 实骀材料:
[0085] Phusion聚合酶、Taq DNA聚合酶、限制性内切酶、pGEM-T-easy载体、Pyrobest DNA polymerase均为NEB公司产品；
[0086] dNTP、DNA Marker 标准为 TaKaRa 产品；
[0087] DNA回收试剂盒为Qiagen公司产品；
[0088] Trans2_Blue感受态为全式金公司产品；
[0089] 小提中量质粒试剂盒（DP107-02)为天根生化公司产品；
[0090] 大提质粒试剂盒（DP117)为天根生化公司产品；
[0091] OPD为Sigma公司产品；
[0092] FITC标记的羊抗人抗体：为Pierce公司产品；
[0093] 引物设计为Biosun软件；
[0094] 引物合成（Genewiz),金唯智生物科技（北京）有限公司；
[0095] 基因测序由北京诺赛基因组研究中心有限公司完成。
[0096] 实骀方法和结果:
[0097] 通过PCR的方法合成抗体的轻重链可变区基因，即为MIL41抗体的轻重链可变区 基因。测序正确的克隆，装配表达质粒。使用PCR技术全合成MIL41/VH、MIL41/Vk基因片 段，并引入合适的酶切位点，在抗体轻链可变区基因5,和3,端引入ClaI和BsiwI位点，在 抗体重链可变区基因5,和3,端引入EcoR I和Nhe I位点。
[0098] 2. 1弓丨物设计
[0099] 根据基因全合成的原理，利用计算机辅助设计软件，设计引物，考虑引物的二级结 构、GC含量等相关参数。每条基因设计10条引物，分别编号为PI、P2、P3、P4、P5、P6、P7、 P8、P9和P10,用于基因全合成。
[0100] 2. 2全基因合成
[0101] 1)引物合成后以无菌水稀释，方法如下：
[0102] a)取引物管12000rpm离心2min，引物按100μΜ的浓度稀释，-20°C保存；
[0103] b)取少量引物P2~P9混合成终浓度为10 μ M作为使用液；
[0104] c)取少量引物Pl和PlO混合稀释成终浓度为10 μ M作为使用液Ρ1/Ρ10 ;
[0105] 2)基因全合成，米用Pyrobest DNA polymerase,方法如下：
[0106] a)取1 μ L P2~P9混合引物作为模版，配制如下Overlap PCR体系：
[0107] P2~P9混合引物 ΙμL dNTP 3 μ L IOX Buffer 5μL Pyrobest DNA polymerase 0.3 μ L P1/P10引物 4 μ L(引物先不加 )
[0108] 无菌水补足总体积为50uL
[0109] b)将以上PCR体系进行如下反应：
[0110]
【主权项】
1. 编码抗J1ER2人源化抗体的核酸分子，其轻链的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，其 重链的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。
2. 重组载体，其含有权利要求1的核酸分子。
3. 重组细胞，其含有权利要求2的重组载体； 优选地，所述细胞为哺乳动物细胞，例如为CHO-Kl细胞； 进一步优选地，所述哺乳动物细胞为经过目标培养基驯化后的细胞。
4. 抗HER2人源化抗体，其由权利要求1的核酸分子、权利要求2的重组载体、或者权利 要求3的重组细胞制备得到。
5. 权利要求4的抗HER2人源化抗体，其中所述VHS异构体的含量为0~0. 4%，例如为 0 ~0? 2%、0 ~0? 1%。
6. 权利要求4的抗HER2人源化抗体，其中所述NGHC异构体的含量为0. 2%~1%，例如 为 0? 3% ~0? 75%。
7. 权利要求5或6的抗HER2人源化抗体的制备方法，其包括利用权利要求1的核酸分 子、权利要求2的重组载体、或者权利要求3的重组细胞制备该抗HER2人源化抗体的步骤。
8. 权利要求7的制备方法，其具体包括以下步骤： 1) 将权利要求1的核酸分子的核苷酸序列克隆入表达载体中，得到重组表达载体，优 选地，所述表达载体是在载体pTGS-FRT-DHFR的基础上改造获得，优选地，所述改造是指去 除潮霉素选择标签，并加入谷氨酰胺合成酶表达盒子； 2) 将重组表达载体转入宿主细胞，例如CHO-Kl细胞中，得到重组宿主细胞，优选地，所 述宿主细胞是经过目标培养基驯化后的CHO-Kl细胞； 3) 将步骤2)获得的重组宿主细胞在目标培养基中进行培养，获得能够高效表达抗体的 单克隆细胞株； 4) 逐步放大培养步骤3)获得的单克隆细胞株，收获培养上清； 5) 将步骤4)获得的培养上清进行纯化获得权利要求4 一 6任一项的抗HER2人源化抗 体；优选地，所述纯化包括亲和层析、阴离子交换层析和阳离子交换层析。
9. 组合物，其含有权利要求4 一 6任一项的抗HER2人源化抗体； 优选地，其中VHS异构体的含量为0~0. 4%，例如为0~0. 2%、0~0. 1% ;和/或 优选地,其中NGHC异构体的含量为0. 2%~1%，例如为0. 3%~0. 75%。
10. 权利要求1的核酸分子、权利要求2的重组载体、或者权利要求3的重组细胞在制 备抗HER2人源化抗体中的用途； 其中所述抗J1ER2人源化抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示，其重链可 变区的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示。
11. 权利要求4 一 6任一项的抗HER2人源化抗体在制备抗肿瘤药物中的用途；优选地， 所述肿瘤例如为乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、食道癌或胃癌。
【专利摘要】本发明涉及一种抗HER2人源化抗体，以及编码所述抗HER2人源化抗体的核酸分子。本发明还涉及所述抗HER2人源化抗体的制备方法，所述核酸分子用于制备所述人源化抗体的用途，以及所述人源化抗体用于制备抗肿瘤药物的用途。与现有的抗HER2人源化抗体相比，本发明的抗HER2人源化抗体纯度更高，更有利于保证大规模生产中抗体产品的品质。
【IPC分类】C12N15-85, C07K16-28, C12N15-13, C12N5-10, A61P35-00, A61K39-395
【公开号】CN104726462
【申请号】CN201310711457
【发明人】耿树生, 叶培, 盛晓丽, 刘旭, 赵健, 谢波
【申请人】北京天广实生物技术股份有限公司
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2013年12月20日