骨形成蛋白4在抑制癌症中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及骨形成蛋白4在抑制癌症中的应用。具体地，外源骨形成蛋白（BMPs）具有诱导肝癌干细胞分化的作用，BMP4可使肝癌细胞系的CD133蛋白表达下调，促进肝癌细胞系CD133+肝癌干细胞分化；BMP4还能够抑制肝癌细胞系的体外增殖和自我更新，抑制免疫缺陷小鼠的成瘤能力。本发明还提供了BMP4诱导肝癌干细胞分化的作用机制。
【专利说明】骨形成蛋白4在抑制癌症中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物制药领域，具体地，本发明涉及骨形成蛋白4在抑制癌症中的应用。
【背景技术】
[0002]肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是世界范围内第五大高发肿瘤，也是第三大的肿瘤致死病因。随着对肿瘤研究不断进展，手术治疗、放射治疗和化学治疗都成功使肿瘤瘤体缩小，但是肝癌术后复发和转移仍然十分普遍，常常导致肝癌患者的最终死亡。近年来，针对肿瘤易于复发与转移的特性，研究者发现了肿瘤干细胞(Cancer StemCells, CSCs),并认为肿瘤干细胞的发生和发展对肝癌发挥了重要作用。
[0003]肿瘤干细胞(CSCs)是一群存在于肿瘤细胞系或肿瘤组织中为数不多、但具有低分化、高耐药性和高抗放射治疗的特性的特殊肿瘤细胞，它们可以在体内或体外成为分化程度更高的肿瘤细胞，对其进行分选和分离，并接种于免疫缺陷小鼠体内后，CSCs可以形成与其来源肿瘤细胞分化层级一致的肿瘤组织。虽然临床治疗可以杀死大部分的肿瘤细胞，但治疗过程中CSCs的残存，经常导致肿瘤的复发甚至转移。CSCs在体外除具有干细胞的基本特征(自我更新和分化潜能)，还具有如下特征:(I) CSCs可以通过特定细胞表面标志物来分离；(2)多数CSCs可以在悬浮培养条件下形成球形克隆,或称肿瘤球(tumorspheres);
[3]CSCs对化疗药物和放射线具有很强的耐受性。大多数的肿瘤的进展都与癌干细胞有关。在肝癌研究中，多种细胞标志物都被认为能够有效富集肝癌干细胞群，包括EpCAM、CD133、0V6、⑶90和SP细胞。跨膜蛋白⑶133可以作为肝癌CSCs的一种表面标志物，⑶133+的肝癌CSCs在体外具有更高的克隆形成能力，并且在免疫缺陷小鼠体内更容易形成肿瘤。
[0004]⑶133是prominin-Ι基因编码的蛋白，基因定位于染色体4ρ15.32，编码含865个氨基酸的蛋白，其相对分子质量120kD，是一种5次跨膜糖蛋白。CD133的mRNA在许多正常组织细胞中表达，但CD133蛋白的表达仅限于未分化细胞中，如内皮祖细胞、造血干细胞、胎儿脑干细胞与前列腺上皮干细胞等。在肿瘤研究中，CD133主要用于标记肿瘤细胞中CSC群，100个⑶133+脑肿瘤CSCs在裸鼠体内6个月即可形成肿瘤，而10万个⑶133—肿瘤细胞在相同时间内未在裸鼠体内形成肿瘤。
[0005]但迄今为止，研究者对⑶133+肝癌CSC的分化及其调控机制并不十分清楚。因此本领域迫切需要开发能够影响肝癌干细胞分化的药物。
【发明内容】
[0006]本发明的目的就是提供一种诱导肝癌干细胞分化的药物及其应用。
[0007]在本发明的第一方面，提供了一种骨形成蛋白4即BMP4蛋白的用途，所述用途为选自下组的一种或多种的用途:
[0008](a)用于制备治疗肝癌的药物；
[0009](b)用于制备促进肝癌干细胞的分化的组合物；。[0010](C)用于制备抑制肝癌体外增殖和/或自我更新的组合物；
[0011](d)用于制备抑制肝癌的成瘤能力的组合物；
[0012](e)用于制备提高肝癌细胞对抗肿瘤剂敏感性的组合物；
[0013](f)用于制备降低肝癌细胞耐药性的组合物。
[0014]在另一优选例中，所述的治疗是分化治疗肝癌。
[0015]在另一优选例中，所述的组合物为药物组合物。
[0016]在另一优选例中，所述的肝癌干细胞是人或非人哺乳动物的肝癌干细胞。
[0017]在另一优选例中，所述的非人哺乳动物包括灵长目动物、啮齿动物(如小鼠、大鼠)等ο
[0018]在另一优选例中，所述的BMP4蛋白包括人或非人哺乳动物的BMP4蛋白、或其具有相同诱导肝癌干细胞分化功能的同源蛋白、突变蛋白或衍生蛋白。
[0019]在本发明的第二方面，提供了一种骨形成蛋白4即BMP4蛋白的用途，所述的用途为选自下组的一种或多种用途:
[0020](a)用于制备治疗癌症的药物；
[0021](b)用于制备促进癌症干细胞的分化的组合物；
[0022](c)用于制备抑制癌症的体外增殖和/或自我更新的组合物；
[0023](d)用于制备抑制癌症的成瘤能力的组合物；
[0024](e)用于制备提高癌症细胞对抗肿瘤剂的敏感性的组合物；
[0025](f)用于制备降低癌症细胞的耐药性的组合物。
[0026]在另一优选例中，所述的癌症是实体瘤，或所述的癌症细胞来源于实体瘤。
[0027]在另一优选例中，所述的癌症包括肝癌、肺癌、胃癌；更佳地，为肝癌。
[0028]在本发明的第三方面，提供了一种体外非治疗性的诱导肝癌干细胞分化的方法，所述方法包括步骤(I):在添加BMP4蛋白的条件下，培养肝癌干细胞，从而诱导肝癌干细胞的分化。
[0029]在另一优选例中，将肝癌干细胞与含BMP4蛋白的溶液进行接触或混合，然后进行培养。
[0030]在另一优选例中，培养体系中BMP4蛋白的浓度≥30ng/ml，较佳地≥50ng/ml，更佳地 > 100ng/mlo
[0031]在另一优选例中，所述的BMP4蛋白为BMP4单体、或BMP4同二聚体，或BMP4异二聚体、或BMP4的融合蛋白(保留BMP4活性)，较佳地为BMP4同二聚体。
[0032]在另一优选例中，所述方法还包括步骤:在步骤(I)之前、之中或之后，在培养体系中添加额外的抗肿瘤剂。
[0033]在另一优选例中，所述的抗肿瘤剂包括化疗药、肿瘤抗体等。
[0034]在另一优选例中，所述的抗肿瘤剂包括(但并不限于):阿霉素、长春新碱、紫杉醇、顺钼、卡钼、5-FU、或其组合。
[0035]在本发明的第四方面，提供了一种提高肿瘤细胞对抗肿瘤剂的敏感性或降低肿瘤细胞的耐药性的方法，所述方法包括步骤(I):在添加BMP4蛋白的条件下，培养肿瘤细胞，从而提高肿瘤细胞对抗肿瘤剂的敏感性或降低肿瘤细胞的耐药性。
[0036]在另一优选例中，所述的肿瘤细胞包括选自下组癌症的肿瘤细胞:肝癌、肺癌、胃癌，更佳地为肝癌。
[0037]在本发明的第五方面，提供了一种缓释药物组合物，所述的药物组合物包括药学上可接受的载体和作为活性成分的BMP4蛋白，且组合物为缓释剂型。
[0038]在另一优选例中，所述组合物包括缓释颗粒以及吸附于缓释颗粒的BMP4蛋白。
[0039]在另一优选例中，所述的缓释颗粒由生物可降解材料(如聚乳酸，聚丙烯酸)制成。
[0040]在另一优选例中，所述的缓释药物组合物为注射剂。
[0041]在另一优选例中，所述的缓释药物组合物的给药方式为局部给药或瘤内给药。
[0042]在另一优选例中，所述的BMP4蛋白包括BMP4单体、或BMP4同二聚体，或BMP4异二聚体、或BMP4的融合蛋白(保留BMP4活性)。
[0043]在另一优选例中，所述的BMP4蛋白单体是由Genbank数据库中登录号为NM_001202.3、NM_130850.2、或NM_130851.2所示的核苷酸序列编码的。
[0044]在另一优选例中，所述的缓释药物组合物还包括额外的抗肿瘤剂。
[0045]在另一优选例中，所述的抗肿瘤剂包括化疗药、肿瘤抗体等。
[0046]在另一优选例中，所述的抗肿瘤剂包括(但并不限于):阿霉素、长春新碱、紫杉醇、顺钼、卡钼、5-FU或其组合。
[0047]在本发明的第六方面，提供了一种用于治疗肿瘤的药盒，所述药盒包括:
[0048](a)第一治疗剂，所述第一治疗剂是含BMP4作为活性的药物制剂；
[0049](b)第二治疗剂，所述第二治疗剂是抗肿瘤剂，所述的抗肿瘤剂含有不同于BMP4的活性成分；和
[0050](C)使用说明书。
[0051]在本发明的第七方面，提供了一种治疗肿瘤或诱导肿瘤细胞分化的方法，包括步骤:给需要的对象施用BMP4蛋白或第五方面所述的缓释药物组合物。
[0052]在另一优选例中，所述的癌症是实体瘤；较佳地，所述的癌症包括肝癌、肺癌、胃癌；更佳地为肝癌。
[0053]应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。
【专利附图】
【附图说明】
[0054]下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
[0055]图1显示⑶133是PLC/PRF/5细胞系的CSC表面标志物；其中，图1A显示不同肝癌细胞系中⑶133+细胞率；图1B显示PLC/PRF/5细胞中，⑶133+细胞％约为52%，通过流式分选后得到的⑶133+/⑶133-肝癌细胞群的分选纯度达到90%以上；图1C显示，PLC/PRF/5⑶133+细胞群肿瘤球形成的数目和大小均大于⑶133-细胞群；图1D显示，多种干细胞相关基因在PLC/PRF/5CD133+细胞群中表达上调。
[0056]图2显示，高浓度外源性BMP4处理肝癌细胞后其⑶133+细胞比例下降；其中，图2A显示采用流式细胞分析法分析PLC/PRF/5 (PLC)和Huh7细胞中CD133+细胞率，结果显示高浓度外源性BMP4处理6天后两种细胞系中的CD133+细胞率分别有原来的约52.1 %下降至32.9%，和约73.0%下降至47.5%。
[0057]图3显示，外源性BMP4可以降低肝细胞癌细胞中⑶133蛋白表达；其中，图3A显示用0-100ng/ml不同浓度的外源性BMP4处理PLC/PRF/5CD133+/CD133-细胞中CD133蛋白的表达情况；图3B显示50ng/ml BMP4处理不同时间后PLC/PRF/5细胞中CD133蛋白的表达情况；图3C显示采用Western Blot法分析50ng/ml BMP4处理6天后，Huh7细胞中⑶133蛋白表达情况。
[0058]图4显示，外源性高浓度BMP4抑制PLC/PRF/5细胞增殖但不引起凋亡，其中，图4A显示BrdU-ELISA法检测0-100ng/ml不同浓度BMP4处理3天对PLC/PRF/5细胞增殖能力的影响；图4B显示Annexin V/7-AAD双标法检测50ng/mlBMP4处理后PLC/PRF/5细胞凋亡率的变化。
[0059]图5显示，高浓度外源性BMP4诱导肝癌CSCs的分化，其中，图5A显示通过Real-time PCR检测分别在CDM悬浮培养或在50ng/ml BMP4处理单层贴壁3天的PLC/PRF/5CD133+/-肝癌细胞干性相关基因表达情况；图5B显示Western Blot检测显示BMP4处理在⑶133+PLC/PRF/5细胞中呈时间依赖性上调CK8/18蛋白并下调CK19蛋白表达；图5C显示免疫细胞化学检测CD133+PLC/PRF/5细胞中CK8/18和CK19在BMP4处理前后表达的变化。
[0060]图6显示BMP4处理对Huh7和MHCC-97L细胞CK8/18和CK19蛋白表达的影响；其中，图6A显示BMP4处理Huh7细胞0-6天后CK8/18和CK19蛋白的表达；图6B显示BMP4处理6天后MHCC-97L细胞CK8/18和CK19蛋白的表达。
[0061 ] 图7显示高浓度外源性BMP4处理抑制肝CSCs自我更新；图7A和图7B显示将分选得到的⑶133+/-PLC/PRF/5细胞用BMP4预处理6天后，在24孔细胞培养板中进行软琼脂克隆形成实验并计算克隆形成率(colony formation efficiency, CFE) (n=3);图7C显示将分选得到的CD133+PLC/PRF/5细胞用BMP4预处理6天后，种入超低黏附板中观察肿瘤球形成情况，培养液 为无血清CDM。
[0062]图8显示BMP4抑制⑶133+肝癌CSCs在体内的成瘤能力，其中，图8A和图8B显示，CD133+/-PLC/PRF/5 (PLC)和MHCC-97L (97L)细胞在裸鼠体内肝原位注射形成移植瘤的重量；图8C显示，PLC/PRF/5与MHCC-97L CD133+/-细胞与BMP4包被beads共同注射时的成瘤性。
[0063]图9显示⑶133+/-肝癌细胞与BMP4包被beads共同接种的成瘤性；其中，图9A为PLC/PRF/5 (PLC)肝癌细胞；图9B为MHCC-97L (97L)肝癌细胞。
[0064]图10显示BMP4提高了肝癌CSCs的化疗药物敏感性；其中，图1OA和图10B显示，⑶133+/-PLC/PRF/5细胞经过BMP4预处理后，经MTT试验检测计算每种细胞对阿霉素(Doxorubicin)和长春新喊(Vincristine)的 IC50 值;图 10C 显不 BMP4 处理降低了 PLC/PRF/5细胞中ABCG2蛋白的表达；图10D显示BMP4处理降低了 MHCC-97L细胞中ABCG2蛋白的表达；图10E显示流式细胞术检测分析BMP4处理前后MHCC-97L细胞中SP细胞比例。
[0065]图11显示BMP受体在肝癌细胞中的表达和激活；其中，图1lA显示PLC/PRF/5和 Huh7 细胞用 50ng/ml BMP4 处理 0_90min，Western Blot 结果显示 BMPRIa、BMPRIb 和SMAD4在这些细胞中持续表达，并且SMADl出现BMP4浓度依赖性磷酸化激活；图1lB显示，Western Blot分析BMPRIa、BMPRIb在BMP4处理3天后的SMMC-7721细胞中的表达和激活情况；图11(:显示BMPRla在0)133+/0)133-肝癌细胞表达的 Western Blot检测；图1lD显示，Western Blot分析SMAD4siRNA干扰片段在PLC/PRF/5细胞中的干扰效率；图1lE显示SMAD4干扰阻断了 BMP4在PLC/PRF/5细胞中的促分化作用。
[0066]图12显示BMP受体在人原发性肝癌组织中的蛋白表达，免疫组化法检测BMPRIa和BMPRIb蛋白在236例人原发性肝癌组织样品中的表达。
【具体实施方式】
[0067]本发明人经过广泛而深入的研究，首次在众多的生长因子中，意外地发现，外源性骨形成蛋白(BMPs)具有诱导肝癌干细胞分化的作用，具体地，外源性BMP4处理可使肝癌细胞系PLC/PRF/5和Huh7细胞中CD133蛋白表达下调，这种下调作用具有时间依赖性和浓度依赖性；BMP4能够促进PLC/PRF/5、Huh7和MHCC-97L细胞系中CD133+肝癌干细胞分化，并且肝系上皮细胞特异性标志物的表达呈时间依赖性增多；抑制PLC/PRF/5细胞体外增殖，抑制其CD133+肝癌干细胞的自我更新以及在免疫缺陷小鼠体内的成瘤能力；BMP4通过下调ABCG2蛋白表达等途径增强PLC/PRF/5和MHCC-97L CD133+肿瘤干细胞对化疗药物的敏感性；BMP4激活⑶133+肿瘤干细胞中的BMP经典信号通路，干扰经典通路关键分子SMAD4，使BMP4失去促⑶133蛋白表达下降作用。在此基础上完成了本发明。
[0068]术语
[0069]BMP4
[0070]如本文所用，术语“BMP4”,“BMP4 蛋白，” “Bone morphogenetic protein 4” “骨形成蛋白4”或“成骨蛋白4”可以互换使用。BMP4是一种广泛分布于哺乳动物细胞中的生长因子，属于TGF-β家族。ΒΜΡ4可以是Genbank登录号为ΝΡ_001193.2、ΝΡ_570911.2、或ΝΡ_570912.2所示的任一氨基酸序列；所述的ΒΜΡ4蛋白也可以是由Genbank数据库中登录号为ΝΜ_001202.3、ΝΜ_130850.2、或ΝΜ_130851.2所示的核苷酸序列编码的。
[0071]该所述的ΒΜΡ4蛋白为ΒΜΡ4单体、或ΒΜΡ4同二聚体，或ΒΜΡ4异二聚体、或ΒΜΡ4的融合蛋白(保留ΒΜΡ4活性)，较佳地为ΒΜΡ4同二聚体。
[0072]该术语还包括ΒΜΡ4在药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物。如本文所用，术语“药学上可接受的盐”指ΒΜΡ4与酸或碱所形成的适合用作药物的盐。药学上可接受的盐包括无机盐和有机盐。优选的盐是ΒΜΡ4与酸形成的盐。适合形成盐的酸包括但并不限于:盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸，甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苦味酸、甲磺酸、苯甲磺酸，苯磺酸等有机酸；以及天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸。
[0073]制备方法
[0074]本领域的普通技术人员可以使用常规的方法，如生物合成或全化学合成法制备ΒΜΡ4。在一个优选例中，生物合成ΒΜΡ4的步骤如下:
[0075]I)提供编码ΒΜΡ4的核酸序列；
[0076]2)将I)的核酸序列插入到合适的表达载体，获得重组表达载体；
[0077]3)将2)的重组表达载体导入合适的宿主细胞；
[0078]4)在适合表达的条件下培养转化宿主细胞；
[0079]5)收集上清液，并纯化ΒΜΡ4。[0080]根据BMP4的核苷酸序列，本【技术领域】人员可方便地用各种已知方法制得所述的编码核酸。这些方法例如但不限于:PCR，DNA人工合成等，具体的方法可参见J.萨姆布鲁克，《分子克隆实验指南》。作为本发明的一种实施方式，可通过分段合成核苷酸序列再进行重叠延伸PCR的方法来构建所述核酸序列。编码BMP4的核苷酸序列可以与表达调控序列操作性相连。所述的“操作性相连”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够调节或控制同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。
[0081]表达载体可采用市售的例如但不限于:pIRES、pDR，pUC18等可用于真核细胞系统表达的载体。本领域技术人员可以根据宿主细胞来选择合适的表达载体。根据已知空载表达载体的酶切图谱，本领域技术人员可按照常规方法通过限制性酶剪切与拼接，将BMP4的编码序列插入合适的限制性位点，制得重组表达载体。
[0082]宿主细胞优选的是真核细胞，例如但不限于CHO，COS细胞，293细胞，RSF细胞等。作为优选方式，所述的细胞是CHO细胞，其可良好地表达BMP4蛋白。将所述编码序列导入宿主细胞可采用本领域的多种已知技术，例如但不限于:磷酸钙沉淀，原生质体融合，脂质体转染，电穿孔，微注射，反转录法，噬菌体转导法，碱金属离子法。有关宿主细胞的培养和表达可参见Olander RM Dev Biol Stand 1996;86:338。可通过离心去除悬浮液中的细胞和残渣，收集清液。可通过琼脂糖凝胶电泳技术进行鉴定。
[0083]可将上述制备获得的BMP4纯化为基本均一的性质，例如在SDS-PAGE电泳上呈单一条带。例如，当所述蛋白为分泌表达时，可以采用商品化的超滤膜来分离所述蛋白，例如Millipore、Pellicon等公司产品，首先将表达上清浓缩。浓缩液可采用凝胶层析的方法进一步加以纯化，或采用离子 交换层析的方法纯化。例如阴离子交换层析(DEAE等)或阳离子交换层析。凝胶基质可为琼脂糖、葡聚糖、聚酰胺等常用于蛋白纯化的基质。Q-或SP-基团是较为理想的离子交换基团。最后，还可用羟基磷灰石吸附层析，金属螯合层析，疏水相互作用层析和反相高效液相色谱(RP-HPLC)等方法对上述纯化产物进一步精制纯化。上述所有纯化步骤可利用不同的组合，最终使蛋白纯度达到基本均一。
[0084]可利用含有所述BMP4蛋白的特异性抗体、受体或配体的亲和层析柱进行蛋白纯化。根据所使用的亲和柱的特性，可利用常规的方法，如高盐缓冲液、改变pH等方法洗脱结合在亲和柱上的融合性多肽。可选择地，所述蛋白的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本发明。例如，所述的标签可以是FLAG, HA, HAl，c-Myc，6_His或8_His等。这些标签可用于对BMP4蛋白进行纯化。
[0085]此外，BMP4蛋白还可以从例如Sigma公司等公司购得。
[0086]BMP4 的用途
[0087]本发明还提供了 BMP4用途，它被用于制备治疗肝癌的药物；用于制备促进肝癌干细胞的分化的组合物；用于制备抑制肝癌体外增殖和/或自我更新的组合物；)用于制备抑制肝癌的成瘤能力的组合物；用于制备提高肝癌细胞对抗肿瘤剂敏感性的组合物；用于制备降低肝癌细胞耐药性的组合物。在另一优选例中，所述的BMP4蛋白包括人或非人哺乳动物的BMP4蛋白、或其具有相同诱导肝癌干细胞分化功能的同源蛋白、突变蛋白或衍生蛋白。
[0088]药物组合物和施用方法[0089]本发明提供了能诱导肝癌干细胞分化的药物组合物，包括药学上可接受的载体和有效量的作为活性成分的BMP4蛋白，且组合物为缓释剂型。所述组合物包括缓释颗粒以及吸附于缓释颗粒的BMP4蛋白。所述的缓释颗粒由生物可降解材料(如聚乳酸，聚丙烯酸)制成。所述的缓释药物组合物为注射剂。给药方式为局部给药或瘤内给药。
[0090]所述的缓释药物组合物，还包括额外的抗肿瘤剂。所述的抗肿瘤剂包括化疗药、肿瘤抗体等。在另一优选例中，所述的抗肿瘤剂包括(但并不限于):阿霉素、长春新碱、紫杉醇、顺钼、卡钼、5-FU或其组合。
[0091]如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。
[0092]“药学上可以接受的载体”指的是:一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人或动物使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和药物中的活性成分以及它们之间相互掺和，而不明显降低药效。
[0093]药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如吐温? )、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。
[0094]本发明化合物或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于):局部给药，瘤旁，瘤内，腹膜内、或静脉内等。
[0095]组合物中活性化合 物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。
[0096]除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。
[0097]除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂和香料。
[0098]除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。
[0099]一种优选的剂型是注射剂。用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。
[0100]一种优选的剂型是缓释剂型。用于本发明的缓释剂没有特别选择，可以是本领域采用的各类缓释剂或材料，尤其是生物可降解材料(如PLA等)。
[0101]药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物优选被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约I微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，BMP4还可与其他治疗剂(如抗肿瘤剂)一起使用(包括之前、之中或之后使用)。
[0102]使用药物组合物时，是将安全有效量的药物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约I毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
[0103]药盒及其应用
[0104]本发明提供一种药盒，所述药盒包括:(a)第一治疗剂，所述第一治疗剂是含BMP4作为活性的药物制剂；(b)第二治疗剂，所述第二治疗剂是抗肿瘤剂，所述的抗肿瘤剂含有不同于BMP4的活性成分；和((3)使用说明书。
[0105]所述的含BMP4作为活性的药物制剂为将BMP4在溶剂中溶解获得，所述的溶剂包括水，醇类(甲醇和乙醇)，乙酸乙酯，丙酮，氯仿，二氯甲烷，正己烷或石油醚等有机溶剂。
[0106]所述的抗肿瘤剂优选为含有阿霉素和/或长春新碱的制剂，将阿霉素和/或长春新碱在溶剂中溶解获得，所述的溶剂包括水，醇类(甲醇和乙醇)，乙酸乙酯，丙酮，氯仿，二氯甲烷，正己烷或石油醚等有机溶剂，优选乙酸乙酯和丙酮等中等极性溶剂。
[0107]所述的含有BMP4的制剂选自针剂、片剂、胶囊、或栓剂等，优选针剂。
[0108]所述的含有阿霉素和/或长春新碱的制剂选自针剂、片剂、胶囊、或栓剂等，优选针剂。
[0109]所述含有B MP4的制剂可以是含有BMP4的单元剂型，所述含有阿霉素和/或长春新碱的制剂可以是含有阿霉素和/或长春新碱的单元剂型。
[0110]如本文所用，术语“单元剂型”是指为了服用方便，将组合物制备成单次使用所需的剂型，包括但不限于各种液体剂、固体剂(如片剂)、胶囊剂、缓释剂、靶向剂。
[0111]本发明提供的药盒通过下述步骤制备得到:将含有BMP4的制剂和含有阿霉素和/或长春新碱的制剂，以及说明书一起放置，形成药盒。
[0112]本发明提供的药盒用于治疗肿瘤，所述的肿瘤包括肝癌，肺癌，胃癌等；优选肝癌。
[0113]本发明的主要优点包括:
[0114](I)外源BMP4可使肝癌细胞系中CD133蛋白表达下调，这种下调作用具有时间依赖性和浓度依赖性；
[0115](2)BMP4促进肝癌干细胞分化，抑制PLC/PRF/5细胞体外增殖，抑制肝癌干细胞的自我更新；
[0116](3) BMP4抑制免疫缺陷小鼠体的成瘤能力；
[0117](4) BMP4通过下调ABCG2蛋白表达等途径增强PLC/PRF/5和MHCC-97LCD133+肿瘤干细胞对化疗药物的敏感性；
[0118](5)BMP4激活⑶133+肿瘤干细胞中的BMP经典信号通路，干扰经典通路关键分子SMAD4，使BMP4失去促CD 133蛋白表达下降作用。
[0119]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如 Sambrook 等人，分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
[0120]实验材料
[0121]1.蛋白电泳及免疫印迹实验材料
[0122]分子生物学级Tris base,丙烯酰胺及N, N-亚甲双丙烯酰胺均购Sigma-Aldrich公司；细胞裂解用T-PER组织蛋白抽提试剂购自Pierce公司；蛋白酶抑制剂Cocktail购自Roche公司；BCA蛋白定量试剂盒购自Sigma-Aldrich公司。
[0123]5 X蛋白上样缓冲液、20 X DTT还原剂和PageRuler?预染蛋白质分子量Marker购自Fermentas公司。脱脂奶粉购自Santa Cruz公司。
[0124]本研究所用抗体信息详见表1 ;
[0125]化学发光显色剂SuperSignal West Femto Chemiluminescent Substrate 购自Pierce公司；X_光医用胶片购自Kodak公司。
[0126]表1
【权利要求】
1.一种骨形成蛋白4即BMP4蛋白的用途，其特征在于，所述用途为选自下组的一种或多种的用途: (a)用于制备治疗肝癌的药物； (b)用于制备促进肝癌干细胞的分化的组合物； (C)用于制备抑制肝癌体外增殖和/或自我更新的组合物； (d)用于制备抑制肝癌的成瘤能力的组合物； (e)用于制备提高肝癌细胞对抗肿瘤剂敏感性的组合物； (f)用于制备降低肝癌细胞耐药性的组合物。
2.一种骨形成蛋白4即BMP4蛋白的用途，其特征在于，所述的用途为选自下组的一种或多种用途: (a)用于制备治疗癌症的药物； (b)用于制备促进癌症干细胞的分化的组合物； (C)用于制备抑制癌症的体外增殖和/或自我更新的组合物； (d)用于制备抑制癌症的成瘤能力的组合物； (e)用于制备提高癌症细胞对抗肿瘤剂的敏感性的组合物； (f)用于制备降低癌症细胞的耐药性的组合物。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的癌症是实体瘤，或所述的癌症细胞来源于实体瘤。
4.一种体外非治疗性的诱导肝癌干细胞分化的方法，其特征在于，所述方法包括步骤(I):在添加BMP4蛋白的条件下，培养肝癌干细胞，从而诱导肝癌干细胞的分化。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，还包括步骤:在步骤(I)之前、之中、或之后，在培养体系中添加额外的抗肿瘤剂。
6.一种提高肿瘤细胞对抗肿瘤剂的敏感性或降低肿瘤细胞的耐药性的方法，其特征在于，所述方法包括步骤(I):在添加BMP4蛋白的条件下，培养肿瘤细胞，从而提高肿瘤细胞对抗肿瘤剂的敏感性或降低肿瘤细胞的耐药性。
7.一种缓释药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包括药学上可接受的载体和作为活性成分的BMP4蛋白，且组合物为缓释剂型。
8.如权利要求7所述的缓释药物组合物，其特征在于，所述的BMP4蛋白包括BMP4单体、或BMP4同二聚体，或BMP4异二聚体、或保留BMP4活性的BMP4融合蛋白。
9.如权利要求7所述的缓释药物组合物，其特征在于，还包括额外的抗肿瘤剂。
10.一种用于治疗肿瘤的药盒，其特征在于，所述药盒包括: (a)第一治疗剂，所述第一治疗剂是含BMP4作为活性的药物制剂； (b)第二治疗剂，所述第二治疗剂是抗肿瘤剂，所述的抗肿瘤剂含有不同于BMP4的活性成分；和 (c)使用说明书。
11.一种治疗肿瘤或诱导肿瘤细胞分化的方法，其特征在于，包括步骤:给需要的对象施用BMP4蛋白或权利要求7所述的缓释药物组合物。
【文档编号】A61P1/16GK103463619SQ201210189643
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2012年6月8日 优先权日:2012年6月8日
【发明者】李锦军, 张立行 申请人:上海市肿瘤研究所