专利名称：超人源化抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及将抗体人源化的方法，特别涉及通过生成含有来自非人抗体的CDR序 列以及人抗体的构架序列(framework sequences)的嵌合抗体将抗体人源化的方法，更特 别涉及选择用于进行人源化的适宜的人抗体构架序列的方法，以及仍更特别涉及用非人抗 体的规范CDR结构类型(canonical CDR structure types)与人抗体的胚系的规范CDR结 构类型的比较作为选择用于人源化抗体的适宜的人构架序列的基础。
背景技术：
抗体是天然蛋白质，是脊椎动物免疫系统对外来物质(抗原)的反应形式，主要用 于对抗感染。一个多世纪以来，已经在人工条件下在动物体内诱导出抗体并收集用于疾病 的治疗或诊断，或用于生物学研究。每一个单个的产生抗体的细胞产生在化学上具有明确 组成成分的单一类型的抗体，然而，直接从反应于抗原接种的动物血清中获得的抗体事实 上包括各不相同的一群产生抗体的细胞所产生的一群不完全一样的分子(也就是，多克隆 抗体)。杂交瘤技术提供了繁殖单个产生抗体的细胞无数代的方法以及识别能与特殊抗 原相互作用的产生抗体的细胞克隆的筛选方法。本技术的发展容许生成无限量的具有几乎 任何所需的抗原特异性的结构完全一致的抗体。这些抗体通常被称作为单克隆抗体，并且 绝大多数都来源于啮齿动物。对单克隆抗体基因的测序可以定义抗体的一级氨基酸结构。重组DNA方法学的出现使得可以对抗体基因进行结构改造并产生具有杂交瘤技 术所不能获得的特性的经改造的抗体分子。在治疗领域，该方法学的一个目标是通过改造 啮齿动物的单克隆抗体的一级氨基酸结构以减少这些抗体在人体内的免疫原性。减弱治疗 性抗体的免疫原性是合乎需要的，因为所诱导的免疫反应可引起患者的多种副作用，范围 从治疗性抗体被加速清除并因此造成的作用丧失，到最极端的致死性过敏反应。减弱外源性单克隆抗体的免疫原性的一个策略是用人源的类似功能区取代单克 隆抗体的轻链和重链恒定区，只留下完整的外源性抗体的可变区。轻链和重链的可变区负 责抗体与抗原之间的相互作用。连接可变区与恒定区的铰链区位于远离抗原结合部位的区 域，因此可变区与恒定区之间的铰链区通常不干扰抗原结合。小鼠可变区连接到人恒定区 的嵌合分子通常与嵌合分子所起源的小鼠抗体以相同的亲和常数与抗原结合。这些嵌合 抗体比它们的完全的鼠对应物在人体内具有更少的免疫原性。虽然如此，保留有整个鼠可变区的抗体仍在相当一部分患者中引发了免疫反应。例如，INFLIXIMAB ，一种被广泛处方 的被认为是安全的嵌合抗体，它在47个克隆病患者的7个患者中诱导了人抗嵌合抗体反 应(Rutgeerts，P.，et al (1999)Efficacy and safety of retreatment with anti-tumor necrosis factor antibody(INFLIXIMAB)to maintain remission in Crohn' sdisease. Gastroenterology 117，761-769)0人会发动对整个鼠可变区的免疫反应是在预料之中的，因此甚至在报道这些标准 嵌合抗体的临床试验之前已经开始获得具有更多人特征的可变区的尝试。常被称为“人源 化”的方法的一个策略旨在通过重组地构建具有鼠与人特征的抗体可变区将鼠单克隆抗体 的可变区转变为更多的人的形式。人源化策略依照于对抗体结构数据的一些共识。首先， 可变区含有在同一物种内是保守的而在进化遥远的物种之间例如鼠和人之间是不同的肽 序列的毗邻束(contiguous tracts) 0第二，其它毗邻束在同一物种内是不保守的，而且甚 至在同一个体的产生抗体的细胞之间甚至都不同。第三，抗体与抗原的接触主要通过可变 区的非保守区域发生。第四，抗体可变区的分子结构在不同物种之间是十分相似的，因此只 根据位置而无需试验数据，就可以定义不同物种之间的相应的氨基酸残基的位置。人源化策略的前体是用在人抗体的相应位置上发现的残基取代鼠序列的特征性 氨基酸残基将减少所形成的抗体在人体内的免疫原性。然而，不同物种之间的序列取代常 造成抗体与抗原的结合能力的下降。因此人源化的技术在于平衡为减少免疫原性而对原始 鼠序列的取代与人源化抗体所需的保持治疗有用的足够多的抗原结合性。用两种方法已经 达到这种平衡。在一个方法中，如Studnicka 的美国专利 No. 5,869,619 以及 Padlan (1991)A possible procedure for reducing the immunogenicity of antibody variable domains while preserving their ligand binding properties, Molecular Immunology 28 489-498所例示的，用于特征性取代鼠可变区残基的人残基被认为或被预计是(i)在与抗 原的相互作用上不发挥重要的化学作用，以及(ii)定位于延伸到溶剂的侧链上，因此，远 离于抗原结合位点的外在残基被人源化，而内在残基、抗原结合残基以及形成可变区之间 的接触面的残基仍是鼠的。它的方法的一个缺点是需要相当多的试验数据来确定残基在抗 原结合上是否发挥不重要的化学作用或残基在特殊的三维抗体结构上是否位于溶剂中。在一个更常用的方法中，如Winter的美国专利No. 5，225，539以及Jones et al (1986)Replacing the complementarity determining regions in ahuman antibody with those from a mouse,Nature 321 :522_525所例示的，被认为是保守的鼠可变区肽序 列的毗邻束被人抗体的相应的毗邻束所取代。在这个更常用的方法中，除了涉及抗原结合 的非保守区域外，所有可变区残基都被人源化。为了确定用于取代的适宜的毗邻束，Winter 和Jones等(1986)利用了 Wu和Kabat (1970)先前已经开发的抗体可变区序列的分类。Wu和Kabat首创对抗体肽序列的线性排列，并且他们在这方面的贡献是多方面 的首先，通过对可变区之间的序列相似性的研究，他们识别了在所有脊椎动物物种的所有 抗体之间是更大或更少程度同源的相应的残基，因为这些残基采用了同样的三维机构、起 到了同样的功能作用、与周围残基同样的相互作用以及存在于相同的化学环境中。第二，他 们创造了肽序列编号系统，其中同源的免疫球蛋白残基被赋予相同的位置号码。本领域人 员不依赖于除外序列本身的其它任何的试验数据就可以明确地指定任何可变区序列的现在常被称为Kabat编号的号码。第三，对于每个Kabat编号的序列位置，Kabat和Wu计算变 异性，它指的是将可变区序列线性排列时的少数或许多可能的氨基酸的所见。他们识别出 隐藏于四个较少变异的毗邻区域内的三个高变异性的毗邻区域。其它研究者先前已经注意 到近乎在这些区域(高变区)的变异性并断言高变区代表着用于抗原结合的氨基酸残基。 Kabat和Wu正式区分构成这些可变束的残基，并将它们称为“互补决定区(OTR) ”，指的是抗 体与抗原之间的化学互补性。剩余的较少变异功能区，现在被命名为“构架区”的作用是可 变区的三维折叠，而不是抗原识别。第四，Kabat和Wu建立了抗体肽和核酸序列的公用数 据库，该数据库被持续地维护并为本领域人员所熟知。Wrinter和Jones使用Kabat分类所阐述的人源化方法生成了一种嵌合抗体，其包 含来自一种抗体的CDR以及另一种在物种起源、特异性、亚型或其它特性上都有所不同的 抗体的构架区。然而，构架区没有被赋予任何特殊的序列或特性，事实上，Winter认为任何 的构架组都可以与任何的CDR组结合。目前已经认识到构架序列对于形成保持较好的抗原 结合所必须的抗体可变区的三维结构是至关重要的。因此，Winer和Jones所描述的常用 的人源化方法的缺点是频繁地生成无活性抗体，因为这些参考文献没有提供在许多可能的 人构架序列中合理地选择出那些最可能支持非人抗体的特殊CDR区域所需的抗原结合的 构架序列所必需的信息。本领域随后的发展是在Winter的范围内的改进，以解决在一些人 源化抗体中所观察到的相对于相应的鼠抗体的对抗原的抗体亲抗原性(avidity)的丢失 (抗体亲抗原性是在接近化学平衡的条件下，在存在抗原时，对抗体在游离形式与抗原结合 形式之间的分布的定量测定。对于溶液中的非多价结合作用的反应，抗体亲抗原性与亲和 力一样就是生化平衡常数)。Queen等的美国专利No. 5，693，761阐述了一种对Winter的将抗体人源化的改进 方法，所依据的前提是把抗体亲抗原性的丢失归结于人源化构架中的结构基序的问题，它 因为空间或其它的化学不兼容性而干扰CDR折叠成在鼠抗体中所见的可结合的构象。为了 解决这个问题，Queen所使用的人构架序列在线性肽序列上非常同源于被人源化的鼠抗体 的构架序列。因此，Queen的方法集中于比较物种之间的构架序列。通常将所有可获得的人 可变区序列与特殊的鼠序列进行比较，并计算出对应的构架残基之间的相同性百分比。选 择具有最高百分比的人可变区用作为提供进行人源化操作的构架序列。Queen也认为在人 源化构架中保留有鼠构架的对支持CDR的可结合构象是关键的特定氨基酸残基是重要的。 用分子模型评价潜在的重要性。所保留的候选的残基通常是那些在线性序列上邻近于CDR 或物理地在任何⑶R残基的6A以内的残基。在其它方法中，一旦得到低抗体亲抗原性的人源化构建体，如Riechmarm等 (1988)等描述的通过将单个残基恢复为鼠序列并测定抗原结合性，可以试验性地确定出特 殊的构架氨基酸残基的重要性。另一个用于识别构架序列的氨基酸重要性的实例方法是 Carter等的美国专利No. 5，821，337以及Adair等的美国专利No. 5，859，205所阐述的方 法。这些参考文献阐述了构架中的特殊的Kabat残基位点，人源化抗体中的这些残基可能 需要用相应的鼠的氨基酸取代以保留抗体亲抗原性。Queen的改进方法以及Ricechmarm、 Carter和Adair的方法的缺点之一都是需要非常大量的人构架序列进行比较和/或指引， 因为所保留的关键氨基酸不能完全充分地预测出功能性。因此，所构建形成的部分是人和 部分是鼠的构架仍经常表现出人免疫原性或抗原结合性的减弱，所以需要大量重复的构架
6构建以获得用于治疗的适宜的构架。Padlan 等(1995)Identification of specificity-determining residues inantibodies, FASEB J. 9 133-139 ；以 及 Tamura 等(2000)Structural correlates of an anti-carcinoma antibody :identification of specificity-determining residues (SDRs) and development of a minimally immunogenic antibody variant by retention of SDRs only. J. Immunol. 164 :1432-1441 例举了对 Winter 的第二种类型的改 进方法。这些参考文献共有的前提是增加人源化抗体中的人特征性序列的比例将减弱抗体 的免疫原性，并因此阐述了移植部分CDR序列的方法。对抗体-抗原复合物的三维结构的 测定表明许多被指定为Kabat和Wu所定义的CDR的残基位点很少直接参与抗原结合。这 些参考文献显示移植CDR残基亚组将使得人源化抗体具有足够高的抗原结合性。然而，仍 需要人源化的构架序列，这些参考文献没有说明用于选择足够多的与给定的鼠CDR组一起 使用的人构架序列的方法。因此，在本领域需要一种将抗体人源化的方法，它能可靠地识别支持非人的CDR 区的适宜的人构架序列，并提供保留有高抗原结合性以及人体内低免疫原性的人源化抗 体，且不需要对构架序列的直接比较，不需要确定构架中的关键重要的氨基酸残基，以及不 需要重复η次构建来获得具有适宜的治疗特性的人源化抗体。
发明内容
本发明通过提供不需要比较非人与人抗体之间的构架序列而制备具有高亲和力 以及低免疫原性的人源化抗体的方法满足了这种需求，以及也提供了所制备的人源化抗 体。在此所提供的方法不是依赖于将人构架序列作为分析点，而是依赖于比较非人抗体的 规范CDR结构类型和人抗体的CDR结构类型，尤其是人胚系序列所编码的人抗体，识别出从 中可以得到适宜的人构架序列的候选的人抗体序列。更具体地，提供了一种制备人源化抗体的方法，包括获得非人的成熟抗体基因编 码的被研究的可变区的肽序列，以及鉴别出非人抗体可变区内的至少两个CDR的一个第一 组规范CDR结构类型。然后也得到人抗体的人抗体可变区的肽序列文库。在一个优选的实 施方案中，文库包括胚系核酸片段编码的人胚系可变区序列。然而，在其它的实施方案中， 文库可以包括成熟的人抗体序列。在这两种情况中，方法都包括鉴别出人可变区序列文库 内的每个序列的至少两个CDR的规范CDR结构类型(也就是，一个第二组规范CDR结构类 型)。通过比较第一组规范⑶R结构类型与第二组规范⑶R结构类型(也就是比较在可变 区内的相应位点的小鼠的规范CDR结构类型与人的规范CDR结构类型)并选择那些其中在 非人与人的可变区内的相应位点的CDR序列的第二组规范CDR结构与第一组规范CDR结构 类型一样的人序列，从该文库中选择出候选的序列的亚组。本方法用这些候选的人可变区 序列作为构建嵌合分子的基础，嵌合分子包括结合了候选的人可变区序列的构架区的至少 两个非人可变区的CDR序列(例如小鼠CDR)。该构建体的结果是嵌合蛋白，该蛋白包括在 可变区的相应位点取代了每一个人CDR序列的每一个非人CDR序列，如此使得嵌合抗体的 构架序列与候选的人构架序列的差异不超过10个氨基酸。在特定的实施方案中，嵌合抗体 的构架序列与人构架序列的差异不超过5个氨基酸。在其它实施方案中，嵌合抗体的构架 序列与人构架序列的差异不超过2个氨基酸。在绝大多数实施方案中，构建嵌合抗体分子包括构建编码嵌合抗体序列的核酸序列。在典型的实施方案中，本方法进一步包括根据评级标准通过比较非人CDR序列与 相应的人CDR序列的位点对位点的氨基酸残基的相似性，对候选的人序列亚组的成员进行 评级。在特定的实践中，人序列的候选的序列只包括前25%的经评级的成员。在一些实施 方案中，评级标准包括非人与人CDR序列之间在至少一个CDR、或至少两个CDR、或最常见的 每个相应的CDR的相应残基位点上的氨基酸相同性的积分。在其它实施方案中，评级标准 包括非人与人CDR之间在至少一个、至少两个或每个相应的CDR的相应残基位点上的氨基 酸同源性的积分。仍在其它实施方案中，积分标准同时包括至少一个、至少两个或每个相应 的CDR的氨基酸相同性积分以及氨基酸同源性的积分。使用不同体系所定义的CDR都可以 实践本方法。例如，在特定的实施方案中，CDR是Kabat定义的CDR，在其它实施方案中，CDR 是Chothia定义的CDR袢。本方法不局限于严格地使用非人源的精确的CDR序列或来自成员组的人构架的 精确序列。在特定的实施方案中，方法也可以包括用不同的氨基酸取代非人CDR序列中的 至少一个氨基酸，但是设定在任何一个非人的轻链⑶Rl、轻链⑶R2、轻链⑶R3、重链⑶Rl或 重链⑶R3上的取代不超过4个残基，以及在非人的重链⑶R2上的取代不超过10个氨基酸。 在其它的实施方案中，方法也包括用不同的氨基酸残基取代人构架序列上的至少一个但不 超过10个的氨基酸残基。本方法也承认在某些时候非人可变区可以包括人可变区所缺少的规范类型的CDR 序列。对于三个非人CDR的每一个都是轻链CDR的情况，如果三个非人CDR序列的其中一 个序列是人可变区序列文库中所缺少的规范结构类型，那么选择人序列包括，在相应位点 选择与所缺少的非人CDR类型具有不同规范类型的CDR的人可变区序列，条件是该不同的 规范人CDR类型的长度比所缺少的非人CDR的规范CDR结构类型的长度短或长不超过2个 氨基酸。通常如果缺少的CDR序列是规范类型1，那么可选择在相应的位点为规范类型2的 CDR的人序列，或如果非人的CDR序列为规范类型5，那么可选择在相应的位点为规范类型 4或3的⑶R的人序列。在绝大多数实施方案中，非人可变区是鼠可变区。同样的，在绝大多数实施方案 中，人可变区序列的文库包括作为人构架来源的人￥1；、￥;^、￥11、1、1或夂序列。在绝大多 数实施方案中，方法包括通常用Vk和Vh序列的人构架装配具有嵌合的可变轻链及嵌合的 可变重链的嵌合抗体。在典型的实施方案中，嵌合的可变轻链和嵌合的可变重链被合成为 Fab片段、或(Fab)，2分子、或单链Fv分子、或者可变轻链和可变重链与人抗体的恒定区一 起被装配形成完整的抗体。本方法适用于通过制备含有结合了被研究的物种的CDR的目标物种的构架序列 的嵌合抗体，将任何被研究的物种的被研究的抗体序列转化成适合于在目标物种中使用的 具有更弱免疫原性的形式。在这些情况中，前述的方法在执行技术上是一样的，其中可变区 可来自任何被研究的物种以及目标可变区可以来自任何被应用抗体的目标物种。因此，例 如，在不同的实施方案中，可以将被研究的抗体与牛、猪、鼠或马来源的构架序列嵌合，相应 地形成牛源化、猪源化、鼠源化或马源化抗体。在另一方面，本发明提供了包含根据所述的方法制备的嵌合抗体分子的组合物。 因为，方法利用了鉴别与被研究的⑶R序列结合的适宜的目标构架序列的新方法，所以制
8备得到的嵌合抗体也是新的。因此，在此提供了一种人源化抗体，它包括一个含有至少两个 邻近融合于(fused adjacent to)人可变区构架序列的非人⑶R序列的嵌合抗体可变区。 该人构架序列选自一个构架序列亚组，所述构架序列的特点是与人抗体可变区的构架序列 有着不超过10个氨基酸残基的差异，所述人抗体可变区在嵌合抗体与人抗体之间的至少 两个相应位点上具有至少两个与非人CDR序列相同的规范结构类型的人CDR序列。非人可变区⑶R通常来自小鼠。人可变区序列通常是VK、VA、VH、JH、Jk或夂序 列。最典型地，嵌合抗体包括每一个可变轻链以及可变重链的嵌合抗体序列。在常见实施方 案中，嵌合的可变轻链和嵌合的可变重链形成Fab片段、或(Fab)’ 2分子、或单链Fv分子、 或者可变轻链和可变重链与人抗体的恒定区一起被装配形成完整抗体的形式。最典型地， 人可变区序列是来自人胚系可变区片段的序列。在其它实施方案中，人可变区序列是来自 人成熟抗体的序列。在优选的实施方案中，人源化抗体与它的抗原的解离常数至少是106Μ_\优选至少 IO7Mi以及更优选至少IO8MA当施用于人后，人源化抗体通常不引发免疫反应。举例说明 本发明的具体的实施方案包括与蝎毒抗原结合、与人CD28受体结合、与人溶菌酶结合、与 人谷氨酸脱羧酶(GAD65)结合的人源化抗体。
图1描述了人胚系Vh基因片段文库。图2描述了人胚系Vk基因片段文库。图3描述了小鼠Dl. 3 (抗鸡溶菌酶)抗体可变轻链序列的一部分以及所选定的在 相应位点上具有与鼠Dl. 3轻链序列同样类型的规范CDR的人胚系Vk可变区序列的亚组。 用Dl. 3CDR与人CDR之间的氨基酸相似性对亚组评级，并首先描述了评级最高的序列。图4描述了鼠Dl. 3抗体可变重链序列的一部分以及所选定的具有与Dl. 3同样类 型的规范CDR的人胚系Vh可变区序列的亚组。用类似于图3的相应的CDR的氨基酸序列 的相似性对亚组评级。图5描述了人源化Dl. 3抗体的嵌合Vk可变区以及Vh可变区的氨基酸序列，举例 说明了本发明的一个方面。图6描述了编码(和表达)图5的人源化嵌合Dl. 3抗体的DNA构建体的核酸序 列，举例说明了本发明的另一个方面。图7是举例说明人源化Dl. 3抗体的抗原结合性的图表，它具有的亲和常数大于 Ι ΛΤ1，举例说明了本发明的一个实施方案。图8描述了鼠的被称为9. 3的抗人CD28抗体的可变轻链序列的一部分，以及所选 定的在相应的位点上具有与鼠9. 3可变轻链序列同样类型的规范CDR的人胚系Vk可变区 序列的亚组，用与图3类似的氨基酸序列的相似性对亚组评级。图9描述了鼠9. 3抗体的可变重链序列的一部分，以及所选定的在相应的位点上 具有与鼠可变重链序列同样类型的规范⑶R的人胚系Vh可变区序列的亚组，也用氨基酸序 列的相似性评级。图10描述了具有嵌合可变重链及可变轻链的人源化的抗人⑶28 (Hu. 9. 3) Fab片 段，举例说明了本发明的另一个实施方案。
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图11是举例说明Hu. 9. 3Fab片段的抗原结合性的图表，它的亲和常数大于lOl1， 举例说明了本发明的一个实施方案。图12描述了具有嵌合的可变重链及可变轻链的人源化抗蝎毒素Fab片段，举例说 明了本发明的一个实施方案。图13描述了具有嵌合的可变重链及可变轻链的人源化抗入谷氨酸脱羧酶 (GAD65)Fab片段，举例说明了本发明的另一个实施方案。图14是举例说明人源化抗GAD Fab片段的抗原结合性的图表，它的亲和常数大于 IO11M-1,举例说明了本发明的一个实施方案。
具体实施方案在下面的描述中，对各种参考文献的引用将有助于本领域人员完全理解并实施发 明。因此，将下面描述中所引用的每篇参考文献的全部内容一起并入本文作为参考。为了 更好地帮助理解发明的各个实施方案，解释在此使用的特定术语的意义可能是有帮助的。“成熟抗体基因”是编码例如淋巴细胞比如B细胞、杂交瘤或任何已经经历成熟过 程的产生抗体的细胞所表达的免疫球蛋白的基因序列，因此表达的是特异免疫球蛋白。该 术语包括成熟基因组的核酸序列、cDNA的核酸序列或其它编码这些成熟基因的核酸序列， 这些核酸序列已经被分离并/或重组加工到其它细胞类型进行表达。成熟抗体基因已经经 历各种成熟及重排，使得能从结构上将它们与除淋巴细胞以外的所有细胞所编码的抗体基 因区别开来。人、啮齿动物以及许多其他哺乳动物的成熟基因对于抗体轻链是由V与J基 因片段融合形成，而对于抗体重链是由V、D与J基因片段融合形成。许多成熟抗体基因获 得融合后的点突变，一些点突变增加了抗体蛋白对特异抗原的亲和力。“胚系抗体基因”或基因片段是由非淋巴细胞编码的免疫球蛋白序列，它没有经历 导致表达特异免疫球蛋白的遗传学重排及成熟的成熟过程。本发明的各种实施方案所提 供的一个优点来源于一种认识，那就是胚系抗体基因比成熟抗体基因更多地保留了动物物 种个体的特征性的重要氨基酸序列结构。因此当被治疗性应用于该物种时，更少地被该物 种识别为外源物质。图1和图2显示了编码人可变重链区(Vh)以及可变轻链区(Vk)抗体 (也就是，免疫球蛋白)的人胚系抗体基因的肽序列。这些序列列表中的每一个序列都举例 说明了人抗体基因文库，特别是人胚系抗体基因文库。“CDR”是抗体可变序列中的互补决定区。在每个可变重链和可变轻链序列中都各 有三个⑶R，被称为每个可变区的⑶R1、⑶R2和⑶R3。依照不同体系已经不同地定义这些 CDR的准确界限，然而，所有的CDR都有重叠残基，它们构成了可变序列内所谓的“高变区”。 Kabat描述的系统(CITE)不仅提供了明确的适用于抗体的任一可变区的残基编号系统，也 提供了定义了这三个⑶R的准确的残基界限。这些⑶R可以被称作为Kabat⑶R。Chathia 和合作者(CITE)发现Kabat⑶R内的某些亚部分采用几乎完全一样的构架构象，尽管它们 在氨基酸序列水平上有着很大的不同。这些亚部分被称作为Li、L2和L3或HI、H2和H3， 其中“L”和“H”相应指的是轻链和重链区。这些区域可以被称为Chothia⑶R，它们具有 与Kabat⑶R有重叠的界限。表I举例说明了根据Kabat残基编号系统Chotia与Kabat ⑶R的重叠残基编号。表 I
权利要求
一种嵌合抗体分子，包括重链目标可变区，所述重链目标可变区含有三个移植到目标可变区构架序列中的来自重链被研究可变区的CDR序列，其中所述目标可变区构架的特征在于与所述被研究可变区构架序列具有不超过10个氨基酸残基的差异，并在相应位置上有两个目标可变区CDR与所述被研究可变区CDR具有相同的规范结构类型，条件是所述重链目标可变区的CDR2的残基61 65是来自所述重链被研究可变区的残基61 65；和轻链目标可变区，所述轻链目标可变区含有三个移植到目标可变区构架序列中的来自轻链被研究可变区的CDR序列，其中所述目标可变区构架的特征在于与所述被研究可变区构架序列具有不超过10个氨基酸残基的差异，并在相应位置上有两个目标可变区CDR与所述被研究可变区CDR具有相同的规范结构类型，其中所述嵌合抗体分子的CDR边界和残基编号是通过Kabat定义的。
2.一种嵌合抗体分子，包括重链目标可变区，所述重链目标可变区含有三个移植到目标可变区构架序列中的来自 重链被研究可变区的CDR序列，并在相应位置上有两个目标可变区CDR与所述被研究可变 区CDR具有相同的规范结构类型，条件是所述重链目标可变区的CDR2的残基61-65可以是 来自所述重链被研究可变区的残基61-65，且构架序列的残基27-30可以是来自所述被研 究可变区的构架序列的残基27-30 ；和轻链目标可变区，所述轻链目标可变区含有三个移植到目标可变区构架序列中的来自 轻链被研究可变区的CDR序列，并在相应位置上有两个目标可变区CDR与所述被研究可变 区CDR具有相同的规范结构类型，其中所述嵌合抗体分子的CDR边界和残基编号是通过Kabat定义的。
3.权利要求2的嵌合抗体分子，其中所述被研究可变区是非人可变区。
4.权利要求2的嵌合抗体分子，其中所述非人可变区是小鼠的可变区。
5.权利要求3的嵌合抗体分子，其中所述目标可变区是人可变区。
6.权利要求5的嵌合抗体分子，其中所述人可变区构架序列选自由Vk、νλ、VH、JH、Jk 和Ja序列所组成的组。
7.权利要求5的嵌合抗体分子，其同时包含嵌合可变轻链区和嵌合可变重链区。
8.权利要求7的嵌合抗体分子，其中将所述嵌合可变轻链区和嵌合可变重链区装配形 成选自Fab片段、(Fab)，2分子和单链Fv分子中的一种分子。
9.权利要求2或5的嵌合抗体分子，其进一步包括人抗体恒定区。
10.权利要求5的嵌合抗体分子，其中所述候选人可变区由人胚系可变区基因编码。
11.权利要求5的嵌合抗体分子，其中所述候选人可变区是来自人成熟抗体的序列。
12.权利要求5的嵌合抗体分子，其中所述分子与其抗原的解离常数至少为IO6M-1或至 少为IO7M.1或至少为IO8M4。
13.权利要求5的嵌合抗体分子，其中当所述分子被施用于人体时不会引发免疫反应。
14.权利要求5的嵌合抗体分子，其中所述分子结合人CD28抗原。
15.权利要求5的嵌合抗体分子，其中所述人可变区的构架序列与所述候选人抗体可 变区的构架序列的差异不超过5个氨基酸残基。
16.权利要求5的嵌合抗体分子，其中所述人可变区的构架序列与所述候选人抗体可变区的构架序列的差异不超过2个氨基酸残基。
17.权利要求4的嵌合抗体分子，其中所述非人CDR序列的至少一个氨基酸残基被不同 的氨基酸取代，条件是对于非人轻链CDRl，不超过4个残基被取代，对于非人轻链CDR2，不超过4个残基被取代，对于非人轻链CDR3，不超过4个残基被取代，对于非人重链CDRl，不超过4个残基被取代，对于非人重链CDR3，不超过4个残基被取代，以及对于非人重链CDR2，不超过10个残基被取代。
18.权利要求5的嵌合抗体分子，其中所述的人构架序列的至少一个但不超过10个氨 基酸残基被不同的氨基酸残基取代。
19.权利要求5的嵌合抗体分子，其中所述嵌合抗体可变区含有移植到所述的人可变 区构架序列中的来自被研究的非人可变区的三个非人CDR。
20.权利要求5的嵌合抗体分子，其中所述嵌合抗体可变区含有移植到所述的人可变 区构架序列中的来自被研究的非人可变区的三个非人轻链CDR序列，且条件是如果所述三 个非人CDR序列中的一个序列与所述非人CDR序列在相应的CDR位点不具有相同的规范结 构类型时，那么所述候选的人可变区的不同的规范结构类型的长度长于或短于所缺乏的非 人规范结构类型均不超过2个氨基酸。
21.权利要求20的嵌合抗体分子，其中如果所缺乏的CDR序列为规范类型1，那么所 述候选的人可变区在相应位置上具有规范类型2的CDR ；或者，如果所述非人CDR序列为规 范类型5，那么所述候选的人可变区在相应位置上具有为规范类型4或3的CDR。
全文摘要
本发明公开了一种将抗体人源化的方法，其基于通过比较非人抗体的可变区的CDR序列的规范CDR结构类型与人抗体序列文库的相应CDR的规范CDR结构类型而自人抗体基因中选出可变区构架序列，优选的是胚系抗体基因片段。具有与非人CDR相似的规范CDR结构类型的人抗体可变区形成了一种成员人抗体序列的亚组，从中可选出人构架序列。通过人与非人CDR序列之间的氨基酸相似性可以对亚组成员进一步评级。选择评级靠前的人序列以提供构架序列，用于利用所选定的亚组成员人构架来构建嵌合抗体，该嵌合抗体用非人CDR对应物功能性取代了人CDR序列，因此提供了具有高亲和力及低免疫原性的人源化抗体，且不需要比较非人与人抗体之间的构架序列。本发明还公开了根据本发明方法制备的嵌合抗体。
文档编号C07K16/46GK101962408SQ201010236888
公开日2011年2月2日 申请日期2002年7月12日 优先权日2002年7月12日
发明者杰斐逊·富特 申请人:杰斐逊·富特