一种ln-1免疫致小鼠生育障碍模型的构建的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种生育障碍，即复发性流产及不孕的小鼠模型的建立方法。该小鼠模型的建立方法通过用LN-1主动免疫免疫BALB／c小鼠，产生层粘连蛋白-1自身抗体(LN-1)，该抗体会引起自身免疫反应，诱导小鼠的流产及不孕。抗层粘连蛋白-1自身抗体(抗LN-1抗体)具有引起早孕阶段的习惯性流产甚至不孕的特点。该模型稳定，安全可靠，可重复率高，可用于目前发病率越来越高的复发性流产及不孕症的医学基础研究及临床研究，并且可以用为对药物疗效的观察，有良好的应用前景。
【专利说明】一种LN-1免疫致小鼠生育障碍模型的构建
【技术领域】 [0001] 生育功能障碍方面
【背景技术】 [0002] 生殖是医学研究的热点，复发性流产是生育期妇女常见的妊娠并发 症，复发性自然流产的病因及病理机制非常复杂，其中有大约50%尚无明确病因，研究发 现，免疫因素在其病理机制中占有重要位置。近代生殖免疫研究表明，复发性流产和不孕 的病因，除染色体、解剖和内分泌异常外，约50%?60%与免疫有关。流产史的猴子血清 中，并且该抗体尤其与子宫内膜异位证的复发性流产及不孕有相关性。从生殖免疫观点 看来，妊娠是一种成功的半同种移植，妊娠失败、流产可看为移植失败。除常见原因（染 色体、解剖、内分泌、感染）之外，许多原因不明的流产可能与免疫排斥，即自身抗体的存 在有关。国外文献报道：抗层粘连蛋白-1抗体与复发性流产及不孕相关。层粘连蛋白-1 是由α?，β?， Y1链组成的异三聚体，最初是由Ruper Timp等于20世纪70年代从小鼠 EHS(engel-breth-holm-swarm)肉瘤中分离出来的。层粘连蛋白-1属于黏附分子整合素 蛋白家族，为细胞外基质的主要成分，是细胞黏附于基质的重要介质，与其受体结合后直接 或间接控制细胞活动，如粘附或转移、极化和分化、增殖或凋亡、基因表达及刺激癌细胞产 生胶原酶等，并在滋养细胞的黏附、侵入过程中有重要作用。抗LN-1的自身抗体在生殖中 有重要作用。动物实验表明，习惯性流产或不孕与自身抗体有关，抗层粘连蛋白-1自身抗 体首先发现于有习惯性流产史的猴子血清中，用鼠层粘连蛋白-1或其层粘连蛋白-1残基 免疫猴，猴血清会引起胚胎毒性，不孕或习惯性流产。定位该抗体，发现其位于来自胚胎的 Reicher' s膜和卵黄囊内胚层细胞。临床研究显示，习惯性流产患者血清中的IgG层粘连 蛋白-1自身抗体明显升高。而且，其增高与其它IgG自身抗体如β 2糖蛋白-1依赖的抗 心磷脂抗体，狼疮抗体，抗DNA抗体，抗核抗体等无关。推测血清中的层粘连蛋白-1自身抗 体可能引起人类早孕阶段的习惯性流产。构建动物模型可以更好的进行医学基础及临床研 究，但鉴于国情及各医学院校的条件，构建猴子、狗等动物模型不切实际，故我们构建小鼠 的模型更加具有普遍性。建立可行的LN-1免疫流产小鼠模型，为研究相关流产及不孕的病 因的基础研究提供研究对象，为探讨复发性流产及不孕药物治疗的新途径提供研究平台。
【发明内容】
[0003] 层粘连蛋白-1自身抗体可能引起早孕阶段的习惯性流产。
[0004] 选取雌性BALB / C小鼠，8-10周。在模型组的雌性小鼠后脚真皮内注射15ugLN-l 蛋白免疫小鼠；空白组仅注射完全弗氏佐剂。3周后加强免疫一次，第8周小鼠合笼，观察 妊娠结局及进行相关指标的检测。
[0005] 本发明采用的小鼠为BALB / c清洁级近交系小鼠。
[0006] 该抗体可用于建立习惯性流产及不孕的小鼠模型，可用于复发性流产及不孕症的 基础及临床研究。
【专利附图】
【附图说明】 [0007] 图1.本发明的技术路线。
【具体实施方式】 [0008] ：1. 1实验动物雌性BALB / C小鼠，8-10周，45只，体重20-22克， 由北京维通利华实验动物有限公司提供。
[0009] 1. 2药物抗层粘连蛋白-1 (LN-1) sigma产
[0010] 1. 3试剂：聚丙乙烯板上包被，胎牛血清，辣根过氧化物酶，含双氧水的邻苯二胺， 硫fe。
[0011] 1.4实验方法
[0012] 1. 4. 1.实验分组：对照组（30只）、模型组（45只）
[0013] 1. 4. 2将免疫用的LN-1与完全弗氏佐剂乳化；
[0014] 1. 4. 3在模型组的雌性小鼠后脚真皮内注射15ugLN_l蛋白免疫小鼠；空白组仅注 射完全弗氏佐剂。
[0015] 1. 4. 43周后模型组的雌性小鼠同一部位再次注射含15ugLN-l的PBS，对照组注射 PBS。
[0016] 1. 4. 58周后对2组小鼠采血测定抗LN-1抗体，与雄性1 :1交配一周，等到生产后 3天再次采血，测定抗LN-1抗体，计算各组妊娠率，流产率，产子率。
[0017] 1. 4. 5.应用ELASE方法，取各组血清进行层粘连蛋白-1抗体测定。
[0018] 1. 4. 6在490nm处测定光密度（0D值）。分别计算出的平均0D值，得出抗体滴度。
[0019] 2·结果：
[0020] 2. 1小鼠的妊娠率及流产率：对照组30只中27只生产，其中2只共有4只死胎； 模型组45只中4只生产，其中1只有流产现象，生产数量不明，另一只难产，辅助取胎，6只 小鼠均为死胎。结果：对照组妊娠率90%，模型组组妊娠率8. 89%，对照组流产率为0,模 型组组流产率25%。故生育障碍的模型小鼠建立成功。
[0021]
【权利要求】
1. 选取8-10周雌性BALB / C小鼠。
2. 雌性小鼠后脚真皮内注射15ugLN-l蛋白免疫小鼠，3周后加强免疫一次，第8周小 鼠合笼。
3. 本发明采用的小鼠为BALB / c清洁级近交系小鼠。
【文档编号】A61K39/395GK104147600SQ201310547210
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2013年11月8日 优先权日:2013年11月8日
【发明者】杨桦, 蔺莉 申请人:首都医科大学附属北京友谊医院