专利名称：人源化的FcγR小鼠的制作方法
技术领域：
本发明领域是缺失内源鼠Fe YR基因的遗传修饰的非人动物，包括内源Fe YR基因被人Fe Y R基因替代的遗传修饰的动物，包括能够表达至少2、3、4或5种功能性人低亲和力Fe Y R基因的小鼠，以及包括包含不表达内源低亲和力Fe Y R基因的免疫细胞的遗传修饰的小鼠。背景Fe受体(FcR)是在哺乳动物的进行免疫系统的多种功能的免疫系统的细胞的表面上发现的蛋白质。FcR以多种类型存在于多种细胞上，并且介导多种免疫功能，例如结合附着至被感染的细胞或侵袭性病原体的抗体、刺激吞噬细胞或细胞毒性细胞以通过抗体介导的吞噬作用或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)破坏微生物或感染的细胞。
ADCC是这样的过程免疫系统的效应细胞裂解被抗体结合的靶细胞。该过程依赖于对外源抗原或细胞的先行接触，从而产生抗体应答。ADCC可通过效应细胞例如天然杀伤(NK)细胞，通过效应细胞表面上表达的FcR对本身结合至外源抗原或细胞的抗体的Fe部分的结合来介导。由于FcR在免疫应答中起着中心作用，因此需要有共表达多种人FcR的有用的非人动物，包括共表达多种人低亲和力FcR的非人动物。存在对用于研究和阐明人疾病治疗(特别是抗肿瘤治疗和用于治疗自身免疫疾病的治疗)和药物开发(特别是在人抗体药剂的开发、设计和测试中)的人FcR功能和人的ADCC过程的非人动物模型。附图
概述图I是小鼠的野生型低未和力Fe Y R基因座的不意图，显不了小鼠Fe Y RIIB，Fe Y RIV和Fe Y RIII基因以及用于这些基因的靶向缺失的小鼠Fe Y R靶向载体，其包括侧翼连接有位点特异性重组位点的新霉素盒。图2显示了就B细胞(抗-⑶19)，NK细胞(抗_NKp46)和巨噬细胞(抗-F4/80)门控的脾细胞的直方图，包括野生型和低亲和力FcYRa链基因缺陷型小鼠(mFcYR K0)的内源mFc YRII和mFc YRIII基因的表达。图3A-3D显示了在人源化⑶20小鼠(h⑶20)和培育成Fe Y R敲除小鼠的人源化
0)20小鼠(hQ)20/Fc Y R K0)中在几个淋巴细胞区室(lymphocyte compartment):骨髓(图3A)、血液(图3B)、淋巴结(图3C)和脾(图3D)中利用具有小鼠Fe (Ab 168)或人Fe (Ab735)的人抗-人CD20抗体对B细胞进行的体内耗尽。对于每一个图，y_轴显示门控的B细胞(B220+/IgM+或B220+/CD19+)的百分比，x_轴显示每一个动物组的抗体剂量10mg/kg对照抗体(C), 2mg/kg人抗-人0)20抗体(2Ab和10mg/kg人抗-人0)20抗体(IOAb)。图4是低亲和力小鼠Fe Y R基因座的新霉素靶向缺失和用于将两个人低亲和力Fe Y R基因插入缺失的小鼠基因座的第二靶向载体的示意性描述，所述第二靶向载体包括侧翼连接有位点特异性重组位点的潮霉素盒。为了在血小板上表达hFc Y RIIA,使用了可操作地连接于人Fe Y RIIIA-IIA靶向载体的hFc Y RIIA基因的延长的启动子区域；为了阻止在血小板上表达hFc Y RIIA，删除或实质上删除所述启动子区域。
图5A显示针对NK细胞(抗-NKp46和巨噬细胞(抗-F4/80)的门控的脾细胞的直方图，包括野生型和人Fe Y RIIIA-IIA纯合子小鼠(人FcyRIIIA/FcyRIIA HO)的人FcyRIIIA的表达。图5B显示针对嗜中性粒细胞(抗_Ly6G)和巨噬细胞(抗-F4/80)的门控的脾细胞的直方图，包括野生型和人Fe Y RIIIA-IIA纯合子小鼠(人Fe yRIIIA/Fc YRIIA HO)的AFcyRIIA的表达。图6为包括两个低亲和力人Fe Y R基因(hFc Y RIIIA和hFc Y RIIA)的插入的低亲和力小鼠Fe Y R基因座的潮霉素靶向缺失以及用于插入3个额外的低亲和力人Fe Y R基因(hFc Y RIIB、hFc Y RIIIB和hFc y RIIC)的第三靶向载体和侧翼连接有位点特异性重组位点的新霉素盒的不意图。图7显示针对B细胞(抗-CD19)和嗜中性粒细胞(抗_Ly6G)的门控的脾细胞的直方图，包括野生型和人Fe Y RmA-IIlB-IIA-IIB-IIC纯合子小鼠(人Fe Y RIIIA/Fe Y RIIIB/Fc y RIIA/Fc y RIIB/Fc y RIIC HO)的人 Fe y RIIB 和人 Fe y RIIIB 的表达。 概述提供了遗传修饰的细胞、非人胚胎、非人动物以及用于产生和使用它们的方法和组合物。在不同的方面，非人动物包含人Fe Y R受体、内源低亲和力Fe Y R受体的缺失和/或人Fe Y R受体在内源小鼠低亲和力Fe Y R基因座上对内源Fe Y R受体的替代。在一个方面，提供了包含功能性FcR Y链的遗传修饰的细胞、非人胚胎和非人动物，其中所述细胞、胚胎和动物包含进一步修饰，包括用一个或多个低亲和力人Fe Y R基因序列(例如，选 S Fcy RIIA, Fe y RIIB、Fe y RIIC、Fe y RIIIA、Fe y RIIIB 及其组合)对低亲和力内源非人Fe Y R基因序列(例如，Fe Y RIIB、Fe Y RIV和FcyRIII)的替代。在一个实施方案中，细胞、非人胚胎和非人动物为鼠。在一个实施方案中，功能性FcRy链为小鼠FcRy链。在一个实施方案中，小鼠FcR Y链为对于小鼠、细胞或胚胎而言是内源性的FcR Y链。在一个实施方案中，细胞、胚胎和动物为小鼠，并且小鼠表达人低亲和力Fe YR受体的功能性α链和功能性内源小鼠Y链。在一个方面，提供了遗传修饰的小鼠，其中小鼠不表达选自Fe YRIIBa链、FcyRIVa链、FcYRIIIa链及其组合的内源α链；其中小鼠表达功能性内源小鼠Y链。在具体的实施方案中，小鼠不表达功能性Fe Y RIIB α链，不表达功能性FcyRIVa链，并且不表达功能性Fe Y RIII α链。在一个实施方案中，小鼠基因组包含内源FcYRIIBa链的缺失、内源Fe Y RIV a链的缺失和内源Fe Y RIII α链的缺失。在一个实施方案中，小鼠包括内源Fe YRIIBa链的缺失、内源Fe Y RIV α链的缺失和内源Fe YRIII α链的缺失，并且还包括与野生型小鼠对于相同抗原的能力相比较减小的对抗原产生免疫应答的能力。在一个实施方案中，减小的免疫应答包括减小的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在一个实施方案中，减小的免疫应答包括在细胞杀伤测定中减小的实现抗体依赖性NK细胞杀伤的能力。在具体的实施方案中，ADCC或抗体依赖性NK细胞杀伤的减小为至少50%，在一个实施方案中是至少75%，在一个实施方案中是至少90%。
在一个实施方案中，小鼠包含内源Fe Y RIIBa链的缺失、内源Fe Y RIV α链的缺失和内源Fe Y RIII α链的缺失，以及还包括在用抗原免疫后与野生型小鼠例如不包含缺失的相同或相似品系的小鼠相比较，增强的体液抗体应答。在一个实施方案中，增强的体液抗体应答为野生型小鼠的2倍。在一个实施方案中，增强的体液抗体应答为野生型小鼠的3倍。在一个实施方案中，增强的体液抗体应答为野生型小鼠的5倍。在一个实施方案中，增强的体液抗体应答为野生型小鼠的7倍。在一个实施方案中，增强的体液抗体应答为野生型小鼠的10倍。在具体的实施方案中，体液抗体应答通过每微克小鼠的血清蛋白特异性结合抗原(已用其免疫小鼠的)的抗体的微克数来测量。在一个实施方案中，增强的体液抗体应答是就野生型小鼠对其展示耐受性的抗原或野生型小鼠对其展示较弱或最小的体液免疫应答的抗原而言的。在具体的实施方案中，抗原是小鼠抗原。在具体的实施方案中，抗原是展示与小鼠蛋白具有至少约95%、96%、97%、98%或99%的同一性的人抗原。 在一个方面，提供了包含低亲和力人Fe Y Ra链基因对低亲和力小鼠Fe Y Rα链基因的替代的遗传修饰的小鼠，其中所述替代在内源小鼠Fe YRa链基因基因座上。在一个实施方案中，低亲和力小鼠Fe Y Ra链基因选自Fe Y RIIB、Fe Y RIV和Fe Y RIII α链基因。在具体的实施方案中，提供了遗传修饰的小鼠，其中所述小鼠表达内源FcRy链，并且其中低亲和力人FcYRa链基因为FcYRIIIAa链。在另一个具体的实施方案中，遗传修饰的小鼠在NK细胞上表达内源FcR Y链和功能性人Fe Y RIIIA α链。在具体的实施方案中，NK细胞上的Fe Y RIIIA α链的功能性反映在人抗体介导的NK杀伤(例如，由人抗体介导的ADCC)。在一个方面，提供了遗传修饰的细胞、非人胚胎或非人动物，其中所述遗传修饰包括人FcYRa链基因对至少一个内源低亲和力Fe Y Ra链基因的替代，并且所述细胞、胚胎或动物表达功能性FcR Y链。在一个实施方案中，功能性FcRy链为内源FcR Y链。在一个实施方案中，低亲和力人Fe YRa链基因选自Fe YRIIAa链基因、Fe YRIIIAa链基因及其组合。在具体的实施方案中，人FcyRIIA基因包含多态性，其中多态性选自131His低应答者多态性和131Arg高应答者多态性。在具体的实施方案中，Fe YRIIA多态性为131His低应答者多态性。在一个实施方案中，Fe Y RIIIA基因为特定等位基因变体，其中等位基因变体选自158Val变体和158Phe变体。在具体的实施方案中，Fe Y RIIIA等位基因变体为158Val 变体。在一个实施方案中，低亲和力人Fe YR基因选自Fe yRIIB、FcyRIIC, FcyRIIIB基因及其组合。在具体的实施方案中，人Fe Y RIIB基因包含氨基酸置换，其中所述置换选自232Ile或232Thr置换。在另一个具体的实施方案中，氨基酸置换为232Ile置换。在具体的实施方案中，Fe Y RIIIB基因为特定等位基因变体，其中所述等位基因变体选自NAl变体和NA2变体。在另一个具体的实施方案中，Fe Y RIIIB等位基因变体为NA2变体。在一个实施方案中，低亲和力人FcyRa链基因选自Fe Y RIIA、Fe Y RIIB、Fe Y RIIC、Fe Y RIIIA、FcyRIIIBa 链基因及其组合。在一个实施方案中，低亲和力小鼠Fe YRIVa链基因和Fe Y RIII α链基因被至少一个低亲和力人Fe YRa链基因替代。在一个实施方案中，低亲和力小鼠Fe YRIVa链基因和Fe Y RIIB α链基因被至少一个低亲和力人Fe Y R α链基因替代。在一个实施方案中，低亲和力小鼠Fe YRIIBa链基因和Fe Y RIII α链基因被至少一个低亲和力人Fe Y R a链基因替代。在具体的实施方案中，至少一个低亲和力人FcYRa链基因选自FcyRIIA、Fe Y RIIB,Fe y RIIC.Fc y RIIIA.Fc y RIIIB a链基因及其组合。在另一个具体的实施方案中，至少一个低亲和力人Fe YRa链基因选自FcyRIIAa链基因、FcyRIIIAa链基因及其组合。在另一个具体的实施方案中，至少一个低亲和力人Fe Y R α链基因选自Fe Y RIIB、FcyRIIC, FcyRIIIBa链基因及其组合。在另一个具体的实施方案中，低亲和力小鼠Fe Y R基因被人Fe Y RIIA α链基因和人Fe Y RIIIA α链基因替代。在另一个具体的实施方案中，低亲和力人Fe Y RIIA和Fe YRIIIAa链基因包含变体，其中Fe Y RIIA α链基因包含131把8变体并且？(￥1 11从(1链基因包含158Val变体。在另一个具体的实施方案中，低亲和力小鼠Fe YRa链基因被下列低亲和力人Fe YRa链基因替代Fe Y RIIB、Fe Y RIIC和FcyRIIIB0在另一个具体的实施方案中，低亲和力人Fe Y RIIB α链基因和Fe Y RIIIB a链基因包含变体，其中Fe YRIIBa链基因包含232Ile变体并且Fe Y RIIIB α链基因包含NA2变体。在一个实施方案中，遗传修饰包括小鼠和人染色体I的共线(syntenic)基因组序列的替代。在具体的实施方案中，遗传修饰包括包含低亲和力人Fe Y R基因的基因组片段对包含内源低亲和力小鼠Fe Y R基因的基因组片段的替代。在另一个具体的实施方案中，来自染色体1:172，889，983至染色体1:172，989，911的小鼠基因组被包含人染色体
I 161，474，729至染色体1:161，620，458的人基因组片段替代。在一个方面，提供了遗传修饰的细胞、非人胚胎或非人动物，其中遗传修饰包括一个或多个内源低亲和力受体α链基因的敲除、包含一个或多个人Fe Y Ra链基因的附加体的存在。在具体的实施方案中，所述细胞、胚胎或动物表达功能性FcR Y链。在具体的实施方案中，附加体为微小染色体。在一个实施方案中，功能性FcRy链对于所述细胞、胚胎或动物是内源的。在一个方面，提供了遗传修饰的小鼠，包括用低亲和力人Fe Y Ra链基因替代低亲和力小鼠Fe Y Ra链基因，小鼠包含小鼠FcRy链基因，并且小鼠表达功能性人低亲和力Fe Y R受体。在一个实施方案中，功能性低亲和力Fe Y R受体在其中低亲和力Fe YR受体在人中表达的细胞类型上表达。在具体的实施方案中，功能性人低亲和力Fe Y R受体为Fe YRIIIA并且Fe Y RIIIA在NK细胞上表达。在一个实施方案中，小鼠包含两个小鼠Fe YRa链基因的缺失。在另一个实施方案中，小鼠包含3个小鼠Fe Y R α链基因的缺失。在一个实施方案中，小鼠包括用至少I个人Fe YRa链基因对3个小鼠Fe Y R a 链基因的替代。在另一个实施方案中，小鼠包括用至少I个FcYRa链基因对2个小鼠FcyRa链基因的替代。在具体的实施方案中，小鼠包括用至少2个人Fe Y Ra链基因对3个小鼠Fe YRa链基因的替代。在另一个具体的实施方案中，用3个人Fe Y Ra链基因替代3个小鼠Fe Y Ra链基因。在另一个具体的实施方案中，小鼠包括用至少2个人Fe Y Ra链基因对2个小鼠Fe YRa链基因的替代。在另一个具体的实施方案中，用至少3个人FcyRa链基因替代2个小鼠Fe Y Ra链基因。在一个实施方案中，低亲和力小鼠FcyRa链基因选自Fe Y RIIB、Fe Y RIV、FcyRIIIa链基因及其组合。在一个实施方案中，低亲和力人FcyRa链基因选自Fe Y RIIA、Fe Y RIIB、Fe y RIIC, Fe y RIIIA, Fe y RIIIB α链基因及其组合。在一个实施方案中，低亲和力人FcyRa链基因选自Fe Y RIIA、FeyRIII冬(X链基因及其组合。在一个实施方案中，低亲和力人Fe YRa链基因选自Fe YRIIB，Fc YRIIC、Fc YRIIIBa链基因及其组合。在一个实施方案中，用至少I个人Fe YRa链基因替代低亲和力小鼠Fe Y RIV a链基因和Fe Y RIII α链基因。在一个实施方案中，用至少I个人Fe Y Ra链基因替代低亲和力小鼠Fe Y RIV α链基因和Fe Y RIIB α链基因。在一个实施方案中，用至少I个人FcyRa链基因替代低亲和力小鼠Fe YRIIBa链基因和Fe Y RIIIB α链基因。在具体的实施方案中，至少I个人Fe YRa链基因选自Fe yRIIA、Fc yRIIB、Fc yRIIC、Fc YRIIIA、FcyRIIIBa链基因及其组合。在另一个具体的实施方案中，至少I个人Fe Y R α链基因选自Fe Y RIIA、FcYRIIIAa链基因及其组合。在另一个具体的实施方案中，至少I个人FcyRa链基因选自Fe YRIIB、Fc YRIIC、Fc YRIIIBa链基因及其组合。在另一个具体的实施方案中，用下列人FcYRa链基因=FcyRIIA和Fe Y RIIIA替代小鼠α链基因。在另一个具体的实施方案中，用下列人Fe YRa链基因？0^1 118、？(3￥1 11(和？(3￥1 1118替代小鼠α链基因。 在一个方面，提供了包含低亲和力人Fe Y Ra链和小鼠FcRy链亚基的遗传修饰的小鼠，其中所述小鼠在选自嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、血小板、朗格汉斯细胞、树突细胞、NK细胞、肥大细胞、B细胞、T细胞及其组合的细胞上表达人FcYRa链。在一个实施方案中，小鼠在选自嗜中性粒细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、血小板、树突细胞、朗格汉斯细胞及其组合的细胞上表达人Fe Y RIIA a
链。在一个实施方案中，小鼠能够进行通过表达的人FcyRIlAa链起始或介导的吞噬作用、ADCC和细胞活化。在一个实施方案中，小鼠表达在选自巨噬细胞、NK细胞、单核细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、树突细胞、朗格汉斯细胞、至少一种T细胞类型及其组合的细胞上表达人Fe Y RIIIA α链。在一个实施方案中，小鼠能够进行通过在NK细胞上表达的人FcyRin^a链介导的ADCC。在具体的实施方案中，小鼠展示响应于包含人Fe的抗体的hFc Y RIIIA-介导的 ADCC。在一个实施方案中，小鼠表达人Fe YRIIAa链和人FcyRIIIAa链。在一个实施方案中，人Fe YRIIAa链在血小板上表达并且人Fe Y RIIIA α链在NK细胞上表达。在一个实施方案中，小鼠能够进行由包含人Fe的抗体介导的ADCC，其中所述介导通过在辅助细胞表面上表达的人Fe Y RIIA α链或人Fe Y RIIIA α链来进行。在一个实施方案中，人FcyRIIAa链不在血小板上表达。在其中人Fe Y RIIA α链不在血小板上表达的具体实施方案中，小鼠缺失或实质上缺失可操作地连接于人基因组中的人Fe Y RIIAa链的人启动子序列。在一个实施方案中，小鼠在选自B细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、朗格汉斯细胞及其组合的细胞上表达人Fe Y RIIB a链。在具体的实施方案中，小鼠在B细胞和肥大细胞上表达人Fe Y RIIB α链。在另一个具体的实施方案中，小鼠能够进行通过表达的人Fe Y RIIB α链介导的免疫复合物的吞噬作用。在一个实施方案中，小鼠在选自嗜中性粒细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、血小板、树突细胞、朗格汉斯细胞及其组合的细胞上表达人Fe Y RIIC α链。在具体的实施方案中，小鼠能够进行通过表达的人Fe YRIICa链启始的吞噬作用、ADCC和细胞活化。在一个实施方案中，小鼠在嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞上表达人FcyRinpa链。在具体的实施方案中，小鼠能够进行细胞活化、吞噬作用、ADCC和脱粒，其中活化、吞噬作用、ADCC和脱粒通过表达的人FcyRI丨丨Pa链介导。在一个方面，提供了包含内源FcyRIIB、FcyRIV和FcyRIII基因的缺失和人Fe Y RIIA、Fe Y RIIB、Fe Y RI 1C、Fe Y RIIIA和Fe y RIIIB基因的插入的小鼠，其中所述小鼠包含功能性小鼠FcR Y链基因。在一个实施方案中，小鼠包含由内源Fe Y RIIB、Fe Y RIV和Fe Y RIII基因编码的α 链的缺失和由人 Fe Y RIIA,Fe Y RIIB、Fc Y RIIC,Fe Y RIIIA 和 Fe Y RIIIB 基因编码的 a链的插入。在一个实施方案中，人？(^1 1从、？(^1 118、？(^1 11(、？(^1 11从和Fe Y RII IBa链基因的插入位于小鼠基因组的随机位置。 在一个实施方案中，人？(^1 1从、？(^1 118、？(^1 11(、？(^1 11从和Fe Y RIIIBa链基因的插入位于内源小鼠低亲和力Fe Y Ra链基因座。在一个实施方案中，小鼠在NK细胞和巨噬细胞上表达人Fe Y RIIIA。在具体的实施方案中，来自小鼠的脾细胞样品的所有或大体上所有NK细胞表达人Fe Y RIIIA。在具体的实施方案中，来自小鼠的脾细胞样品的所有或大体上所有巨噬细胞表达人Fe Y RIIIA0在一个实施方案中，小鼠在选自嗜中性粒细胞、巨噬细胞及其组合的细胞类型上表达选自人Fe Y RIIA、人Fe YRIIIA及其组合的人Fe y R0在具体的实施方案中，小鼠在小鼠的脾细胞样品的全部或大体上全部嗜中性粒细胞和巨噬细胞上表达人Fe Y RIIA和人
Fe Y RIIIAo在一个实施方案中，小鼠在来自小鼠的B细胞门控的脾细胞样品的B细胞和B细胞的嗜中性粒细胞上表达人Fe Y RIIB和人Fe Y RIIIB0在具体的实施方案中，小鼠在来自小鼠的B细胞门控的脾细胞样品的全部或大体上全部B细胞和嗜中性粒细胞上表达Fe Y RIIIB 和 Fe Y RIIB0在一个实施方案中，小鼠还包含人源化⑶20基因。在一个实施方案中，还包含人源化CD20基因的小鼠在用包含Fe的抗-CD20结合蛋白处理后展示B细胞的(体内)耗尽。在一个实施方案中，所述耗尽存在于选自骨髓、血液、淋巴结、脾及其组合的区室中。在一个实施方案中，Fe为人Fe。在一个实施方案中，Fe为小鼠Fe。在一个实施方案中，抗-CD20结合蛋白为抗-CD20抗体。在一个方面，提供了包含本文中描述的遗传修饰的细胞。在一个实施方案中，所述细胞选自胚胎干细胞(ES)、多能细胞、诱导的多能细胞和全能细胞。在一个实施方案中，细胞选自小鼠细胞和大鼠细胞。在具体的实施方案中，细胞为ES细胞。在更具体的实施方案中，细胞为小鼠ES细胞。在一个方面，提供了包含本文中描述的遗传修饰的非人胚胎。在一个实施方案中，非人胚胎选自小鼠胚胎和大鼠胚胎。在一个方面，提供了测定治疗剂的功效的方法。在一个实施方案中，治疗剂为包含人Fe的抗体(例如，单、双、三、多特异性的)。在一个实施方案中，治疗剂为人抗体。在一个实施方案中，功效为治疗剂介导的细胞杀伤(例如，ADCC)的功效。在具体的实施方案中，人治疗剂是包含人免疫球蛋白重链的Fe的融合蛋白。在一个实施方案中，给本文中描述的小鼠施用治疗剂并且测量治疗剂依赖性ADCC的水平。在一个实施方案中，通过给小鼠施用治疗剂，随后检测(例如，从获自动物的样品(例如，血液)进行体外检测)治疗剂对表达FcyR的细胞上的人低亲和力Fe Y R的结合来将小鼠用于评估治疗剂的ADCC活性。在具体的实施方案中，从小鼠分离小鼠的辅助细胞，并且测试其在治疗剂存在和不存在的情况下介导治疗剂依赖性ADCC的能力。在一个方面，提供了用于确定低亲和力Fe Y R是否与人疾病或障碍相关的方法，包括测定根据本发明的小鼠的与人疾病或障碍相关的性状的步骤。在一个实施方案中，所述性状为与一个或多个低亲和力Fe Y R的功能的不存在或丧失相关的表型。在具体的实施 方案中，疾病或障碍为自身免疫疾病或障碍。在具体的实施方案中，自身免疫疾病或障碍选自类风湿关节炎(RA)、系统性红斑狼疮(SLE)、I型糖尿病、Guillain-Barre综合征、硬化症、多发性硬化、Goodpasture’ s综合征、Wegener’ s肉芽肿病和实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)。在具体的实施方案中，小鼠包含低亲和力Fe Y R中的多态性，并且性状选自与大部分不具有多态性的人群相比较增强的介导ADCC的能力以及与大部分不具有多态性的人群相比较减小的介导ADCC的能力。在一个方面，提供了用于在小鼠中产生抗-人FcRa链抗体的方法，包括将根据本发明的小鼠与本文中描述的人FcR接触。在一个实施方案中，识别人的FcR的抗体分离自小鼠。在另一个实施方案中，鉴定和克隆了编码识别人FcR的抗体的全部或部分可变区的核酸序列。在一个方面，提供了用于测定抗-人FcR抗体将分子靶向表达FcR的细胞以吞噬靶分子的能力的方法，包括将本文中描述的小鼠与包含抗-人FcR抗体的试剂接触，并且测量革G分子的吞曬。在一个方面，提供了用于在小鼠中产生针对抗原的抗体的方法，所述抗原在对于一种或多种Fe Y R为野生型的小鼠中具有差的免疫原性，所述方法包括将本文中描述的缺失小鼠低亲和力FcR但表达Fe Y R Y链的小鼠与在对于一种或多种Fe Y R为野生型的小鼠中具有差免疫原性的抗原接触，并鉴定识别所述差抗原性的抗原的抗体。在一个实施方案中，所述方法包括从小鼠分离抗体。在另一个实施方案中，鉴定和克隆了编码抗体的全部或部分可变区的核酸序列。在一个方面，提供了用于产生能够产生包含人可变区的抗体的小鼠的方法，包括将本文中描述的第一小鼠与第二小鼠交配的步骤，所述第二小鼠包含(a) —个或多个人免疫球蛋白可变区基因区段和一个或多个人恒定区基因；或(b)可操作地连接于小鼠恒定区基因的一个或多个人免疫球蛋白可变区基因区段，其中所述人基因区段在小鼠可变区基因区段的基因座上替代可变区基因区段。在一个实施方案中，第二小鼠(a)包含含有一个或多个人免疫球蛋白轻链可变区基因区段和人轻链恒定基因的转基因和含有一个或多个人免疫球蛋白重链可变区基因区段和一个或多个人重链恒定基因的转基因。在一个实施方案中，包含一个或多个人免疫球蛋白重链可变区基因区段的转基因包两个或更多个重链恒定基因并且能够进行类别转换(class switching)。在具体的实施方案中，小鼠包含失活的内源轻链基因座和/或失活的内源重链基因座。在具体的实施方案中，小鼠包含内源轻链基因座的缺失和/或内源重链基因座的缺失。在一个实施方案中，第二小鼠(b)分别在小鼠重链和轻链基因座上包含人重链和人轻链可变区基因区段。在一个方面，提供了用于选择抗肿瘤抗体的方法，包括测定抗体介导ADCC的能力的步骤，其中通过测定由本文中描述的小鼠的细胞介导的ADCC来测试抗体介导ADCC的能力，如果抗体利用本文中描述的遗传修饰的小鼠的细胞介导ADCC，则选择该抗体。在具体的实施方案中，测定抗体对遗传修饰的小鼠的细胞的结合，并且就其结合细胞上的人Fe Y R的能力选择抗肿瘤抗体。在具体的实施方案中，人Fe Y R为低亲和力Fe Y R0在一个实施方案中，抗肿瘤抗体通过与抗肿瘤抗体通过野生型小鼠的细胞介导ADCC的能力相比较的增强的通过小鼠的细胞介导ADCC的能力来进行鉴定。在具体的实施方案中，抗肿瘤抗体通过其通过NK细胞介导ADCC的能力来进行鉴定。在具体的实施方案中，所述NK细胞表达人Fe Y RIIIA。 在一个实施方案中，提供了用于选择抗肿瘤试剂的方法，包括给第一非人动物施用包含人Fe或修饰的人Fe的试剂的步骤，其中第一非人动物按照本发明进行了遗传修饰并且包含人肿瘤；给包含肿瘤的第二非人动物施用试剂的步骤；和测定第一非人动物和第二非人动物在施用试剂后延缓人肿瘤生长的能力，其中如果试剂在第一非人动物中但非在第二非人动物中展示增强的延缓人肿瘤生长的能力，则其被选择为抗肿瘤试剂。在一个实施方案中，第一非人动物经修饰包含内源FcRa -亚基的缺失，并且经修饰包含选自 Fe YRiiAa -亚基、FcyRIIBa -亚基、-FcyRE^a 亚基、Fe Y RIl IA a -亚基、Fe YRIIIBa-亚基及其组合的人FcR a -亚基。在一个实施方案中，第二动物为野生型动物。在一个实施方案中，第一非人动物表达内源FcRy链。在一个实施方案中，第一非人动物表达功能性内源Fe YRI。在一个方面，提供了用于产生小鼠的方法，所述小鼠缺失低亲和力小鼠FcY R，表达功能性 FcR Y 链并且包含编码人Fe Y RIIA,Fe y RIIB、Fc y RIIC,Fe y RIIIA和 Fe y RIIIB的α链的基因，包括用人FcYRa链在小鼠FcYRa链基因座上替代低亲和力小鼠FcyRa链的步骤。在一个实施方案中，第一步骤包括缺失内源Fe Y RIIB、Fe Y RIV和Fe Y RIII基因的α链和插入人Fe Y RIIA和Fe Y RIIIA基因的α链；第二步骤包括将人Fe Y RIIB、Fe Y RIIC和Fe Y RIIIB基因的α链插入由第一步骤产生的小鼠的基因组；其中所述小鼠包含功能性小鼠FcRy链基因.在具体的实施方案中，第二步骤的人Fe Y RIIB、FcyRIIC和Fe Y RIIIB基因的α链插入在相对于第一步骤的人Fe Y RIIA和Fe Y RIIIA基因的a链的5’。在一个方面，提供了用于测定人治疗剂在非灵长类动物中的细胞杀伤的方法，包括将细胞、非人胚胎或非人动物与包含人Fe的人治疗剂接触的步骤，其中所述细胞、胚胎或动物包含功能性FcR Y链并包含一个或多个人Fe Y Ra链对一个或多个内源低亲和力FcyRa链基因的替代，以及测定人治疗剂通过细胞、胚胎或动物的低亲和力人Fe Y R介导细胞杀伤的能力。在一个实施方案中，非灵长类动物为小鼠。在具体的实施方案中，内源小鼠Fe y Ra 链基因 Fe Y RIIB、Fc Y RIV 和 Fe Y RIII 被人Fe γ Ra 链基因 Fe Y RIIA、Fc Y RIIB、Fe y RIIC、Fe y RIIIA 和 Fe y RIIIB 替代。在一个实施方案中，细胞选自B细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、朗格汉斯细胞及其组合。在具体的实施方案中，细胞为NK细胞并且测定通过人或人源化抗体产生的NK细胞介导的ADCC。在具体的实施方案中，低亲和力人FcyR为人Fe Y RIIIA0在一个方面，提供了用于测定治疗剂依赖性血栓形成的方法，包括将在血小板上表达人Fe Y RIIA的第一非人动物与治疗剂接触；将不在血小板上表达人Fe Y RIIA的第二非人动物与所述治疗剂接触；在第一非人动物和第二非人动物中测量治疗剂依赖性血栓形成的量；和测定治疗剂依赖性血栓形成的差异。在一个实施方案中，非人动物选自小鼠和大鼠。
在一个实施方案中，将治疗剂依赖性血栓形成的测定的差异用于鉴定与向人施用该治疗剂相关的风险。在一个实施方案中，测定的差异导致治疗剂给有此需要的人患者的施用的改变。发明详述本发明不限于描述的特定方法和实验条件，因为这样方法和条件可改变。本文中使用的术语仅为了描述特定的实施方案，无意起限制作用，因为本发明的范围将仅由权利要求限定。除非另外定义，否则本文中使用的全部技术和科学术语具有与本发明所属领域内的技术人员通常理解的相同的含义。虽然与本文中描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料可用于实施或测试本发明，但现在描述特定的方法和材料。本文中提及的所有出版物通过引用方式全文并入本文。短语“靶向构建体”包括含有靶向区域的多核苷酸分子。靶向区域包含与靶细胞、组织或动物中的序列实质上同源的序列并且提供了靶向构建体至细胞、组织或动物的基因组内的位置的整合。在具体的实施方案中，靶向构建体还包括特定目标核酸序列或基因、选择标记、控制和/或调节序列以及允许通过蛋白质的外源添加介导的重组的其它核酸序列，所述蛋白质帮助或促进牵涉这类序列的重组。在另一个具体的实施方案中，靶向构建体还包含目标基因，其中所述目标基因为编码与由内源序列编码的蛋白质具有相似功能的蛋白质的异源基因。除非另外明确地指出，否则术语“替代”包括其中将DNA序列以这样的方式置于细胞的基因组内用异源序列(例如，小鼠中的人序列)在基因组序列的基因座上替代基因组中的序列。这样放置的DNA序列可包括作为用于获得这样放置的序列的源DNA的一部分的一个或多个调控序列(例如，启动子、增强子、5’-或3’-非翻译区等)。例如，在不同的实施方案中，替代是异源序列对内源序列的置换，该置换导致基因产物从这样放置的DNA序列(包括异源序列)产生，但不表达内源序列；替代是用DNA序列置换内源基因组序列，所述DNA序列编码具有与内源基因组序列编码的蛋白质相似的功能的蛋白质(例如，内源基因组序列编码低亲和力小鼠Fe Y R受体，DNA片段编码一种或多种人低亲和力Fe Y R受体，例如 Fe Y RIIC 和 / 或 Fe Y RIIIB)。术语“Fe Y R”包括Fe、例如IgG免疫球蛋白的Fe部分的受体。Fe Y R基因包括α链，所述α链在细胞表面上表达并且用作配体结合结构域，并与FcR Y链的同二聚体或FcRy链与δ链的异二聚体结合。存在几种不同的FcyR基因并且可根据在免疫复合物中与IgG的优先结合将它们分成低亲和力和高亲和力类型。人的低亲和力Fe Y R基因包括Fe Y RIIA,Fe Y RIIB、Fc y RIIC,Fe y RIIIA和Fe y RIIIB,并且已在患有自身免疫疾病的人受试者中描述了在大多数此类基因内天然存在的遗传差异或多态性。在阅读本公开内容后本领域技术人员将认识到基因组中的一个或多个内源低亲和力Fe Y R基因(或全部)可被一个或多个异源低亲和力Fe Y R基因(例如，变体或多态性例如等位基因形式、来自另一物种的基因、嵌合形式等)替代。术语“等位基因变体”包括基因的正常序列的变异，其导致同一基因的一系列不同形式。所述不同形式可在来自基因的蛋白质序列中包含至多20个氨基酸的差异。例如，等位基因可被理解为相同物理基因基因座上的可选择的DNA序列，其可以导致或可以不导致不同的性状(例如，可遗传的表型特征)、例如对某些疾病或病况的易感性，其不导致相同基因的其它等位基因或在不同程度上导致其它等位基因。
“辅助细胞”包括参与免疫应答的效应子功能的免疫细胞。示例性免疫细胞包括淋巴样或骨髓样来源的细胞，例如淋巴细胞、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、血小板、郎格汉斯细胞、树突细胞、肥大细胞等。辅助细胞通过在它们的表面上表达的受体例如FcR进行免疫系统的特定功能。在具体的实施方案中，辅助细胞能够触发通过在细胞表面上表达的FcR例如低亲和力Fe Y R介导的ADCC。例如，表达FcR的巨噬细胞参与吞噬作用和破坏抗体包被的细菌。辅助细胞还可能能够释放介导其它免疫过程的试剂。例如，肥大细胞可被结合至FcR的抗体激活以在感染的部位释放颗粒例如炎症分子(例如，细胞因子)。在不同的其它实施方案中，FcR在辅助细胞上的表达可受其它因子(例如，细胞因子)调节。例如，Fe Y RI和Fe Y RIII表达可通过利用干扰素-Y (IFN- Y )的刺激诱导。小鼠和人FcR免疫球蛋白的Fe区(即，恒定区)的受体(FcR)在免疫应答的调节中起着重要作用。FcR存在于宿主免疫系统的辅助细胞上以有效地除去被抗体结合的外源抗原。FcR也在平衡免疫系统的辅助细胞的激活和抑制应答中起着重要作用。FcR参与巨噬细胞的吞噬作用、肥大细胞的脱粒、抗体-抗原复合物的摄取和免疫应答的调节以及其它免疫系统过程。在小鼠和人中，不同的FcR在不同辅助细胞的表面上差异性表达，所述辅助细胞各自对于存在于表达的抗体库中的免疫球蛋白同种型是特异性的。例如，免疫球蛋白G(IgG)抗体通过IgG受体(Fe Y R)介导效应子功能。FcyR已被分成3类高亲和力激活性Fe Y RI (CD64)、低亲和力抑制性FcyRII (CD32)和低亲和力激活性FcyRIII (CD16)。虽然每一类都存在于小鼠和人中，但它们所存在于的免疫细胞的同种型和亚组的数目不同。例如，Fe Y RIIA和Fe Y RIIIB在人的辅助细胞上表达但据报道不存在于小鼠中。此外，不同IgG同种型(例如，IgGl)对每一种Fe Y R的亲和力在人和小鼠中不同。通过Fe Y R的细胞信号转导的激活或抑制和与抗体对Fe Y R的结合相关的效应子功能据认为由Fe Y R的细胞内结构域的特定序列基序或共受体(co-receptor)的亚基的特定序列基序介导。激活受体最常见地与包含免疫受体基于酪氨酸活化基序(ITAM)的常见Y链(FcRy链)相关。ITAM包含约9-12个氨基酸的特定序列，该序列包括响应于抗体对FcR的结合而被磷酸化的酪氨酸残基。磷酸化导致信号转导级联。已报道了缺失编码FcR Y链的基因的小鼠(FcRy链KO)(例如，参见Takai等人(1994)FcR Y chainDepletion Results in Pleiotrophic Effector Cell Defects, Cell 76:519-529;vanVugt 等人(1996)FcR y-chain Is Essential for Both Surface Expression andFunction of Human Fe γ RI (CD64) In Vivo, Blood 87 (9) : 3593-3599 ;和 Park 等人(1998)Resistance of Fe Receptor-deficient Mice to Fatal Glomerulonephritis, J. Clin.Invest. 102(6) :1229-1238) 0 FcRy链据报道为大多数FcR的正确表面表达和功能(例如，信号转导、吞噬作用等)所必需的；根据一些报道FcRy链KO小鼠缺失FcyRI。然而，其它报道显示FcR Y链KO小鼠确实在某些辅助细胞的表面上表达Fe Y RI，并且表达的Fe Y RI据报道显示具有功能，功能在于其在表达的FcR Y链不存在的情况下在小鼠中结合 IgG (Barnes 等人(2002) Fe Y RI-Deficient Mice Show Multiple Alterations toInflammatory and Immune Responses, Immunity 16:379-389)。相反地，Fe y RIIB是在其细胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的抑制性基序(ITIM)的抑制性受体。与ITAM—样，ITIM是包含可磷酸化的酪氨酸残基的序列基序。然 而，在ITM的磷酸化后的下游事件导致免疫细胞功能的抑制而非激活。Fe Y RIIB缺陷型小鼠据报道展示与野生型小鼠相比较增强的抗体应答(Takai等人(1996) Augmented humoraland anaphylactic responses in FcgRII-deficient mice, Nature379:346-349),此为支持Fe y RIIB作为B细胞抗体应答的下游调节剂的观察。在人中，FcyRIIA,FcyRIIB, FcyRIIC, Fe Y RIIIA 和 Fe Y RIIIB 被认为是经典低亲和力Fe YR基因并且一起位于相同染色体上(Su等人(2002)Genomic organizationof classical human low-affinity Fe y receptor genes, Genes and Immunity 3 (Supple
I): S51-S56)。这些基因展示出几个与独特表型例如受体的配体结合和功能的改变相关的多态性。一些多态性与自身免疫疾病例如系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿关节炎(RA)和多发性硬化(MS)相关。针对不同的人FcyRQiFcyR)的转基因小鼠已被开发并且用作疾病模型、产生高亲和力抗体、测试治疗性抗体引发特异性细胞应答的能力、筛选缓解异常免疫应答的化合物(例如，参见Heijnen等人(1996)A Human FcgRI/CD64Transgenic Model for InVivo Analysis of(Bispecific)Antibody Therapeutics, J.Hematother. 4:351-356;Heijnen 和 van de Winkel(1996)Antigen Targeting toMyeloid-specific Human FcgRI/CD64 Triggers Enhanced antibody Responses inTransgenic, J. Clin. Invest. 97(2) :331-338;美国专利 No. 6，111，166、6，676，927、7，351，875,7, 402，728 和 7，416，726)。尽管FcR在提供免疫系统的抗体与辅助细胞之间的桥梁中起着重要作用，但目前仍然不存在其中所有低亲和力hFc Y R都表达的模型系统。其中所有低亲和力hFc Y R共表达的小鼠(包括缺失内源小鼠Fe YR的小鼠)在不同的实施方案中可用于精确地反映人抗体治疗剂的效应，包括ADCC介导的效应。这样的小鼠可在用于治疗人疾病例如RA、I型糖尿病、SLE和自身免疫性的治疗性抗体的工程改造、分析和评估中用作至关重的工具提供能够实现人的免疫过程的更精确评估(特别地在测试人抗体治疗剂的情景中)的动物模型。小鼠还可以是具有低亲和力受体的细胞的有价值的来源，所述细胞可在体外测定中用于评估结合低亲和力受体的治疗剂的治疗剂依赖性细胞杀伤，并因此而被用于鉴定有用的人治疗剂。内源低亲和力Fe Y R基因缺陷型小鼠提供了不表达内源低亲和力小鼠Fe Y R基因但表达内源小鼠FcRy链的遗传修饰的非人动物。在不同的实施方案中，FcRy链以与野生型小鼠中相同或大体上相同的分布(即，在细胞类型中)和水平在小鼠中表达。内源低亲和力Fe YR基因可在免疫细胞的表面上表达或在动物的周围组织中以可溶性方式表达。用于产生不表达内源低亲和力小鼠Fe Y R基因的非人动物的遗传修饰通过使用小鼠为例子来方便地说明。可以以多种方式，特别是实施方案已在本文中进行了描述的方式产生根据本发明的遗传修饰的小鼠。 图I中(顶部)提供了显示FcyR基因在内源基因座中的排列的低亲和力小鼠Fe Y R基因基因座的示意图(未按比例的)。如图所示，低亲和力小鼠Fe Y R基因Fe Y RIIB、Fe Y RIV和Fe Y RIII —起紧密地存在于一条染色体上。这些基因中的每一个基因包含负责结合抗体分子的Fe部分的α链或配体结合结构域。缺失编码内源低亲和力Fe YR基因的α链的核苷酸序列的遗传修饰的小鼠可通过本领域已知的任何方法来产生。例如，可制备缺失低亲和力小鼠Fe YRa链基因的具有选择标记基因的靶向载体。图I举例说明了被靶向构建体靶向的小鼠基因组(底部)，所述构建体具有包含内源低亲和力Fe Y Ra链基因座的上游序列的5’同源臂，后接药物选择盒(例如，侧翼连接有IoxP序列的新霉素抗性基因)和包含内源低亲和力FcYRa链基因座的下游序列的3’同源臂。于基因座上同源重组后，内源低亲和力FcYRa链基因座被药物选择盒替代(图I的底部)。内源低亲和力FcYRa链基因基因座因此被缺失，从而产生不表达内源低亲和力小鼠FcYRa链基因的细胞或非人动物。可作选地通过随后添加重组酶(例如，通过Cre处理)除去药物选择盒。在不同实施方案中，遗传修饰小鼠以使内源低亲和力小鼠Fe YRa链基因失去功能，产生展示免疫应答的缺陷的小鼠，从而使得小鼠对于评估内源低亲和力小鼠Fe Y R基因在正常和紊乱的免疫功能、IgG-介导的过程以及自身免疫疾病中的协同以及单独的作用是有用的。在不同的实施方案中，修饰内源低亲和力小鼠Fe YR基因的α链但非FcRy链，避免了需要FcRy链以进行表面表达和功能的其它内源FcR基因(例如，高亲和力Fe Y RI)的潜在减少，从而维持通过Y链依赖性过程介导的各种其它免疫功能和过程。根据一些方面，FcR Y链缺陷型小鼠缺失Fe Y RIII和Fe Y RI的表面表达。然而，已报道在FcR Y链缺陷型小鼠的细胞表面上检测到Fe Y RI，所述Fe y RI据报道具有至少部分功能。相反地，根据本发明的小鼠包含未修饰的内源FcRy链，其保持天然细胞表面表达模式和需要FcR Y链的其它FcR基因的细胞功能。在不同的实施方案，本发明的小鼠显示了优于其它Fe Y R基因-缺陷小鼠的有利方面，所述有利方面在于它们所具有的遗传修饰导致不完全贡献于低亲和力Fe Y R基因的其它免疫功能所必需的其它基因的维持。例如，通过功能性FcR Y链，其它Y链依赖性蛋白(例如，Fe Y RI)将能够与FcR Y链结合并且在免疫应答中参与效应细胞功能。在根据本发明的各种遗传修饰的小鼠中，据认为维持此类功能(归因于功能性FcRy链的存在)同时缺失内源低亲和力Fe Y R基因(一个或多个a -亚基)使得能够更精确地阐明FcR在自身免疫中的作用。低产和力Fe Y R人源化小鼠
提供了表达低亲和力人Fe Y R基因的遗传修饰的非人动物。低亲和力人Fe Y R基因可在动物免疫系统的辅助细胞的表面上表达或在动物的周围组织中以可溶性方式表达。在不同的实施方案中，遗传修饰包含一个或多个低亲和力小鼠Fe Y R基因的功能性α链的缺失，并且在一些实施方案中包含含有以两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个或五个低亲和力人Fe Y R α亚基基因的替代的其它修饰，其中非人动物表达功能性小鼠FcRy链基因。还提供了遗传修饰的非人胚胎、细胞和用于产生非人动物、非人胚胎和细胞的靶向构建体。提供了用于制备表达人Fe Y R基因(包括特定多态性形式或等位基因变体(例如，单个氨基酸的差异))的小鼠的组合物和方法，包括用于制备从人启动子和人调控序列表达此类基因的的小鼠的组合物和方法。所述方法包括选择性地使内源低亲和力小鼠FcyR基因失去功能(例如，通过其α链的缺失)以及在内源低亲和力小鼠Fe Y R基因的基因座上利用低亲和力人Fe Y R基因的α链在小鼠中表达低亲和力人Fe Y Ra-亚基基因。通过缺失一个或多个α链基因但非FcR Y链基因来产生低亲和力小鼠Fe Y R基因的 缺失。所述方法选择性地使一个或多个内源低亲和力Fe YRa链基因失去功能而同时保留功能性内源FcR Y链。在不同的实施方案中，内源Fe YRa链替代方法对动物中的天然Fe Y R介导的信号转导产生的破坏相对最小，因为Fe YRa链的基因组序列在单个片段中被替代，从而通过包含必需调控序列保留正常功能性。因此在这样的实施方案中，FcYRa链修饰不影响其它依赖于功能性FcR Y链分子的内源FcR。此外，在不同实施方案中，修饰不影响包括FcyRa链和内源FcR Y链的功能性受体复合物的装配，所述复合物据认为是一些Fe Y R a链在细胞表面上的正确表达以及由激活的受体产生的下游信号转导所需要的。因为FcRy链未缺失，在不同实施方案中，包含人Fe Y Ra链基因对内源Fe YRa链基因的替代的动物应当能够通过IgG免疫球蛋白的Fe部分对存在于辅助细胞表面上的人Fe YRa链的结合来处理来自抗体的正常效应子功能。在图4中(上部)提供了缺失的内源低亲和力小鼠FcyR基因的示意图(未按比例的)。如图所示，通过用包含人低亲和力人Fe Y RIIA和Fe Y RIIIA基因的基因组片段以靶向构建体(人Fe Y RIIIA-IIA靶向载体)将人低亲和力人Fe Y R基因Fe Y RIIA和Fe Y RIIIA插入缺失的内源低亲和力小鼠Fe Y R基因的基因座。这些基因的每一个基因包含负责结合抗体分子的Fe部分的人Fe Y R基因的α链或配体结合结构域。在内源低亲和力小鼠Fe Y R基因座上表达低亲和力人Fe Y R基因的遗传修饰的小鼠可通过本领域内已知的任何方法来制图。例如，可制备引入低亲和力人FcyR基因(例如，和选择标记基因的靶向载体。图4(顶部)举例说明了包含内源低亲和力Fe YR基因座的缺失的小鼠基因组。如图所示，靶向构建体包含含有内源低亲和力小鼠FcyR基因座的上游序列的5’同源臂、后接药物选择盒(例如，两侧连接有IoxP序列的潮霉素抗性基因)、包含人Fe Y RIIA基因、人HSP76基因和人Fe Y RIIIA基因的基因组片段以及包含内源低亲和力小鼠Fe YR基因座的下游序列的3’同源臂。于缺失的基因座上同源重组后，药物选择盒被包含在靶向载体中的序列替代(图4的底部)。内源低亲和力Fe Y R基因基因座因此被低亲和力人Fe Y R基因替代，产生表达低亲和力人Fe Y R基因的细胞或动物。可任选地通过随后添加重组酶(例如，通过Cre处理)除去药物选择盒。
为了在血小板上表达hFc y RIIA,靶向构建体人hFc y RIIA-IIA靶向载体包含延长的序列，该序列包括例如与人基因组中的hFc Y RIIA基因可操作地连接的全部或大体上全部人启动子区域。为了阻止hFc Y RIIA在血小板上表达，靶向构建体缺失可操作地连接于人的hFc Y RIIA基因的全部或大体上全部启动子区域。可使用对于利用两个人Fe Y R基因的替代所描述的相似技术实现对嵌合基因座的其它修饰(图4的底部)。用两个人Fe Y R基因替代内源低亲和力Fe Y R基因基因座的修饰还可提供用于整合其它低亲和力人Fe YR基因的起始点。例如，图6(顶部)中提供了用两个人低亲和力Fe Y R基因替代的内源低亲和力Fe Y R基因座的示意图(未按比例的)。如图所示，通过另一个具有包含低亲和力人Fe Y RIIB、Fe Y RIIC和Fe y RIIIB基因的基因组片段的靶向构建体(人FcyRIIB-IIIB-IIC靶向载体)将低亲和力人Fe Y R基因Fe Y RIIB、Fc Y RIIC和Fe y RIIIB插入修饰的内源低亲和力小鼠Fe Y R基因的基因座。这些基因的每一个基因包含负责结合抗体分子的Fe部分的人FcyR基因的α链或配体结合结构域。
在内源低亲和力小鼠Fe Y R基因座上表达5个低亲和力人Fe Y R基因的遗传修饰的小鼠可通过本领域已知的任何方法来产生。例如,可制备引入低亲和力人Fe Y R基因(例如，Fe yRIIB、Fe yRIIC^PFcyRIIIB)的具有选择标记基因的靶向载体。图6(顶部)举例说明了包含以2个低亲和力人Fe Y R基因对内源低亲和力Fe Y R基因座的替代的小鼠基因组。如图所示，靶向构建体包含含有内源低亲和力小鼠Fe Y R基因座的上游序列的5’同源臂、后接药物选择盒(例如，两侧连接有IoxP序列的新霉素抗性基因)、包含人Fe Y RIIB基因、人Fe Y RIIIB、人HSP77基因、人Fe Y RIIC基因的基因组片段，后跟含有存在于内源基因座上的低亲和力人Fe Y RIIIA基因的下游序列的3’同源臂。于修饰的基因座上同源重组后，人Fe Y RIIB、Fe YRIIIB和Fe y RIIC基因通过靶向载体中包含的序列被插入先前存在于内源低亲和力Fe Y R基因基因座上的人Fe Y RIIIA和Fe Y RIIA基因的5’(图6的底部)。因此对修饰的内源低亲和力Fe Y R基因基因座进一步修饰以整合3个额外的低亲和力人Fe Y R基因，从而产生表达5个低亲和力人Fe Y R基因的细胞或动物。药物选择盒可任选通过随后添加重组酶(例如，通过Cre处理)来除去。图6(底部分)显示所得的基因座的结构，其将表达可在动物的免疫系统的辅助细胞的表面上检测到的并且适当时与内源FcRy链独立结合的5个低亲和力人Fe Y R基因。FcyR缺陷型小鼠和Fe Y R人源化小鼠的实验模型不表达内源低亲和力小鼠Fe Y R基因的遗传修饰的非人动物是有用的，其用于例如阐明单个低亲和力Fe Y R基因在免疫应答中的各种功能、通过细胞介导的免疫(例如，ADCC)测量人治疗性抗体的功效、测定Fe Y R在免疫疾病或障碍中的作用、用作免疫疾病或障碍的模型、产生抗一种或多种Fe Y R蛋白的抗体、以及用作产生其它目标遗传修饰的小鼠的交配配偶。在一个实施方案中，根据本发明的小鼠可用于通过给不表达低亲和力Fe Y R基因的小鼠施用试剂来测定这样的小鼠的细胞毒性效应的丧失(与野生型小鼠相比较)，其中已知所述试剂在野生型小鼠中触发Fe YR-依赖性细胞毒性效应。在一个实施方案中，将肿瘤细胞植入本发明的小鼠，在随后的一段时间后，用特异于在肿瘤细胞表面上表达的抗原的抗体注射小鼠。抗体的同种型在注射前是已知的并且通过与在野生型动物中观察到的ADCC相比较来分析动物的Fe Y R-依赖性ADCC的减弱。在另一个方面，可将内源低亲和力受体缺陷型小鼠与其它免疫缺陷型小鼠组合(例如，通过交配)以产生自身免疫疾病的体内模型。例如，重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠在本领域常规地用作用于研究免疫系统的模型生物。SCID小鼠具有受损的产生T或B淋巴细胞或激活补体系统的一些组分的能力，并且不能高效地抵抗感染、排斥肿瘤和排斥移植物。可将本发明的低亲和力Fe Y Ra -亚基基因缺陷型小鼠培育成SCID小鼠以确定宿主动物响应于抗体治疗剂(例如，抗肿瘤抗体)的施用的细胞耗尽，这可测定ADCC和补体依赖的细胞毒性(CDC)在体内肿瘤细胞耗尽中的作用。在另一个方面，提供了包含低亲和力人Fe Y R基因对内源低亲和力Fe Y R基因的替代的遗传修饰的非人动物。此类动物对于研究完全人抗体和hFc Y R介导的ADCC的药代动力学是有用的。此外，已显示人Fe Y R基因展示与疾病(例如，SLE, RA, WegenerJ s肉芽肿病、Guillain-Barr6综合征和多发性硬化)相关的多态性或等位基因变体。因此，包含人Fe Y R基因的特定等位基因或多态性形式对内源低亲和力Fe Y R基因的替代的遗传修饰的非人动物可用于在动物中研究人自身免疫疾病和与多态性相关的性状。在具体的实施方案中，人Fe Y R基因的等位基因形式与对于人IgG的增强的功效相关。·在另一个具体的实施方案中，测定人低亲和力Fe Y R多态性对人抗体治疗剂的功效的影响。在具体的实施方案中，给包含人Fe YR的第一多态性的第一人源化小鼠施用抗肿瘤抗体，也给包含人Fe YR的第二多态性的第二人源化小鼠施用抗肿瘤抗体，其中第一和第二小鼠各自包含人肿瘤细胞；并且在第一小鼠和第二小鼠中评估抗肿瘤抗体的抗肿瘤活性。在具体的实施方案中，由医生基于抗肿瘤抗体在第一小鼠和第二小鼠中的功效的评估选择关于治疗具有第一或第二多态性和具有相应于人肿瘤细胞的肿瘤的人的治疗选择。人Fe Y R基因的适当多态性包括本领域已知的全部多态性。对于人Fe Y RIIA基因，多态性包括例如通过T细胞响应于IgG增殖的能力报道的高应答者表型和低应答者表型。高应答者多态性的特征在于位点131上的精氨酸残基(131Arg)，而低应答者的特征在于位点131上的组氨酸残基(131His)。在具体的实施方案中，人Fe y RIIA序列包含131His多态性。人FcYRIIAa链的代表性蛋白质序列示于SEQ ID N0:32中。人FcyRIIB基因的单核苷酸置换在配体结合结构域(α链)中导致错义置换并且推定其影响IgG的Fe部分结合细胞表面上的Fe Y RIIB的α链的结合能力。例如，已显示小鼠的Fe YRIIB基因的跨膜结构域内的位点232上的苏氨酸对异亮氨酸的置换(Ile232Thr)削弱了受体的信号转导能力。在具体的实施方案中，人Fe Y RIIB基因包含异亮氨酸变体(232Ile)。人FcyRIIBa链的代表性蛋白质序列示于SEQ ID N0:33中。有人提出人Fe Y RIIIA基因的等位基因变体牵涉SLE和RA的易感性。该等位基因变体包括位点158上苯丙氨酸对缬氨酸的置换(Vall58Phe)。缬氨酸等位基因变体(158Val)经表征具有比苯丙氨酸等位基因变体(158Phe)更高的对IgGl和IgG3的亲和力。已有人提出158Phe等位基因变体导致减少的免疫复合物的清除。在具体的实施方案中，人Fe Y RIIIA基因包含158Val等位基因变体。人Fe Y RIIIAa链的代表性蛋白质序列示于SEQ ID NO:35 中。人Fe Y RIIIB基因的等位基因变体包括嗜中性粒细胞抗原I(NAl)和嗜中性粒细胞抗原2(NA2)等位基因。已有人提出这些等位基因变体牵涉输血反应、同种免疫嗜中性白血球减少症(alloimmune neutropaenia)、SLE和Wegener’s肉芽肿病。NA2等位基因变体的特征在于减小的介导吞噬作用的能力。在具体的实施方案中，人Fe Y RIIIB基因包含NA2等位基因变体。人Fe YRIIIB α链的代表性蛋白质序列示于SEQ ID Ν0:36中。在一个方面，遗传修饰的非人动物对于最优化通过治疗性抗体的Fe部分触发的Fe Y R介导的功能是有用的。可利用本领域已知的任何方法修饰抗体的Fe区域。例如，可修饰Fe部分(例如，CH2和CH3结构域)中的氨基酸残基以选择性增强对人Fe Y RIIIA的结合亲和力。因此，所得的抗体应当具有增强的Fe Y RIIIA依赖性ADCC。在具体的实施方案中，将表达本发明的人Fe Y RIIIA的动物用于评估修饰的人抗体的增强的ADCC能力(通过给动物施用修饰的人抗体，检测(例如，体外)抗体对表达Fe YRIIIA的细胞的结合和将观察到的ADCC活性与从野生型动物的测定观察到的ADCC活性相比较)。
实施例实施例I:低亲和力Fe Y R基因缺失型小鼠的产生构建用于引入内源低亲和力小鼠Fe YR基因座的缺失的靶向构建体(下文中描述的)(图I)。使用VELOC1GENE 技术(参见，例如，美国专利No. 6，586，251和Valenzuela 等人(2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupledwith high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21(6) :652-659)制备革巴向构建体以修饰细菌人工染色体(BAC) RP23-395f6 (Invitrogen)。修饰RP23_395f6 BAC DNA以缺失内源低亲和力Fe Y RIIB、Fc Y RIV和Fe Y RIII基因(包括每一个Fe Y R的α链)。简而言之，分别利用引物mFcR5-up-l(5’-ACCAGGATATGACCTGTAGA G;SEQ ID NO:I)和 mFcR3_up-la(GTCCATGGGTAAGTAGAAAC A;SEQ ID NO:2)以及mFcR5-DN(ATGCGAGCTCATGCATCTATG TCGGGTGCGG AGAAAGAGGT AATGCATTCTTGCCCAATACTTAC; SEQ ID NO:3)和 mFcR3_DN(ACTCATGGAGCCTCAACAGG A; SEQ ID NO:4)产生上游和下游同源臂。这些同源臂被用于产生缺失内源低亲和力Fe Y RIIB、Fc Y RIV和Fe Y RIII基因的α链的盒。靶向构建体包括Iox化的新霉素抗性基因，其包含相对于内源基因座的5’和3’区域同源的序列的同源臂。内源Fe YRIIB基因的上游和内源Fe YRIII基因的下游的基因和/或序列(参见图I)不被该靶向构建体修饰。使用在缺失区域外部和在靶向构建体内部的引物，通过聚合酶链式反应(PCR)来确认靶向缺失。使用针对 mFcR-up-detect(ATCCTGAGTA TACTATGACA AGA; SEQ ID NO: 5)和 PGK-up-detect (ACTAGTGAGA CGTGCTACTT C;SEQ ID NO:6)的引物通过 PCR 来确认缺失的基因座的上游区域；使用引物 pA-DN-detect(CTCCCACTCA TGATCTATAG A; SEQ ID NO:7)和 mFcR-DN-detect (TGGAGCCTCA ACAGGACTCC A; SEQ ID NO:8)来确认缺失的基因座的下游区域。横跨上游缺失点的核苷酸序列包括下列序列，所述序列表示与存在于缺失点上的盒序列连续连接的FcyRIIB基因的下游内源小鼠序列(包括在下面的括号内)(GTCCATGGGTAAGTAGAAACA)TTCGCTACC TTAGGACCGT TA(SEQ ID NO:9)。横跨下游缺失点的核苷酸序列包括下列序列，其表示与Fe YRIII基因上游的内源小鼠序列(包括在下面的括号内)连续的盒序列CGGGTGCGGA GAAAGAGGTA AT(GCATTCTT GCCCAATACTTA) (SEQ IDNO:10)。
通过将靶向BAC DNA(上文中描述的)电穿孔入小鼠ES细胞来产生Fe Y RIIB、Fe Y RIII和Fe Y RIV缺陷小鼠。通过Taqman 筛选和核型分析确认阳性ES细胞克隆。随后将阳性ES细胞克隆用于植入雌性小鼠以产生一窝低亲和力Fe Y R基因缺陷幼鼠。实施例2:低亲和力Fe Y R基因缺陷型小鼠的表征从Fe Y R缺陷型小鼠和野生型小鼠收获脾，在无菌一次性袋中用IOmL的胶原酶-D灌注。随后将每一只包含单个脾的袋子置于Stomacher (Seward)中，在培养基环境中匀浆30分钟。将匀浆的脾转移至IOcm培养皿，在37° C温育25分钟。使用1:50稀释度的O. 5MEDTA，利用移液器分离细胞，随后在37° C再温育另外5分钟。随后通过离心(IOOOrpm进行10分钟)沉淀细胞,将红细胞在4mL ACK缓冲液(Invitrogen)中裂解3分钟。用RPMI-1640 (Sigma)稀释脾细胞，再次离心。将沉淀的细胞重悬浮于IOmL RPMI-1640中，利用O. 2 μ m细胞滤过器进行过渡。 流式细胞术。利用下列缀合有荧光团的细胞表面标记物抗_CD19(B细胞)、抗-CD3 (T细胞)、抗-NKp46 (NK细胞)和抗-F4/80 (巨噬细胞)在BD LSR II系统(BDBioscience)上通过FACS鉴定淋巴细胞群体。针对特定细胞谱系门控淋巴细胞，利用大鼠抗-小鼠 Fe Y RIII/II 抗体(克隆 2. 4G2, BD Biosciences)分析内源Fe Y RIII 和 Fe Y RIIB的表达。克隆2. 4G2识别鼠Fe Y RIII和Fe Y RII的细胞外结构域上的共同多态性表位。结果显示在mFc Y R KO小鼠的B-细胞、NK细胞和巨噬细胞上不存在可检测的鼠低亲和力FcyRIII 或 Fe Y RII (图 2)。ADCC测定。从Fe Y R基因缺陷型小鼠和野生型小鼠分离脾细胞，在细胞杀伤测定中分析它们进行ADCC的能力。使用MACS 技术(Miltenyi Biotec)分离和分开细胞群体。简而言之，使用磁性标记的抗-小鼠CD3珠粒从脾细胞耗尽T细胞。随后使用磁性标记的抗-小鼠CD49B珠粒就NK细胞富集T细胞耗尽的脾细胞。单独地，用不同浓度(范围从O. I 至 10 μ g/mL)的小鼠抗 _ 人 CD20 抗体(克隆 BI; BeckmanCoulter)在 4。C 包被 Raji细胞(表达人⑶20) 30分钟。以100:1和50:1的比率(NK = Raji)将抗体包被的Raji细胞与富集的NK细胞在37° C温育4小时。使用CytoTox-Glo 细胞毒性测定法(Promega)测量细胞死亡。发光信号来源于裂解的细胞并且与死亡细胞的数目成正比。就每一个比率的本底死亡细胞计数测定来自对照(无抗-CD20抗体)的发光，从野生型和KO小鼠的测量扣除该发光。计算平均细胞死亡，通过与野生型相比较测定细胞杀伤的百分比减少(%ADCC)。结果不于表I中。表I
[012权利要求
1.包含遗传修饰的小鼠，其中所述遗传修饰包括以置于内源小鼠低亲和力FeY R基因基因座上的至少两个低亲和力人Fe Y R基因替代内源低亲和力Fe Y R基因，并且其中所述小鼠包含功能性FcR Y链。
2.权利要求I所述的小鼠，其中至少两个低亲和力人FeYR基因选自FcyRIIA、Fe Y RIIB、Fe Y RIIC、Fe y RIIIA 和 Fe y RIIIBo
3.权利要求I所述的小鼠，其中至少两个低亲和力人FeY R基因为Fe Y RIIA和Fe Y RIIIAo
4.权利要求3所述的小鼠，其中人FeY RIIIA在小鼠的NK细胞上表达。
5.权利要求I所述的小鼠，其中所述至少两个低亲和力人FeY R基因为FcyRIIB、Fe Y RIIC 和 Fe Y RIIIBo
6.权利要求3所述的小鼠，其中所述FeY RIIA和Fe Y RIIIA基因包含等位基因变体或多态性。
7.权利要求5所述的小鼠，其中所述小鼠包含人低亲和力FeY R等位基因变体，并且所述等位基因变体选自(a)Fe Y RIIA等位基因变体131H，(b)Fe Y RIIIA等位基因变体158V，(c)Fc Y RIIB等位基因变体2321，(d)特征在于嗜中性粒细胞抗原2 (NA2)等位基因的Fe Y RIIIB等位基因变体，及(e)它们的组合。
8.遗传修饰的小鼠，其中所述遗传修饰包括以编码人FeY RIIIA α -亚基的基因替代编码FcyRIIB、FcyRIII和Fe Y RIV α -亚基的内源小鼠基因，其中所述小鼠表达与内源小鼠FcR Y -亚基结合的人Fe Y RIIIA蛋白，其中人Fe Y RIIIA蛋白在小鼠NK细胞的表面上表达。
9.权利要求8的遗传修饰的小鼠，其中小鼠NK细胞是小鼠血液中的循环NK细胞，并且在小鼠NK细胞表面上表达的Fe Y RIIIA蛋白结合包含人Fe或修饰的人Fe的免疫粘附素或抗体，其中免疫粘附素或抗体特异性结合小鼠中的靶细胞，并且免疫粘附素或抗体对NK细胞的Fe YRIIIA的结合介导靶细胞的NK细胞杀伤。
10.权利要求9的遗传修饰的小鼠，其中用人病原体感染靶细胞，并且免疫粘附素或抗体特异性结合人病原体的表位。
11.权利要求9的遗传修饰的小鼠，其中所述靶细胞是肿瘤细胞，并且免疫粘附素或抗体特异性结合肿瘤细胞的表位。
12.用于测量治疗依赖性细胞杀伤的方法，包括 (a)给遗传修饰的小鼠施用特异性结合小鼠中的不是NK细胞的靶细胞的治疗剂，其中所述治疗剂包含人Fe ； (b)测量小鼠或小鼠的组织样品中的NK介导的靶细胞杀伤的水平；和 (c)测定由所述治疗剂介导的靶细胞杀伤的量，从而测量治疗依赖性细胞杀伤； 其中所述遗传修饰包括编码小鼠Fe Y RIIB的α -亚基的基因的缺失、编码小鼠Fe Y RIII的α -亚基的基因的缺失和编码小鼠Fe Y RIV的α -亚基的基因的缺失，并且其中所述小鼠在内源小鼠α-亚基基因座上包含编码人Fe Y RIIIA的α-亚基的基因，并且其中所述小鼠表达功能性FcRy链亚基。
13.权利要求12的方法，其中所述小鼠还在内源小鼠α-亚基基因座上包含编码选自Fe Y RIIA α -亚基、Fe Y RIIB α -亚基、Fe Y RIIC α -亚基、Fe Y RIIIB α -亚基及其组合的人Fe YRa-亚基的基因。
14.权利要求12的方法，其中所述靶细胞为人病原体，并且所述治疗剂特异性结合人病原体的表位。
15.权利要求12的方法，其中靶细胞为被人病原体感染的小鼠细胞，并且所述治疗剂特异性结合所述人病原体的表位。
16.权利要求12的方法，其中所述靶细胞为被人病原体感染的人细胞，并且所述治疗剂特异性结合所述人病原体的表位。
17.权利要求12的方法，其中靶细胞为人肿瘤细胞，并且所述治疗剂特异性结合所述人肿瘤细胞的表位。
18.权利要求12的方法，其中所述组织样品为血液样品。
19.权利要求12的方法，其中所述治疗剂为抗体。
20.权利要求17的方法，其中所述抗体为人抗体。
全文摘要
提供了遗传修饰的非人动物和用于产生和使用它们的方法和组合物，其中所述遗传修饰包括内源低亲和力FcγR基因座的缺失，并且其中小鼠能够表达功能性FcRγ链。描述了遗传修饰的小鼠，包括从内源FcγR基因座表达低亲和力人FcγR基因的小鼠，并且其中所述小鼠包含功能性FcRγ链。提供了在宿主免疫系统的辅助细胞上表达至多5个低亲和力人FcγR基因的遗传修饰的小鼠。
文档编号C07K14/705GK102762590SQ201080064262
公开日2012年10月31日 申请日期2010年12月17日 优先权日2009年12月21日
发明者A·J·墨菲, C·古尔, L·麦克唐纳, S·史蒂文斯, 涂纳新 申请人:瑞泽恩制药公司