利用重组人IL-26分选小鼠Th17细胞的方法
【专利摘要】本发明公开了利用重组人IL-26分选小鼠Th17细胞的方法，具体为收集小鼠外周血，分离单核细胞，然后用PBS洗涤，离心收集细胞，用PBS液重悬后分离CD4+CD45RO+T细胞；然后将CD4+CD45RO+T细胞用同种荧光标记的IL23R、CD161、CCR6三种抗体染色，用流式细胞仪分选IL23R、CD161和CCR6为阴性的细胞，得IL23R-CD161-CCR6-细胞；所得IL23R-CD161-CCR6-细胞用小鼠CD3抗体和重组人IL-26刺激细胞，得小鼠Th17细胞，获得的小鼠Th17细胞具有活性功能，并且纯度高，其纯度达87%，为体外研究Th17细胞奠定了基础。
【专利说明】利用重组人IL-26分选小鼠Thl 7细胞的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及细胞生物学领域，具体涉及利用重组人IL-26分选小鼠Thl7细胞的方法。
【背景技术】
[0002]辅助性T细胞17 (Thl7)是⑶4+的免疫细胞亚群，它与多种免疫性疾病和炎症性疾病有密切关系，Thl7细胞主要通过分泌人白介素17A (IL-17A)、人白介素17F (IL-17F)等细胞因子参与炎症的发生，这些细胞因子主要刺激血管内皮细胞分泌黏附分子，进而介导炎细胞对组织的浸润；Thl7细胞也可以分泌人白介素21 (IL-21)、人白介素22(IL-22)、人白介素26 (IL26)等细胞因子并参与炎症影响炎症的进程。ROR y t、⑶4+是Thl7细胞的重要标志之一。因此，通常利用IL-17+⑶4+和ROR Y t+⑶4+作为Thl7细胞的标记用于流式检测，但是由于体内Thl7细胞的数量有限，现有的分选方法并不能获得数量较多的Thl7细胞。并且，由于RORy t、IL-17均为细胞内分泌因子，因此分选前需要先对细胞打孔然后染色，这使得细胞的活性无法保障，严重影响后续体外实验。
[0003]因此，急需一种分选Thl7细胞的方法，其获得量多，并分选的细胞活力，为进一步研究Thl7细胞奠定了基础。
【发明内容】
[0004]有鉴于此，本发明的目的在于提供一种利用重组人IL-26分选小鼠Thl7细胞的方法，能够在短时间内获得大量功能性的Thl7细胞，方法简单，易于操作，节省时间。
[0005]为实现上述发明目的，技术方案为:
[0006]利用重组人IL-26分选小鼠Thl7细胞的方法，包括如下步骤:
[0007]B.收集小鼠外周血，加入PBS稀释血液，然后覆盖于人淋巴细胞分离液表面，人淋巴细胞分离液的体积相当于稀释血液体积的1/4-2倍，然后在转速为2000-2500rpm条件下离心20-30分钟，吸取淋巴细胞层，并用相当于淋巴细胞层体积1-20倍的PBS洗涤，离心收集细胞，用PBS液重悬细胞后分离⑶4+⑶45R0+T细胞；
[0008]B.将步骤A分离的⑶4+CD45R0+T细胞用同种荧光标记的IL23RXD161和CCR6三种抗体染色，用PBS洗涤细胞后在800-1600rpm条件下离心8_15分钟，然后用流式细胞仪分选IL23R、CD161和CCR6为阴性的细胞，得IL23RXD16rCCR6-细胞；
[0009]C.将步骤B所得IL23RTD161XCR6_细胞加入含胎牛血清的RPMI1640培养基，RPMI1640培养基中胎牛血清体积分数为10%，然后置于37°C、体积分数为5%的CO2培养箱内培养5-8小时，再加入100-2000ng/mL的小鼠CD3抗体和30_400ng/mL的重组人IL-26刺激细胞2-24小时，收集细胞，得为小鼠Thl`7细胞。
[0010]优选的，所述步骤A为收集小鼠外周血，加入等体积的0.01mol/L、pH7.2的PBS稀释血液，然后覆盖于人淋巴细胞分离液表面，人淋巴细胞分离液的体积相当于稀释血液体积的1/3，然后在转速为2000rpm条件下离心20分钟，吸取淋巴细胞层，并用相当于淋巴细胞层10倍体积的PBS洗涤，离心收集细胞，用PBS液重悬细胞后分离⑶4+CD45RO+T细胞。
[0011]优选的，所述步骤B为将步骤A所得⑶4+⑶45R0+T细胞用同种荧光标记的IL23R、CD161和CCR6三种抗体在10°C下染色30分钟，用PBS洗涤细胞三次后在800rpm条件下离心10分钟，然后用流式细胞仪分选IL23R、CD161和CCR6为阴性的细胞，得IL23RXD16rCCR6-细胞。
[0012]优选的，所述步骤C是将步骤B所得IL23RTD161_CCR6_细胞收集于96孔板中，每孔加入200 μ L含胎牛血清的RPMI1640培养基，RPMI1640培养基中胎牛血清的体积百分比为10%，然后置于37°C、体积分数为5%的CO2培养箱内培养5小时，再加入500ng/mL的小鼠⑶3抗体和100ng/mL的重组人IL-26刺激细胞10小时。
[0013]本发明的有益效果在于:本发明公开了利用重组人IL-26分选小鼠Thl7细胞的方法，利用同种荧光标记的IL23R、⑶161和CCR6三种抗体染色，通过流式分选IL23R-CD161XCR6三阴性细胞，再在CD3抗体和IL-26共同作用下，刺激IL23RXD16rCCR6_三阴性细胞群分化为Thl7细胞，因此，利用本发明公开的方法能够获得纯度较高的Thl7细胞，其纯度达到87%，并且利用此方法分选Thl7细胞不需要染色前对细胞打孔，能够获得有活性功能的细胞，为体外研究Thl7细胞奠定了基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图:
[0015]图1为利用ROR Y t为标记物分选细胞的结果图。
[0016]图2为重组人IL-26刺激前后IL-17基因的表达结果。
【具体实施方式】
[0017]下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
[0018]本发明中重组人IL-26购自英国abcame公司(货号为:abl63231);人淋巴细胞分离液购自天津TBD公司(货号为:LTS1092);逆转录试剂众RcverTra Ace? qPCR RT Kit购自日本TOYOBO公司(货号为:FSQ-101);荧光定量检测试剂盒SYBR GREEN Realtime PCRMaster Mix购自日本TOYOBO公司(货号为:FSQ_101)
[0019]实施例1
[0020]利用重组人IL-26分选小鼠Thl7细胞的方法，具体步骤如下:
[0021]A.收集小鼠外周血，加入等体积的0.01mol/L,pH为7.2的PBS稀释血液，然后覆盖于人淋巴细胞分离液表面，人淋巴细胞分离液的体积相当于稀释血液体积的1/3，然后在转速为2000rpm条件下离心20分钟，吸取淋巴细胞层，并用相当于淋巴细胞层体积10倍的PBS洗涤，离心收集细胞，再用500μ L的PBS液重悬细胞，最后用试剂盒(美国STEMCELL，货号:19767)分离 CD4+CD45R0+T 细胞；
[0022]B.将步骤A所得CD 4+CD45R0+T细胞用同种荧光标记的IL23R、CD161、CCR6三种抗体10°C条件下，染色30分钟，用3mL PBS洗涤细胞三次后在800rpm条件下离心10分钟，然后用流式细胞仪分选IL23R、CD161和CCR6为阴性的细胞，得IL23RXD16rCCR6_细胞；
[0023]C.将步骤B所得IL23RTD161_CCR6_细胞收集于96孔板中，每孔加入200 μ L含胎牛血清的RPMI1640培养基，RPMI1640培养基中胎牛血清体积分数为10%，然后置于37°C，体积分数5%的CO2培养箱内培养5小时，再加入500ng/mL的小鼠⑶3抗体和100ng/mL的重组人IL-26刺激细胞10小时，得小鼠Thl7细胞。
[0024]本实施例为本发明的最佳实施例，将收集细胞上流式细胞仪分选，结果如图1所示。结果显示，经重组人IL-26刺激后小鼠Thl7细胞达到87%。
[0025]取IL-26刺激前和刺激后的细胞，用细胞计数取数量相同的细胞，然后用TRIZOL裂解液分别提取细胞总RNA，然后使用逆转录试剂盒RcvcrTra Ace? qPCR RT Kit合成cDNA。再根据IL-17基因设计荧光定量引物，并以GAPDH基因为内参，其荧光定量使用的引物如下:
【权利要求】
1.利用重组人IL-26分选小鼠Thl7细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤:A.收集小鼠外周血，加入PBS稀释血液，然后覆盖于人淋巴细胞分离液表面，人淋巴细胞分离液的体积相当于稀释血液体积的1/4-2倍，然后在转速为2000-2500rpm条件下离心 20-30分钟，吸取淋巴细胞层，并用相当于淋巴细胞层体积1-20倍的PBS洗涤，离心收集细胞，用PBS液重悬细胞后分离⑶4+⑶45RO+T细胞；B.将步骤A分离的⑶4+⑶45RO+T细胞用同种荧光标记的IL23RXD161和CCR6三种抗体染色，用PBS洗涤细胞后在800-1600rpm条件下离心8_15分钟，然后用流式细胞仪分选 IL23R、CD161 和 CCR6 为阴性的细胞，得 IL23RTD161XCR6-细胞；C.将步骤B所得IL23RXD16rCCR6_细胞加入含胎牛血清的RPMI1640培养基， RPMI1640培养基中胎牛血清体积分数为10%，然后置于37°C、体积分数为5%的CO2培养箱内培养5-8小时，再加入100-2000ng/mL的小鼠CD3抗体和30_400ng/mL的重组人IL-26 刺激细胞2-24小时，收集细胞，得为小鼠Thl7细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述步骤A为收集小鼠外周血，加入等体积的0.01mol/L、pH7.2的PBS稀释血液，然后覆盖于人淋巴细胞分离液表面，人淋巴细胞分离液的体积相当于稀释血液体积的1/3，然后在转速为2000rpm条件下离心20分钟，吸取淋巴细胞层，并用相当于淋巴细胞层10倍体积的PBS洗涤，离心收集细胞，用PBS液重悬细胞后分离CD4+CD45R0+T细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述步骤B为将步骤A所得CD4+CD45R0+T 细胞用同种荧光标记的IL23R、CD161和CCR6三种抗体在10°C下染色30分钟，用PBS洗涤细胞三次后在800rpm条件下离心10分钟，然后用流式细胞仪分选IL23RXD161和CCR6为阴性的细胞，得IL23RTD16rCCR6-细胞。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于:所述步骤C是将步骤B所得 IL23RXD16rCCR6-细胞收集于96孔板中，每孔加入200 μ L含胎牛血清的RPMI1640培养基，RPMI1640培养基中胎牛血清的体积百分比为10%，然后置于37°C、体积分数为5%的CO2 培养箱内培养5小时，再加入500ng/mL的小鼠⑶3抗体和100ng/mL的重组人IL-26刺激细胞10小时。`
【文档编号】C12N5/0783GK103555667SQ201310489260
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年10月17日 优先权日:2013年10月17日
【发明者】田志强, 倪兵, 吴玉章, 杨玓, 颜秋萍, 田易, 张轶, 倪东京, 张梦洁, 杨爽, 朱小霜 申请人:中国人民解放军第三军医大学