专利名称：用于免疫可比性的体内模型的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种体内模型，其用于评估基于抗体的不同治疗或诊断制剂的相对免疫原性。免疫原性是通过包含如下步骤的方法进行比较的a)产生抗体转基因的非人动物，b)将所述转基因非人动物与外源抗体接触，在此所述的外源抗体是(a)中转基因抗体或其变体的标准制剂，和c)测定由(b)的外源抗体引发的转基因非人动物的免疫应答。
背景技术：
1986年，随着重组鼠抗体Orthoclone即OKT-3(适应症为预防肾移植中同种异体移植物的排斥)的批准，治疗性单克隆抗体被引入临床实践[Proceedings of an international symposium on monoclonal antibody therapywith orthoclone OKT3 in renal transplantation.Transplant Proc，1986.18(4)p.923-56；Burdick，J.F.等人，Reversal if progressive renal allograftdysfunction with OKT3.Nephron，1987.46 Suppl 1p.52-5；Farges，O.等人，A randomized trial of OKT3-based versus cyclosporine-basedimmunoprophylaxis after liver transplantation.Long-term results of aEuropean and Australian multicenter study.Transplantation，1994.58(8)p.891-8；Farrell，M.L.，Orthoclone OKT3a treatment for acute renal allograftrejection.Anna J，1987.15(6)p.373-6；Friedman，J.等人，OrthocloneOKT3 treatment of acute renal allograft rejection.Transplant Proc，1987.19(2 Suppl 2)p.46；Gordon，R.D.等人，Experience with Orthoclone OKT3monoclonal antibody in liver transplantation.Am J Kidney Dis，1988.11(2)p.141-4；Smith，S.L.，Ten years of Orthoclone OKT3(muromonab-CD3)areview.J Transpl Coord，1996.6(3)p.109-19；quiz 120-1]。1994年，FDA正式批准了ReoPro[Tcheng，J.E.，Dosing and administration of ReoPro(c7E3 Fab).J Invasive Cardiol，1994.6 Suppl Ap.29A-33A；discussion51A-54A；Faulds，D.和E.M.Sorkin，Abciximab(c7E3 Fab).Areview of itspharmacology and therapeutic potential in ischaemic heart disease.Drugs，1994.48(4)p.583-98；Huston，J.S.和A.J.George，Engineered antibodiestake center stage.Hum Antibodies，2001.10(3-4)p.127-42]，这表明制药工业对治疗性抗体的治疗剂潜力以及商业潜力的接受最初很缓慢。与生物治疗剂的大规模生产相关的技术挑战，癌症治疗的早期挫折，以及对于治疗剂在人体内引发的免疫反应的关注，这些都在很大程度上解释了这些新的治疗剂的延迟发展。
近来，通过在抗体产生、发展和生产技术方面的改进，已克服了很多与治疗性抗体相关的早期困难[Kipriyanov，S.M.和F.Le Gall，Generationand production of engineered antibodies.Mol Biotechnol，2004.26(1)p.39-60]。2002年，美国正式批准了13种基于单克隆抗体的治疗剂，另有400种产品处于临床试验阶段[Gura，T.，Therapeutic antibodiesmagicbullets hit the target.Nature，2002.417(6889)p.584-6]。然而，关于针对很多这些治疗剂所产生的免疫原性应答的可获得信息仍然有限[Schellekens，H.，Bioequivalence and the immunogenicity of biopharmaceuticals.Nat RevDrug Discov，2002.1(6)p.457-62；Schellekens，H.，When biotech proteinsgo off-patent.Trends Biotechnol，2004.22(8)p.406-10]。
与小分子药物形成对照，治疗性抗体是具有高度复杂的三维结构的大分子。虽然使用灵敏的物理化学分析方法能较好地表征合成药物，但仅仅使用物理化学方法不能充分地表征重组蛋白质。重组生物蛋白质由内在可变的遗传修饰细胞分泌。产物能以不同的异构体产生，或可形成团聚体。糖基化作用和其它翻译后修饰是导致异质性的其它复杂因素。用于生物治疗剂的生产方法远比用于合成药物产品的方法复杂得多。因此生物治疗性蛋白质的最终性质很大程度上取决于生产方法[Rosenberg，A.S.，Immunogenicity of biological therapeuticsa hierarchy of concerns.Dev Biol(Basel)，2003.112p.15-21]，并且也可能受剂型的影响。批次到批次(Batch-to-batch)的变化是很普遍的，这使得重复性成为评估产品质量的标准之一。由于物理化学方法不能充分表征生物治疗性产品，因此需要生物系统与物理化学数据相补充来表征该产品[Schellekens，H.，Bioequivalenceand the immunogenicity of biopharmaceuticals.Nat Rev Drug Discov，2002.1(6)p.457-62]。确保不同生产批次在它们的内在免疫学性质上具有可比性已成为生物治疗剂生产中所面临的最严峻的挑战之一。
当将治疗性蛋白质施与患者时，它们大多数都能诱导免疫应答[Ryff，J.C.和H.Schellekens，Immunogenicity of rDNA-derived pharmaceuticals.Trends Pharmacol Sci，2002.23(6)p.254-6]，治疗性抗体也不例外[Ryff，J.C.和H.Schellekens，Immunogenicity of rDNA-derived pharmaceuticals.Trends Pharmacol Sci，2002.23(6)p.254-6]。然而，抗产品抗体的发生在不同产品之间大为不同，有些在大多数个体中都能诱导抗体，而对于其它的来说很少发生免疫反应[Schellekens，H.，Immunogenicity of therapeuticproteinsclinical implications and future prospects.Clin Ther，2002.24(11)p.1720-40；discussion 1719]。很多因素影响免疫应答的产生，它们可能是抗体结构内非人氨基酸序列的存在、靶分子的性质、应用途径或作为治疗剂适应症的疾病类型。在含有完全相同的氨基酸一级序列的相同产品的两次装料(charges)中，团聚体的形成、蛋白质的差异折叠的三维结构的存在，或杂质的存在都可以严重影响免疫原性[Schellekens，H.，When biotechproteins go off-patent.Trends Biotechnol，2004.22(8)p.406-10]。当抗产品抗体与患者的内源性蛋白质交叉反应时，令人印象深刻地观察到了惊人的免疫原性后果，这在重组促红细胞生成素-α的剂型变化后观察到[Casadevall，N.，Antibodies against rHuEPOnative and recombinant.Nephrol Dial Transplant，2002.17 Suppl 5p.42-7；Casadevall，N.，Purered cell aplasia and anti-erythropoietin antibodies in patients treated withepoetin.Nephrol Dial Transplant，2003.18 Suppl 8p.viii37-41；Casadevall，N.和L.Croisille，[Erythropoiesis disorders and other central autoimmuneanemias].Rev Prat，2001.51(14)p.1547-51；Casadevall，N.等人，Purered-cell aplasia and antierythropoietin antibodies in patients treated withrecombinant erythropoietin.N Engl J Med，2002.346(7)p.469-75]。因此迫切需要监测生产变化对产品就免疫原性而言的质量所产生的结果的系统。
使用包括分离的人树突细胞和人T辅助淋巴细胞的体外系统能够很容易地监测到蛋白质的一级序列变化[Stickler，M.M.，D.A.Estell和F.A.Harding，CD4+T-cell epitope determination using unexposed human donorperipheral blood mononuclear cells.J Immunother，2000.23(6)p.654-60]。这些模型可受T细胞前体发生频率中供体-到-供体的差异和MHC多态性的限制，因此迫使人们研究大量具有不同MHC基因型的供体以得出具有统计学意义的结果。更重要的是，在分离的体外系统中不能监测到除了一级结构之外的但涉及蛋白质三级结构的更微小的变化，因此需要更为完整的免疫系统模型。通过体内动物系统能够提供这样的模型。
特别是，人同系物在动物体内是免疫原性的，同样，在动物体内测试人抗体很难预测它们在人体内的免疫原性潜力[Schellekens，H.，Bioequivalence and the immunogenicity of biopharmaceuticals.Nat RevDrug Discov，2002.1(6)p.457-62]。然而，在有些情况中可以评估不同制剂的相对免疫原性[Palleroni，A.V.，等，Interferon immunogenicitypreclinical evaluation of interferon-alpha 2a.J Interferon Cytokine Res，1997.17 Suppl 1p.S23-7]。虽然人蛋白质对动物来说是外来的并因此将引起免疫应答，但已被转入了目的人蛋白质的转基因动物将把该转基因识别为自身的(基因)并对由该转基因所编码的蛋白质变得耐受。虽然目前没有动物模型或体外系统能预测针对人体内治疗性蛋白质的免疫应答(这只能在临床试验中排他且可靠地测定)，但人抗体转基因小鼠[Storb，U.，Transgenic mice with immunoglobulin genes.Annu Rev Immunol，1987.5p.151-74]是评价造成破坏B细胞针对治疗性抗体的耐受性的因素的最好的模型，并将因此构成评估免疫可比性的重要工具，也就是，评估生产变化对转基因小鼠内治疗性抗体的相对免疫原性性能的影响。
抗体转基因小鼠是本领域众所周知的；然而，尚未采用它们来解决治疗性抗体的免疫可比性评估的问题。本发明致力于解决在人体外系统中所遇到的缺陷，并为目前尚未解决的确保治疗性抗体的免疫可比性的问题提供一种解决方案。
发明内容
本发明提供一种用于评估抗体的免疫可比性的方法，由此能够确定抗体制剂相对于标准抗体制剂来说引起免疫应答与否(相对免疫原性)。
本发明提供一种用于确定外源抗体的相对免疫原性的方法，其包括如下步骤a)产生对标准抗体转基因的非人动物，b)将所述转基因非人动物与外源抗体接触，此处所述的外源抗体是转基因标准抗体的变体，和c)确定由(b)的外源抗体引起的转基因非人动物的免疫应答。
外源抗体可以是治疗性抗体。优选地，外源抗体是人的、人源化的或嵌合抗体。更优选地，转基因抗体是免疫球蛋白γ(IgG)。甚至更优选地，该抗体是抗人淀粉状蛋白β-肽或其变体的抗体。最优选的抗体是抗-AβIgG的变体。该抗-AβIgG详细描述于专利申请WO03/070760之中，其在此完整引用作为参考。
优选地，转基因标准抗体是人的、人源化的或嵌合抗体。更优选地，转基因抗体是免疫球蛋白γ(IgG)。甚至更优选地，该抗体是抗人淀粉状蛋白β-肽的抗体。最优选的抗体是抗-AβIgG。
转基因非人动物可以是任何非人动物。优选的非人动物是哺乳动物。更优选地，该非人动物是啮齿类动物，例如小鼠或大鼠。
如文中所用的术语“标准抗体”指的是在确定条件下产生的抗体，其用作定量或定性值比较的公认量度。
如文中所用的术语“变体”或“抗体变体”指的是在结构特征、制备方法、剂型、或保存条件方面与标准抗体不同的抗体。结构变体可包含一级、二级和三级蛋白质结构的变异(即构象变化)、氨基酸的糖基化作用和化学修饰。进一步的结构变异即是备选的结构域间构建体(VL/VL，VH/VH)、二聚体、寡聚体和较大的团聚体。
可能影响相对免疫原性性能的因素可包含药物物质的结构改变、药品的剂型、杂质和污染物。特别关注的是，可能由下游加工、储存、配制和处理的改变而引起的天然蛋白质及其结构变体之间免疫原性的差别[Sharma，V.K.和D.S.Kalonia，Temperature- and pH-induced multiplepartially unfolded states of recombinant human interferon-alpha2apossibleimplications in protein stability.Pharm Res，2003.20(11)p.1721-9；Chirino，A.J.和A.Mire-Sluis，Characterizing biological products and assessingcomparability following manufacturing changes.Nat Biotechnol，2004.22(11)p.1383-91]。这些变异包括一级结构的改变，例如氨基酸交换，糖基化变体和化学修饰，例如乙酰化作用，天冬酰胺脱氨基作用，甲硫氨酸、组氨酸或色氨酸氧化作用或者其它由例如氧化或光应激、具有诱导衍生作用潜能的赋形剂或杂质导致的化学修饰[Moss，C.X.等人，Asparaginedeamidation perturbs antigen presentation on class II MHC molecules.J BiolChem，2005；Mamula，M.J.等人，Isoaspartyl post-translational modificationtriggers autoimmune responses to self-proteins.J Biol Chem，1999.274(32)p.22321-7；Duenas，E.T.等人，Comparison between light induced andchemically induced oxidation of rhVEGF.Pharm Res，2001.18(10)p.1455-60；Gribben，J.G.等人，Development of antibodies to unprotectedglycosylation sites on recombinant human GM-CSF.Lancet，1990.335(8687)p.434-7；Mimura，Y.等人，Role of oligosaccharide residues of IgG1-Fc in Fcgamma RIIb binding.J Biol Chem，2001.276(49)p.45539-47；Chianese-Bullock，K.A.等人，Antigen processing of two H2-IEd-restrictedepitopes is differentially influenced by the structural changes in a viralglycoprotein.J Immunol，1998.161(4)p.1599-607；Khossravi M，Shire SJ，Borchardt RT.Evidence for the involyement of histidine A(12)in theaggregation and precipitation of human relaxin induced by metal-catalyzedoxidation.Biochemistry.2000 May 16；39(19)5876-85；Margiloff L，ChapliaL，Chow A，Singhal PC，Mattana J.Metal-catalyzed oxidation ofimmunoglobulin G impairs Fc receptor-mediated binding to macrophages.Free Radic Biol Med.1998 Nov 1；25(7)780-5；Duenas，E.T.等人，Comparison between light induced and chemically induced oxidation ofrhVEGF.Pharm Res，2001.18(10)p.1455-60]。通过全部或部分还原、分子内二硫桥键的改变(“不规则性”)，或分子内共价交联，二级和三级结构的变体例如能作为一级结构的修饰结果出现。例如通过热应激、pH短暂改变或与有机溶剂孵育，能形成一级序列与天然蛋白相同的构象异构体[Sharma，V.K.和D.S.Kalonia，Temperature- and pH-induced multiplepartially unfolded states of recombinant human interferon-alpha2apossibleimplications in protein stability.Pharm Res，2003.20(11)p.1721-9；Vermeer，A.W.和W.Norde，The thermal stability of immunoglobulinunfolding and aggregation of a multi-domain protein.Biophys J，2000.78(1)p.394-404；Ronnelid，J.等人，Immune complexes from SLE sera induceIL10 production from normal peripheral blood mononuclear cells by anFcgammaRII dependent mechanismimplications for a possible vicious cyclemaintaining B cell hyperactivity in SLE.Ann Rheum Dis，2003.62(1)p.37-42；Melnikova，Y.I.等人，Antigen-binding activity of monoclonalantibodies after incubation with organic solvents.Biochemistry(Mosc)，2000.65(11)p.1256-65；Reed MA等人，The denatured state under nativeconditionsa non-native-like collapsed state of N-PGK.J Mol Biol.2006 Mar24；357(2)365-72]。例如通过氧化应激，和/或具有诱导分子间交联潜能的赋形剂或杂质存在时诱导的共价分子间交联能形成更高级别的结构变异，像备选的结构域间构建体(VL/VL，VH/VH)、二聚体、寡聚体和较大的团聚体。二聚体、寡聚体和较大的团聚体也能通过非共价分子间相互作用形成，例如作为非天然构象异构体的形成、胶束形成或一级结构修饰的结果。
特别关注的是较大的团聚体，因为它们的重复表位特征，除了构象变化之外，已知它们还能增强多种治疗性蛋白质的免疫原性(Braun，A.等人，Protein aggregates seem to play a key role among the parameters influencingthe antigenicity of interferon alpha(IFN-alpha)in normal and transgenicmice.Pharm Res，1997.14(10)p.1472-8；Hochuli，E.，Interferonimmunogenicitytechnical evaluation of interferon-alpha 2a.J InterferonCytokine Res，1997.17 Suppl 1p.S15-21；Hermeling S等人，Structuralcharacterization and immunogenicity in wild-type and immune tolerant miceof degraded recombinant human interferon alpha2b.Pharm Res.2005 Dec；22(12)1997-2006)。已知通过例如暴露于光、物理应力(震动或搅拌)能促进团聚体的形成，并且团聚体形成可以在长期储存期间特别是在温度升高情况下或者是对药品的不适当处理下发生(Wang，W.Protein aggregation andits inhibition in biopharmaceutics.Int J Pharm.2005 Jan 31，289(1-2)1-30，以及文中引用的文献)。
术语“免疫反应”用于本文中指的是免疫系统对抗原性刺激的任何反应，包括抗体产生、细胞介导的免疫以及免疫耐受。
术语“治疗性抗体”用于本文中指的是可以用于处理、治疗和诊断疾病的单克隆抗体。治疗性抗体可以是任何动物作为对抗原免疫应答所产生的抗体。优选地，治疗性抗体通过啮齿类动物产生，更优选通过小鼠产生。治疗性抗体也可以是通过遗传工程产生的抗体。适当的方法是本领域公知的，也就是噬菌体展示(Brekke OH和Loset GA，New technologies intherapeutic antibody development Curr Opin Pharmaco.2003 Oct3(5)544-50.)。优选地，治疗性抗体是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
本发明进一步提供一种用于评估治疗性抗体的免疫可比性的方法，包括如下步骤a)产生对标准抗体转基因的非人动物，b)用治疗性抗体免疫所述转基因非人动物，其中所述治疗性抗体是标准抗体的变体，c)收集被免疫的转基因动物的血清，
d)测量血清中针对所述治疗性抗体的抗体。
血清中针对所述治疗性抗体的抗体是转基因动物作为针对所述治疗性抗体的免疫应答所产生的抗体。
产生转基因非人动物的方法是本领域公知的。合适的方法即是HoganB.，Beddington R.，Costantini F.& Lacy E.Manipulating the mouseembryo.A laboratory manual.第2版(1994).Cold Spring HarborLaboratory Press中描述的方法。
转基因非人动物中抗体的表达可以是组成型的或诱导型的。优选该抗体的表达是组成型的。
用于评估免疫应答的方法是本领域公知的。合适的方法是例如ELISA；更多的方法可在Harlow E.& Lane D.Antibodies.A laboratorymanual.(1988)Cold Spring Harbor Laboratory Press中找到。
此外，本发明涉及标准抗体转基因非人动物及其用于确定外源抗体的相对免疫原性的用途，其中所述外源抗体是转基因标准抗体的变体，优选是治疗性抗体的变体。
转基因非人动物可以是任何非人动物。优选的非人动物是哺乳动物。更优选地，该非人动物是啮齿类动物，例如小鼠或大鼠。用于产生转基因非人动物的方法是本领域公知的。合适的方法即是Hogan B.，BeddingtonR.，Costantini F.& Lacy E.Manipulating the mouse embryo.A laboratorymanual.第2版(1994).Cold Spring Harbor Laboratory Press中的方法。
用于评估免疫应答的方法也是本领域公知的。合适的方法例如是ELISA；更多的方法可在Harlow E.& Lane D.Antibodies.A laboratorymanual.(1988)Cold Spring Harbor Laboratory Press中找到。
外源抗体可以是治疗性抗体。优选地，外源抗体是人的、人源化的或嵌合抗体。更优选地，转基因抗体是免疫球蛋白γ(IgG)。甚至更优选地，抗体是抗人淀粉状蛋白β肽或其结构变体的抗体。最优选的抗体是抗-AβIgG的变体。抗-AβIgG详细描述于专利申请WO03/070760中，其在此完整引用作为参考。
优选地，转基因标准抗体是人的、人源化的或嵌合抗体。更优选地，转基因抗体是免疫球蛋白γ(IgG)。甚至更优选地，抗体是针对人淀粉状蛋白β肽的抗体。最优选的抗体是抗-AβIgG。
现在已对本发明进行了一般性描述，参考特定实施例将会更好地理解这些内容，除非另有说明，纳入本发明中的这些特定实施例与下面的附图相结合只是用于阐明的目的而非旨在限制。
图1显示了特异于克隆入表达载体pHSE3′用于转基因表达的人Aβ的人Igγ1基因的完整编码序列。用于PCR扩增的引物的位置和名称显示于相应序列的上面或下面。终止密码子以粗体显示。
图2显示了特异于克隆入表达载体pHSE3′用于转基因表达的人Aβ的人Igκ基因的完整编码序列。用于PCR扩增的引物的位置和名称显示于相应序列的上面或下面。终止密码子以粗体显示。
图3显示了转基因小鼠血清分析的图示。进行了对人κ轻链和人γ重链特异的夹心ELISA。MS小鼠血清。hIgG1γ1同种型的重组人免疫球蛋白。F2F建立者小鼠2F。NegPCR-阴性同窝仔畜对照。Tg 5M+转基因小鼠5M+。Tg 7M+转基因小鼠7M+。转基因小鼠在同一分子内表达两个抗体链。
图4显示了用FACS(荧光激活细胞分选术)评估淋巴细胞亚群的图示。用特异于B细胞、T细胞和T辅助细胞以及细胞毒素T细胞的抗体对来自野生型和转基因小鼠的外周血淋巴细胞进行染色。在野生型和hIgG1-转基因小鼠的淋巴细胞亚群之间未能检测到显著差异。A)野生型B1/6，B)转基因小鼠。
图5为显示野生型(WT)和转基因(TG)小鼠体内的抗-KLH抗体滴度的图示。在第0天用KLH免疫野生型和转基因小鼠。在第7天和第12天，评估抗-KLH抗体的滴度。在KLH刺激时，转基因小鼠与野生型小鼠反应相似。
图6为显示转基因小鼠体内抗-HUMIRA滴度的图示。在第0天用人IgG1抗体HUMIRA免疫转基因小鼠。在第7、12、21和35天，测量血清抗-HUMIRA的滴定度。转基因小鼠产生了针对HUMIRA的应答。
图7显示了A)分子量标准B)Mab11空白对照剂和C)Mab11的大小排阻层析图(SEC)。设备、运行条件以及操作描述于方法部分。
图8显示了A)Mab11空白对照剂和B)Mab11的离子交换层析图。设备、运行条件以及操作描述于方法部分。
图9显示了在A)非还原和B)还原条件下，Mab11和还原的/烷基化的Mab11(RA-Mab11)在4-12％Bis-Tris凝胶上跑样的SDS-PAGE图。
图10为还原的/烷基化的Mab11(RA-Mab11)的LC/MS分析的图示。A)C8RP-HPLC，UV-追踪(214nm)，B)去卷积(deconvoluted)质谱。C)B)中HMW质量峰局部放大区域。有关观察到和计算的质量分配参见表3。
图11显示野生型(WT)和转基因(TG)动物中抗Mab-11滴度的图示。在第0天用天然Mab-11免疫野生型和转基因小鼠。在第7、12、21和35天，评估抗-Mab-11抗体的滴度。转基因小鼠对Mab-11的刺激表现出耐受性。
图12显示在野生型(WT)和转基因(TG)小鼠中抗-RA Mab-11滴度(RA＝还原的-烷基化的)的图示。在第0天用RA Mab-11免疫野生型和转基因小鼠。在第7、12、21和35天，评估抗-RA Mab-11的滴度。野生型和转基因小鼠都对RA Mab-11应答。
图13显示转基因(TG)小鼠对Mab-11(◆)和还原的-烷基化的(RA)-Mab-11(●)的抗体反应的图示。用天然的Mab-11和RA Mab-11免疫转基因小鼠。第一次免疫后3个月，用天然Mab-11加强动物。评估加强前后对天然Mab-11的抗体应答。2/5小鼠显示出与天然Mab-11的交叉反应。
实施例除非另有说明，根据厂商的说明来使用实施例中涉及的商业可获得的试剂。
实施例1人免疫球蛋白转基因小鼠的产生构建体的产生使用对人Ab肽具有特异性的编码同种型γ1的免疫球蛋白(Ig)重链(H)的cDNA(SEQ.ID.NO1)和编码同种型κ轻链(L)的cDNA(SEQ.ID.NO2)[Bardroff，M.e.a.，Anti-amyloid beta antibodies and their use.EP03001759EP，2003]。使用表1中的引物，通过PCR反应来扩增这些cDNAs。为直接插入到pHSE3′载体中，5′引物含有SalI(或相容的XhoI)位点，并且3′引物含有BamHI(或相容的BglII)位点[Pircher，H.等人，Tcell tolerance toMlsa encoded antigens in T cell receptor V beta 8.1 chain transgenic mice.Embo J，1989.8(3)p.719-27]。首先用两个限制性内切酶SalI和BamHI来酶切PCR扩增的cDNAs，然后将它们分别插入载体pHSE3′的相应位点。pHSE3′内Ig cDNAs的表达由MHC I类基因H-2k的鼠源启动子驱动，并由位于该克隆基因3′的鼠源Ig H基因增强子增强[Pircher，H.等人，T celltolerance to Mlsa encoded antigens in T cell receptor V beta 8.1 chaintransgenic mice.Embo J，1989.8(3)p.719-27]。该表达载体确保了在转基因小鼠的T和B淋巴细胞内相应插入的基因产物的高水平产生([Pircher，H.等人，T cell tolerance to Mlsa encoded antigens in T cell receptor V beta 8.1chain transgenic mice.Embo J，1989.8(3)p.719-27]以及未发表的资料)。随后将包括(从5′到3′)H-2K启动子、插入的cDNA、poly-A和剪接位点以及Ig H基因增强子元件的完整的表达盒通过限制性内切酶XhoI切割从载体上切除，并进行琼脂糖凝胶纯化，然后制备成适合微量注射到受精小鼠卵母细胞的足够浓度(溶于10mM TrisHCl/0.1mM EDTA，pH 7，2μg/ml)。通过测序编码抗-AβIg H和L基因的完整cDNAs来证实cDNA的编码潜力(参见图1)。
表1.克隆引物的序列
抗-AβIgG1转基因小鼠的产生用前面部分描述的纯化的编码Ig H和L基因的XhoI片段的1∶1混合物显微注射来自C57BL/6雌性供体的受精卵母细胞以获得双转基因动物。通过用特异性引物扩增从尾部活组织检查制备的基因组DNA，来筛选这些由显微注射的卵母细胞产生的幼畜中转基因的存在。所使用的引物显示于表2。
表2.用于检测转基因的引物序列
使用1μl(大约100ng)得自尾部活组织检查的总DNA进行PCR反应，PCR反应条件如下90℃1分钟，30×[94℃10秒，64℃30秒，72℃90秒]，72℃7分钟。最后用1.5％琼脂糖凝胶观察到了分别对应于转基因IgH和L基因的大约660bp的PCR扩增的DNA片段。
总计产生了5只携带Ig H和L基因的转基因小鼠和一只仅携带IgH基因的转基因小鼠，并对它们进行繁育。
实施例2转基因小鼠的表型特征血清分析通过尾部静脉穿刺获得血液。并于室温过夜进行凝固。以500xg离心10分钟分离血清并于-20℃冻存待进一步分析。
为确定转基因小鼠是否表达完整的人抗体，开发了ELISA系统。使用多克隆山羊-抗-人κ链特异性抗体(Sigma K 3502)来捕获人抗体。用偶联于过氧化物酶(POD，Sigma A 0170)的单克隆小鼠-抗-人γ链特异性抗体进行检测。如图5所示，转基因小鼠表达完整的人免疫球蛋白。
用FACS检测淋巴细胞亚群。通过尾部静脉穿刺获得血液并将其收集于肝素包被的管(Sarstedt)内。像厂商描述的那样在裂解缓冲液(缓冲液EL，Cat.No.70217，Qiagen)中裂解红细胞。将细胞重悬于FACS-缓冲液(PBS，0.05％NaN3，3％FCS)中，根据厂商的建议(Becton-Dickinson)进行抗体染色。如图4所示，野生型和转基因小鼠都含有相当比率的B细胞(B220+)、T-细胞(CD5+)、CD4+T辅助细胞和CD8+细胞毒性T细胞。因此，转基因人IgG1的表达不影响淋巴细胞亚群。
为评估免疫能力，用模型抗原KLH(匙孔血蓝蛋白，Sigma，H-7017，Lot 121K4838)免疫5只转基因和野生型同窝对照小鼠的组。通过ELISA测定抗-KLH的滴度，使用包被在maxisorp板(Nunc)上的KLH来捕获，并使用抗-小鼠IgG1(BD Pharmigen)来检测。野生型和转基因小鼠对KLH产生了相当的免疫反应(图5)。因此hIgG1转基因小鼠具有免疫能力。
通过用人IgG1抗体HUMIRA(Abbott)免疫来评估针对密切相关抗原的应答。将10μgHUMIRA乳化于200μl Rehydragel HPA(Reheis)中。在第0天腹膜内(i.p.)免疫动物，在第7、12、21和35天通过尾部静脉穿刺抽血，制备血清，并通过ELISA测定抗-HUMIRA滴度，通过用HUMIRA包被maxisorp板(Nunc)来捕获，并通过抗-小鼠IgG(BD Pharmigen)来检测抗-HUMIRA抗体。如图6所示，转基因小鼠产生了针对密切相关的人IgG1抗体HUMIRA的应答。
实施例3Mab11(也称之为抗-Aβ-IgG1)的产生、纯化和表征细胞培养中国仓鼠卵巢细胞(Hoffmann-La Roche，瑞士)经改造适合在自制的DHI培养基制剂(Invitrogen)内进行无血清培养，该培养基制剂是DMEM、Ham’s F12和IMDM分别以1∶1∶2(v∶v∶v)比例的混合物(Schlaeger &Schumpp 1992)，并含有0.2％大豆HyPep 1510和0.2％稻HyPep 4601的植物水解产物(Kerry Bioscience)。使用大约70％推荐的工作体积以80-100rpm将这些细胞常规培养于旋转烧瓶(Bellco，Inotech AG，Dotlikon，Switzerland)内。大规模的培养和转染也可在6L旋转烧瓶或5到14升搅拌釜生物反应器内进行(Chemap，MBR，Zürich，and Infors，Bottmingen，瑞士)。使用商业可获得的试剂盒(Nucleobond Ax，Macherey-Nagel AG，瑞士)进行pMAb-11的质粒制备。以pUC18DNA(Pharmacia Biotech，Zürich，瑞士)为标准，通过分光光度法测定并通过琼脂糖凝胶电泳估计质粒的浓度。
转染操作为进行转染试验，将生长于DHI培养基内的悬浮CHO细胞以1×106/ml的密度接种于最终容器中，并培养至密度为2-3×106个细胞/ml(1-2天)。然后用新鲜的DHI培养基将细胞浓度再调整至1-1.5×106个细胞/ml，并在进行转染之前让培养物生长3-4h。在加入转染复合体后，将细胞在转染后于37℃培养24小时。从24小时开始，将剩余培养物的温度转变为33℃，并培养5-6天。每24小时常规收获上清液样品，并通过蛋白A亲和层析法(Amersham，Aekta FPLC系统)来测定单克隆抗体(mAb)的含量。通过过滤收集上清液，并将其直接上样到装有蛋白A树脂的第一个纯化柱(mAbSelect，Amersham，GE)上。
转染复合体的制备DNA复合体在室温以1/10培养体积形成于不含肝素的HL培养基内(Schlaeger & Schumpp 1990，Schlaeger 1996)。在优化的用于CHO细胞的基因递送条件下，将0.7μg DNA/ml细胞加入0.1ml新鲜培养基中并轻轻混合。两分钟后，加入1μl Ro1539Xtreme Gene(Roche Applied Science，Indianapolis，USA)并混合。室温孵育15分钟后，将转染复合体转至等量的细胞，也就是在生物反应器或旋转烧瓶中的细胞。
从发酵上清液分离和纯化Mab11所有步骤都是在无内毒素的条件下通过只使用回火的玻璃仪器进行，所有设备包括柱子的卫生处理都是用0.5M NaOH进行，并且所有缓冲液都过滤除菌(0.22μm)。只使用新鲜的凝胶材料。
第一步蛋白A亲合层析先用3倍凝胶体积(GV)的平衡缓冲液(25mM Tris/HCl；25mM NaCl，5mM EDTA pH 7.1)来洗涤BioRad econo柱(BioRad)内的Mab Select凝胶(Amersham)，然后用2GV再生缓冲液(2M Guanidin，100mM Tris pH 7.5)接着用5GV平衡缓冲液洗涤。预运行后，将最多20mg Mab/ml上样凝胶。先用3GV平衡缓冲液洗涤柱子，然后用4GV洗涤缓冲液(1M Tris/HCl pH7.2)和3GV平衡缓冲液洗涤。用100mM HAc pH 2.9洗脱蛋白A结合的抗体。为灭活病毒，用HAc将洗脱液调节至pH≤3.6，然后室温孵育15分钟。然后用1M Tris于室温调节至pH 4.0。
第二步离子交换层析(阳离子交换层析)先用2GV再生缓冲液(0.5M NaOH，1M NaCl)和3GV再生缓冲液缓冲液A(50mM HAc，pH 5.0)洗涤BioRad econo柱(BioRad)内的SP-Toyopearl 650M(Tosoh)。预运行后，将最多10mg Mab/ml上样凝胶。先用0.5GV缓冲液A洗涤柱，然后用0-100％的缓冲液B(50mM HAc，1MNaCl pH 5.0)进行梯度洗脱。收集洗脱的蛋白质级分并通过IEX和SECHPLC分析。
第三步大小排阻层析(Flow-though阴离子交换层析)通过超滤浓缩第二步的级分，将其pH值调节至7.5并上样至BioRadecono柱(BioRad)内的Q-Sepharose FF凝胶(Biorad)。使用25mM Tris/HCl，80mM乙酸钠，pH 7.5作为流动相进行SEC层析。根据UV信号分级分离流出液，并将其pH调节至5.5。在Amicon搅拌室内使用10kDa膜将缓冲液交换成含有20mM组氨酸/140mM NaCl，pH 5.5的Mab11空白对照剂并调节浓度。最后将该溶液通过0.22μm Millex-GV无菌过滤器(Millipore)过滤，并等份保存于-80℃。
Mab11的表征大小排阻层析使用Jasco PU-980HPLC系统，通过大小排阻层析来分析纯化的Mab11样品。将这些样品在TSK-Gel G3000SWXL，7.8×300mm，5μm柱(Tosho Biosciences)上层析，以0.2M K2HPO4，0.25M KCl，pH 7.0作为流动相。流速设为0.5ml/分钟。使用连到Merck-Hitachi D-2500记录系统的Jasco UV-975检测器来监测220nm处的吸收。
平衡柱子直到获得稳定的基线。序列注入相应的凝胶过滤标准(BioRad，151-1901，包括670kD牛甲状腺球蛋白、158kD牛IgG、44kD OVA、17kD马肌红蛋白、1.35kD维生素B12)、Mab11空白对照剂(阴性对照没有Mab11的缓冲液)、Mab11样品。注入的量对应于约50μg样品。代表性的大小排阻层析图显示于图7。结果在保留时间内对称峰对应155-160kDa。未检测到团聚体或片段。
离子交换层折使用Jasco PU-980HPLC系统，通过离子交换层析来分析纯化的Mab11样品。20分钟内通过使用0％B到52％B的梯度将样品在Mono S5/50GL柱(Amersham Biosciences)上层析(流动相A50mM溶于水的丙二酸/丙二酸盐，pH5.3；流动相B溶于流动相A的1M乙酸钠，pH 5.3)。流速设为1ml/分钟。使用连接到Merck-Hitachi D-2500记录系统的JascoUV-975检测器来监测在280nm处的吸收。
用流动相A平衡柱子直到获得稳定的基线。序列注入相应的Mab11空白对照剂和Mab11样品。Mab11的注入量对应于约50μg。代表性的离子交换层析图(IEC)显示于图8。结果在较高的保留时间内，95％的Mab11样品洗脱成单一峰，其具有不可分辨的肩峰。大约5％洗脱具有较短的保留时间。
十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳使用Xcell Mini-Cell II Gelsystem(Invitrogen)，通过SDS-PAGE来分析纯化的Mab11样品。将事先稀释的样品与还原或非还原样品缓冲液混合至浓度为2-8μg/20μL。根据厂商的指导将NuPAGE LDS样品缓冲液(Invitrogen)与NuPAGE还原剂(Invitrogen)混合制备还原样品缓冲液。将还原样品缓冲液中的样品于70℃孵育10分钟。将样品和标准上样于NuPAGE 4-12％Bis-Tris凝胶，10孔梳，1.0mm厚(Invitrogen，#NP0301BOX)。使用覆盖200-2.5kDa的Mark12TM分子量标准(Invitrogen，#LC5677)作为标准物。使用NuPAGE MOPS SDS跑样缓冲液(Invitrogen)在200V进行凝胶跑样。用StainEase凝胶染色托盘(Invitrogen)对凝胶染色过夜，并通过光密度法进行扫描和分析。参考从在同一凝胶上电泳的对照标准获得的标准样品曲线来计算蛋白质浓度。结果在还原条件下的SDS-PAGE显示出对应于IgG1H-链和L-链的分子量的两条带。未检测到团聚体和片段(参见图9)。
质谱为进行质谱分析，根据实施例5中描述的方法制备还原的/羧甲基化的抗体。通过使用Agilent 1100Capillary-HPLC系统，对样品进行分析性RP-HPLC分析。应用梯度系统(A水0.1％甲酸，B乙腈0.1％甲酸)将样品在Agilent Poroshell C8-反相柱(0.5×75mm)上层析。流速设为15μl/分钟，柱温设为70℃。随后将层析流应用于质谱仪的ESI离子源。在ESI-Q-TOF质谱仪(Micromass/Waters Q-TOF Ultima，Manchester，UK)上以阳性模式和lockspray质量校正进行测量。用Masslynx MaxEnt1模块对蛋白质光谱去卷积。
RA-Mab11的LC/MS分析显示于图10，观察到的和计算的质量在表3中予以分配。
表3.RA-Mab11的LC/MS分析结果，观察到的质量分配(参见图10)。
L-链＝轻链，H-链＝重链
结果检测的质量与具有Mab11一级序列的抗体的理论上预期的还原的&羧甲基化的H-和L-链相匹配，其中H-链内带有一个pyro-Glu以及一个Lys缺失。该H-链主要是G0和G1糖基化的，G2只是很小程度地糖基化。
实施例4耐受性的免疫评估用乳化于200μl Rehydragel-HPA(Reheis)的10μg重组Mab-11通过腹膜内(i.p.)途径免疫5只转基因和野生型同窝对照小鼠的组。在第7、12、21和35天，通过尾部静脉穿刺获得血液。通过凝结制备血清，用ELISA方法，通过将Mab-11包被于maxisorp板(Nunc)上，并通过抗-小鼠IgG(BDPharmingen)检测抗Mab-11抗体来测定血清抗-Mab-11滴度。ELISA分析揭示了在野生型动物体内产生了针对Mab-11的强烈的免疫应答，而hIgG1-转基因动物不能产生对rhIgG1的免疫应答(图11)。因此，hIgG1转基因小鼠对外源供应的相同同种型和特异性的抗体，例如，对它们的转基因产物是耐受的。
实施例5药物物质变体的产生作为结构变体，选择还原的/烷基化的Mab11，这是因为这些衍生物是充分确定的而且适于全面的物理化学表征。通过链间二硫键的还原切割，将抗体切割成重链和轻链。自由巯基随后用碘乙酸烷基化从而阻止通过再氧化的聚合作用。
还原的/烷基化Mab11的产生和表征为制备完全还原和羧甲基化的Mab11，将二硫苏糖醇(DTT)溶于去离子水至0.1g/ml，并加到溶于6M盐酸胍0.3M Tris/HCl pH 8.5中的1mg/mlMab11至终浓度20mM。于50℃+/-3℃孵育60分钟后，加入刚溶解于去离子水的碘乙酸(IAA)0.33g/ml至终浓度50mM。在黑暗中于室温进行烷基化30分钟。通过加入相对于IAA 1.5倍摩尔过量DTT来钝化碘乙酸并将其于室温孵育10分钟。
根据厂商的教导，使用PD-10脱盐柱(Aemrsham)纯化还原的/烷基化的抗体(RA-Mab-11)，以20mM Tris/HCl缓冲液pH 8.5为流动相，最大样品负荷为每柱1.5ml。使用PD-10或NAP-5脱盐柱(Amersham)，以PBSpH 7.4或Mab11空白对照剂为流动相，再次纯化含蛋白质的流出液。收集合蛋白质的级分，并将其在层流下无菌过滤，将其等分于无菌聚丙烯管内并贮存于-80℃。产物对照和还原的/羧甲基化的抗体的蛋白质浓度的测定如实施例3中所概述的那样通过毛细管LC-QTOF-MS和SDS-PAGE进行。
RA-Mab11的表征，结果在还原条件下的SDS-PAGE显示出对应于IgG1H-和L-链分子量的两条带。未检测到团聚体或片段(参见图9)。质谱分析的结果参见实施例3(表3和图10)。
实施例6评价Mab-11转基因小鼠和非转基因同窝小鼠体内Mab-11的还原的/烷基化的(RA-)变体的免疫原性为确定与天然蛋白质相比构象的变化是否对体内转基因小鼠模型中致敏发挥关键作用，我们使用通过完全或部分还原和烷基化二硫键制备的Mab-11的衍生物来免疫转基因小鼠及非转基因同窝小鼠。通过ELISA评价对天然蛋白质及其结构变体的体液免疫反应的幅度。
在第0天，通过腹膜内途径，使用乳化于200μl Rehydragel-HPA(Reheis)的10μg RA-Mab-11免疫野生型和转基因小鼠组(N＝5)。在第7、12、21和35天，通过尾部静脉穿刺抽取血液。通过凝固制备血清并贮存于-20℃。
通过ELISA检测结合RA-Mab-11的抗体。用溶于PBS的RA-Mab-11在4℃过夜包被96孔MaxiSorpTM板(Nunc)的孔。用含有0.05％Tween 20的PBS(PBST)中的2％BSA进行封闭。PBST用于洗涤，溶于PBST的0.5％BSA用作稀释液。洗涤3次后，将100μl稀释的血清样品加入包被的孔内并于37℃孵育1小时。使用抗-小鼠IgG1抗体(BD Pharmigen)来评价抗体水平。在用ABTS底物溶液(Roche)显影后，使用自动平板读数器在450nm处检测抗体的结合。
ELISA分析显示RA-Mab-11在Mab-11转基因小鼠和非转基因的同窝小鼠中引起了强烈的体液免疫应答(图12)，而Mab-11转基因小鼠对天然的、重组Mab-11的处理却是耐受的(图11)。然而，天然Mab-11在野生型同窝小鼠中诱导免疫应答(图11)。有趣的是，由于当用RA-Mab-11免疫时，小鼠产生针对天然Mab-11的交叉反应抗体，因此用RA-Mab-11免疫破坏了一些动物体内针对自身天然蛋白质的耐受性。在初次免疫后三个月用天然Mab-11加强，诱导了以交叉反应性抗-RA-Mab-11为特征的记忆B细胞反应，以及以前在相同的交叉反应小鼠内检测到的抗-Mab-11滴度(图13)。这些结果清楚表明Mab-11的结构变体在转基因小鼠内诱导了免疫应答，所述转基因小鼠对未改变的天然蛋白质是耐受的。因此Mab-11转基因小鼠是检测抗体二级和三级结构变化的合适的系统。
序列表<110>弗.哈夫曼-拉罗切有限公司<120>用于免疫可比性的体内模型<130>23082<160>10<170>PatentIn版本3.3<210>1<211>1562<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>1gcgccaccat gaaacacctg tggttcttcc tcctgctggt ggcagctccc agatgggtcc 60tgtcccaggt ggaattggtg gaaagcggcg gcggcctggt gcaaccgggc ggcagcctgc 120gtctgagctg cgcggcctcc ggatttacct ttagcagcta tgcgatgagc tgggtgcgcc 180aagcccctgg gaagggtcta gagtgggtga gcggtattaa tgctgctggt tttcgtactt 240attatgctga ttctgttaag ggtcgtttta ccatttcacg tgataattcg aaaaacaccc 300tgtatctgca aatgaacagc ctgcgtgcgg aagatacggc cgtgtattat tgcgcgcgtg 360gtaagggtaa tactcataag ccttatggtt atgttcgtta ttttgatgtt tggggccaag 420gcaccctggt gacggttagc tcagcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac 480cctcctccaa gagcacctct gggggcacag cagccctggg ctgcctggtc aaggactact 540tccccgaacc ggtgacggtg tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct 600tcccggctgt cctacagtcc tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct 660ccagcagctt gggcacccag acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca 720aggtggacaa gaaagttgag cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc 780
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<223>人工序列的描述G1.11Salfor，人抗-AβIgG1的重链的5’末端的引物<400>3acgtgtcgac gccgccacca tgaaacacct g 31<210>4<211>28<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工序列的描述G1.11Bamrev，人抗-AβIgG1的重链的3’末端的引物<400>4acgtggatcc tcatttaccc ggagacag 28<210>5<211>31<212>DNA
<213>人工的<220>
<223>人工序列的描述K.11Xhofor，人抗-AβIgG1的轻链的5’末端的引物<400>5acgtctcgag gccgccacca tggtgttgca g 31<210>6<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工序列的描述K.11Bglrev，人抗-AβIgG1的轻链的3’末端的引物<400>6acgtagatct ctaacactct cccctgttg 29<210>7<211>27<212>DNA<213>人工的<220>
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<223>人工序列的描述5H2KP，人抗-AβIgG1的轻链基因的PCR引物<400>9atgaattcac agtttcactt ctgcacc27<210>10<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工序列的描述K.44，人抗-AβIgG1的轻链基因的PCR引物<400>10gctcatcaga tggcgggaag20
权利要求
1.用于确定外源抗体的相对免疫原性的方法，其包括a)产生对标准抗体转基因的非人动物，b)将所述转基因非人动物与外源抗体接触，此处所述的外源抗体是所述转基因标准抗体的变体，c)确定由(b)的外源抗体引起的转基因非人动物的免疫反应。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述外源抗体是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述转基因标准抗体是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述转基因标准抗体是抗人淀粉状蛋白β肽的抗体。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述非人动物是哺乳动物。
6.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述非人动物是啮齿类动物。
7.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述非人动物是小鼠。
8.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其中所述变体包含一级、二级和三级蛋白质结构的变异、氨基酸的糖基化和化学修饰。
9.用于评估治疗性抗体的免疫可比性的方法，其包括a)产生对标准抗体转基因的非人动物，b)将所述转基因非人动物用治疗性抗体免疫，其中该治疗性抗体是标准抗体的变体，c)收集经免疫的转基因动物的血清，d)测量血清中针对所述治疗性抗体的抗体。
10.对标准抗体转基因的非人动物用于确定外源抗体的相对免疫原性的用途，其中该外源抗体是所述转基因标准抗体的变体。
11.根据权利要求10所述的用途，其中所述外源抗体是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
12.根据权利要求10所述的用途，其中所述转基因标准抗体是抗人淀粉状蛋白β肽的抗体。
13.根据权利要求10-12任一项所述的用途，其中所述非人动物是哺乳动物。
14.根据权利要求10-12任一项所述的用途，其中所述非人动物是啮齿类动物。
15.根据权利要求10-12任一项所述的用途，其中所述非人动物是小鼠。
16.基本上如本文前面描述、特别是参考前述实施例描述的方法和用途。
全文摘要
本发明涉及用于确定外源抗体变体的相对免疫原性的方法，其包括a)产生对标准抗体转基因的非人动物，b)将所述转基因非人动物与外源抗体接触，此处所述的外源抗体是a)中所述转基因标准抗体的变体，和c)确定由(b)的外源抗体所引起的转基因非人动物的免疫应答。
文档编号G01N33/53GK1891178SQ20061009429
公开日2007年1月10日 申请日期2006年6月29日 优先权日2005年6月30日
发明者H·贝克, A·伊格莱希亚斯, T·施莱特米勒, M·措赫尔 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司