专利名称：人骨形成蛋白－4成熟肽的大肠杆菌高表达载体和制备方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，涉及人骨形成蛋白-4成熟肽的大肠杆菌表达载体及其所表达的人骨形成蛋白-4成熟肽的制备方法。
背景技术：
(一)骨形成蛋白概述美国Urist在1965年首先报道将牛的脱钙骨基质植入小鼠肌肉，能诱导形成新的软骨和骨组织[1]，经过20多年的研究证明骨基质中存在一种能够诱导骨组织生成的活性蛋白，命名为骨形成蛋白(Bone Morphogenetic Protein，简称BMP)，这就在理论上证实了骨形成学说，并为临床骨修复的治疗提出了新途径[2，3]。其后发现不仅在动物及人的骨和牙组织中有BMP[4-9]，而且在胚胎和成年动物许多组织中也有BMP[10-11]。至今发现的至少有20种不同的BMP[2-16]，组成BMP家族。研究表明除BMP-1外，其他BMPs都属于转化生长因子β(Transforming growth factor-β，简称TGF-β)超家族的成员，都是分泌性的蛋白，在细胞内先合成大的前体蛋白，经切除先导肽和前肽段，加工成为成熟肽再分泌出细胞。BMP的二聚体是其发挥活性的形式[17-20]。
由于BMP是研究骨形成机制中发现的，因而对BMP诱导成骨的作用研究得最早最充分，目前世界上将BMP应用于医学临床的热点也是对骨损伤和骨疾病的治疗。但骨形成蛋白是多功能的分化因子，不仅能够诱导骨组织的生成，而且在造血组织、神经组织、以及一些器官组织的诱导发生上都起重要作用，因此BMP有着更多方面的临床应用和广阔市场前景。
(二)骨形成蛋白的制备早期用于临床治疗的BMP是从新鲜骨骼组织获得的，但从骨组织提取BMP存在着许多问题(1)材料来源困难要获得大量新鲜的动物骨组织是没有问题的，但提取所得的动物BMP对人有免疫原性，在人体内会引起排斥反应，不适合在人体使用；要取得大量新鲜的人骨组织就很困难。(3)提取步骤繁杂花费大量人力和时间。(4)收获量低一般10kg骨组织提取不到10mg BMP，难以满足临床需要。(5)纯度不好虽然经过许多繁杂的提取步骤，得到的BMP仍然不是纯品，电泳分析仍然有许多杂蛋白带。(6)重复性差各批提取所获得的BMP的纯度和生物学活性差别很大，从骨组织提取BMP的生产难以有严格的质量控制。上述这些问题虽然经过Urist等人30多年的努力，仍然没有解决，至今国外从来没有批准过从骨组织提取来生产BMP的药品投放市场。
因而，用基因工程的手段去获得重组人骨形成蛋白(recombinant human bonemorphogenetic protein，简称rhBMP)成为大量生产合格的人BMP的必然方向。1988年美国的Wozney等[2]率先报道将人BMP-1、-2、-3 cDNA插入真核表达载体，转染培养的CO3-1细胞株，能分泌产生有活性的人BMP-1、-2、-3蛋白。1991年美国Wang等用培养的CHO细胞株也成功表达得到具有诱骨活性的人BMP-2，人BMP-7也都在培养的哺乳动物细胞中成功表达[17，21]。经过15年的努力研究，美国用培养的哺乳动物细胞来表达生产rhBMP-2和rhBMP-7通过了临床试验，分别都在2003年以医疗器械的形式被批准投放市场，用于骨缺损修复和脊椎骨融合等临床治疗。但美国用培养的哺乳动物细胞来表达生产rhBMP表达水平低(＜细胞总蛋白量的1％)、纯化步骤复杂、产量低、成本昂贵，市场价格10μg BMP约500美元，而临床一次使用要10mg，即使是美日欧等富裕国家的人民都用不起。
采用大肠杆菌系统去生产基因工程重组蛋白的突出优点是表达水平高、成本低廉。但Wosney等1988年最早在<Science>发表的研究[2]认为大肠杆菌表达的人BMP-1、-2、-3蛋白都是没有生物学活性的，而且在真核细胞内合成大的前体蛋白后加工复杂，BMP成熟肽形成活性二聚体又涉及14个半胱氨酸正确配对成7对双硫键等空间构象问题，这些在大肠杆菌中不能完成，体外复性将十分困难，因而长时间没有人去研究用大肠杆菌系统去表达生产rhBMP。第一个用大肠杆菌系统成功表达复性获得有良好活性rhBMP的是中国。发明人所在的第四军医大学课题组[22-29]、北京军事医学科学院赵明等[30]、上海生物化学研究所李伯良等[31]先后在1991-1994年用大肠杆菌系统高表达重组人骨形成蛋白-2成熟肽(recombinant human bone morphogenetic protein-2matural peptide，简称rhBMP-2m)，并经过复性获得有良好诱骨活性的rhBMP-2m、rhBMP-3m等。1996年德国Ruppert等[32]也用大肠杆菌系统成功表达复性获得有良好活性rhBMP-2m，并就此在欧洲申请了专利。我国用大肠杆菌系统表达生产的rhBMP-2m于2004年通过临床试验，以医疗器械的形式被批准生产投放市场，用于骨缺损的治疗。
(三)不同的骨形成蛋白的进一步开发应用如前所述，对BMP生物学作用研究得最早最充分的是其诱导骨组织的生成，目前世界上BMP医学临床应用的热点也还是在成骨的作用上，每年发表几百篇BMP的研究论文内容也主要集中在BMP诱导成骨的机制和实际应用上，至今已经开发投放市场的只有BMP-2和BMP-7，都是用于骨疾病的治疗上。虽然BMP对骨疾病的治疗应用也还会有更多的发展，但骨形成蛋白是多功能的分化因子，不仅能够诱导骨组织的生成，而且在造血组织、神经组织、以及一些器官组织的诱导发生上都起重要作用，有着多方面广阔的临床应用和市场前景。至今发现的20多种不同BMP[2-16]，对不同组织细胞的分化作用上也各自有所不同。不同的BMP、不同的诱导分化功能都有待开发应用。
近年来BMP诱导造血的功能的研究引人注目[33-41]。实际上BMP在诱导异位骨组织时也同时诱导异位造血组织形成；而且在胚胎时期，BMP在诱导造血组织生成的作用更早于骨组织的形成。其中BMP-4在诱导造血组织生成上起更重要的作用[33-39]，这些研究资料提示BMP-4在诱导造血方面的功能会有很好的临床应用前景。
Hammonds等曾在1991年曾用培养的哺乳动物细胞表达rhBMP-4[42]，但由于上述用培养的哺乳动物细胞生产上的困难，至今没有见用于大量生产rhBMP-4的报道。美国用小鼠NSO细胞表达生产的BMP-4作为研究用试剂已经放在Sigma产品目录上[43]，但由于用培养真核细胞表达生产的问题和困难，并没有将其研究向大量生产推进。2003年上海第二医科大学蒋欣泉等[44]构建真核表达载体pEGFP-hBMP-4，体外转染入培养兔骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells，bMSCs)，利用其作为种子细胞分泌hBMP-4，促进天然型无机骨支架材料上新骨的形成。这是应用hBMP-4基因转染的细胞去构建组织工程化骨的研究，并不是去制备生产hBMP-4。迄今，还没有构建大肠杆菌基因工程高表达载体生产人骨形成蛋白-4(rhBMP-4)成熟肽的报道。
发明内容
针对上述现有技术状况，本发明的目的在于提供一种人骨形成蛋白-4成熟肽rhBMP-4m(recombinant human bone morphogenetic protein-4 matural peptide，简称rhBMP-4m)的大肠杆菌高表达载体，并用该载体转化宿主菌去表达人骨形成蛋白-4成熟肽，再经过纯化、复性等步骤，制备出有生物活性人骨形成蛋白-4成熟肽的方法。以期将rhBMP-4m这一新的基因工程产品推向临床疾病的治疗、诊断和科学研究应用，并推向市场。
本发明首先提供一种人骨形成蛋白-4成熟肽的大肠杆菌高表达载体本发明所构建的人骨形成蛋白-2成熟肽的表达载体pDH2-hB4m，是先设计合成DNA引物，用PCR扩增技术从人组织cDNA文库中扩增得到编码人骨形成蛋白-4成熟肽的cDNA序列后，再重组克隆入载体pDH2，经筛选鉴定而获得表达载体pDH2-hB4m，该载体能够在大肠杆菌中高水平表达出人骨形成蛋白-4成熟肽，载体DNA全长4,014个核苷酸对(base pairs，简写bp)，全部核苷酸序列如下(表达载体的质粒环形结构示意图见附图1)1 AGATCTCTCT CACCTACCAA ACAATGCCCC CCTGCAAAAA ATAAATTCAT ATAAAAAACATCTAGAGAGA GTGGATGGTT TGTTACGGGG GGACGTTTTT TATTTAAGTA TATTTTTTGT61 TACAGATAAC CATCTGCGGT GATAAATTAT CTCTGGCGGT GTTGACATAA ATACCACTGGATGTCTATTG GTAGACGCCA CTATTTAATA GAGACCGCCA CAACTGTATT TATGGTGACC121 CGGTGATACT GAGCACATCA GCAGGACGCA CTGACCACCA TGAAGGTGAC GCTCTTAAAAGCCACTATGA CTCGTGTAGT CGTCCTGCGT GACTGGTGGT ACTTCCACTG CGAGAATTTT181 ATTAAGCCCT GAAGAAGGGC AGCATTCAAA GCAGAAGGCT TTGGGGTGTG TGATACGAAATAATTCGGGA CTTCTTCCCG TCGTAAGTTT CGTCTTCCGA AACCCCACAC ACTATGCTTT241 CGAAGCATTG GTTAAAAATT AAGGAGAATT CATGAAGCAT CACTCACAGC GGGCCAGGAAGCTTCGTAAC CAATTTTTAA TTCCTCTTAA GTACTTCGTA GTGAGTGTCG CCCGGTCCTT301 GAAGAATAAG AACTGCCGGC GCCACTCGCT CTATGTGGAC TTCAGCGATG TGGGCTGGAACTTCTTATTC TTGACGGCCG CGGTGAGCGA GATACACCTG AAGTCGCTAC ACCCGACCTT361 TGACTGGATT GTGGCCCCAC CAGGCTACCA GGCCTTCTAC TGCCATGGGG ACTGCCCCTTACTGACCTAA CACCGGGGTG GTCCGATGGT CCGGAAGATG ACGGTACCCC TGACGGGGAA421 TCCACTGGCT GACCACCTCA ACTCAACCAA CCATGCCATT GTGCAGACCC TGGTCAATTCAGGTGACCGA CTGGTGGAGT TGAGTTGGTT GGTACGGTAA CACGTCTGGG ACCAGTTAAG481 TGTCAATTCC AGTATCCCCA AAGCCTGTTG TGTGCCCACT GAACTGAGTG CCATCTCCATACAGTTAAGG TCATAGGGGT TTCGGACAAC ACACGGGTGA CTTGACTCAC GGTAGAGGTA541 GCTGTACCTG GATGAGTATG ATAAGGTGGT ACTGAAAAAT TATCAGGAGA TGGTAGTAGACGACATGGAC CTACTCATAC TATTCCACCA TGACTTTTTA ATAGTCCTCT ACCATCATCT601 GGGATGTGGG TGCCGCTGAT AATCTAGAGT CGACCTGCAG GCATGCAAGC TTCTGTTTTGCCCTACACCC ACGGCGACTA TTAGATCTCA GCTGGACGTC CGTACGTTCG AAGACAAAAC661 GCGGATGAGA GAAGATTTTC AGCCTGATAC AGCTTAAATC AGAACGCAGA AGCGGTCTGACGCCTACTCT CTTCTAAAAG TCGGACTATG TCGAATTTAG TCTTGCGTCT TCGCCAGACT721 TAAAACAGAA TTTGCCTCCC GGCAGTAGCG CGGTGGTCCC ACCTGACCCC ATGCCGAACTATTTTGTCTT AAACGGAGGG CCGTCATCGC GCCACCAGGG TGGACTGGGG TACGGCTTGA781 CAGAAGTGAA ACGCCGTAGC GCCGATGGTA GTGTGGGGTC TCCCCATGCG AGAGTAGCCAGTCTTCACTT TGCGGCATCG CGGCTACCAT CACACCCCAG AGGGGTACGC TCTCATCGGT841 ACTGCCAGGC ATCAAATAAA ACGAAAGGCT CAGTCGAAAG ACTGGGCCTT TCGTTTTATCTGACGGTCCG TAGTTTATTT TGCTTTCCGA GTCAGCTTTC TGACCCGGAA AGCAAAATAG901 TGTTGTTTGT CGGTGAACGC TCTCCTGAGT AGGACAAATC CGCCGGGAGC GGATTTGAACACAACAAACA GCCACTTGCG AGAGGACTCA TCCTGTTTAG GCGGCCCTCG CCTAAACTTG961 GTTGCGAAGC AACGGCCCGG AGGGTGGCGG GCAGGACGCC CGCCATAAAC TGCCAGGCATCAACGCTTCG TTGCCGGGCC TCCCACCGCC CGTCCTGCGG GCGGTATTTG ACGGTCCGTA1021 CAAATTAAGC AGAAGGCCAT CCTGACGGAT GGCCTTTTTG CGTTTCTACA AACTCTTTGTGTTTAATTCG TCTTCCGGTA GGACTGCCTA CCGGAAAAAC GCAAAGATGT TTGAGAAACA
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根据上述步骤3所述裂菌、包涵体洗涤的具体过程如下
(1)加裂解缓冲液，溶菌酶，冰浴中超声裂菌；(2)离心所得包涵体沉淀，2～6次离心洗涤，取包涵体沉淀样品作电泳分析。
根据上述步骤4所述离子柱层析分离的具体过程如下(1)洗涤后的包涵体溶解于6～8M尿素pH3～7缓冲液中，上离子柱层析，依次用不同摩尔浓度NaCl洗脱得洗脱峰液1、2、3；所述的不同摩尔浓度NaCl溶液分别为0.1～0.3M、0.4～0.8M、0.9～1.2M；(2)收集合并洗脱峰液2，透析去除尿素，离心，得湿沉淀。
图1pDH2-hB4m表达载体质粒环型结构示意2pDH2-hB4m/DH5α42℃诱导表达PAGE-SDS电泳图谱图3pDH2-hB4m/DH5α42℃诱导表达PAGE-SDS电泳光密度扫描4pDH2-hB4m/DH5α高密度发酵诱导表达后的12％PAGE-SDS电泳图谱图5pDH2-hB4m/DH5α高密度发酵诱导表达后的12％PAGE-SDS电泳光密度扫描6Sepharose SP柱层析图谱图7Sepharose SP柱层析纯化后样品的12％PAGE-SDS电泳图谱图8Sepharose SP柱层析纯化后样品PAGE-SDS电泳光密度扫描9复性后rhBMP-4m的还原和非还原SDS-PAGE电泳图谱其中图1pDH2-hB4m表达载体质粒环型结构示意图PL是启动子，能启动hBMP-4m基因的转录开放去合成蛋白质；cl857是编码温度敏感性阻遏蛋白的基因，所合成的温度敏感性阻遏蛋白，在低于32℃时阻止PL启动子的转录作用，温度升高(42℃)时则失去阻遏作用，PL启动子就发挥作用开始下游基因(hBMP-4m基因)转录；Ampr是编码抗氨苄青霉素蛋白的基因，是该质粒的抗性筛选基因。从该示意图可以看出本发明pDH2-hB4m表达载体的基本结构和构建设计思想。
图2pDH2-hB4m/DH5α42℃诱导表达12％PAGE-SDS电泳图谱PAGE-SDS为十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶简称(下同)；1-7是在42℃时分别诱导表达1、2、3、4、5、6、7个小时的样品；UpDH2-hB4m/DH5α在42℃时的诱导对照样品；M为蛋白质分子量标志物Markers；在此SDS-PAGE电泳图谱中，42℃诱导表达1小时，即可见到目的蛋白(rhBMP-4m)的表达，随诱导时间延长，细菌中的目的蛋白(rhBMP-4m)量增加，4小时达到平台，6小时目的蛋白(rhBMP-4m)量占细菌总蛋白量的41.5％。说明由表达载体pDH2-hB4m质粒转化的大肠杆菌有高水平的表达重组人骨形成蛋白-4成熟肽的能力。
图3pDH2-hB4m/DH5α42℃诱导表达6小时PAGE-SDS电泳光密度扫描图纵坐标为光密度值；横坐标为电泳距离；此SDS-PAGE电泳道激光光密度扫描得出DH5α/pDH2-hB4m42℃诱导表达6小时目的蛋白(rhBMP-4m)量占细菌总蛋白量的41.5％。说明由表达载体pDH2-hB4m质粒转化的大肠杆菌有高水平的表达重组人骨形成蛋白-4成熟肽的能力。
图4DH5α/pDH2-hB4m高密度发酵诱导表达6h后的12％PAGE-SDS电泳图谱其中F为高密度发酵诱导后的全菌样品，M为蛋白质分子量标志；PAGE-SDS电泳图谱来自15升发酵罐42℃诱导表达6hr的结果，可以看到目的蛋白rhBMP-4m占细菌总蛋白量39.0％；该结果表明，即使是在高密度发酵的条件下发酵液OD600光密度值达到43.5，pDH2-hB4m/DH5α菌仍然能够给出很高的目的蛋白(rhBMP-4m)表达水平，说明其适合于大规模生产之用。
图5是pDH2-hB4m/DH5α高密度发酵诱导表达后的12％PAGE-SDS电泳光密度扫描图其中纵坐标表示光密度值，横坐标表示距离；电泳光密度扫描分析说明由于发酵时诱导表达目的蛋白rhBMP-4m的水平比较高，因此其后的纯化操作就比较容易，包涵体离心洗涤仅4次，目的蛋白rhBMP-4m的纯度就已经达到85％。
图6是Sepharose SP柱层析图谱图中纵坐标为A280光密度值，横坐标为洗脱体积；该图显示出SP阳离子柱层析时蛋白质被洗脱分离的情况。
图7是Sepharose SP柱层析纯化后样品的12％PAGE-SDS电泳图谱B是SP柱层析前的样品电泳道；A78是SP柱层析0.78M NaCl洗脱峰样品电泳道；A28-3是SP柱层析0.28M NaCl洗脱的第3峰峰样品电泳道；从该电泳图谱中可以看到人骨形成蛋白-4成熟肽集中在Sepharose SP阳离子柱层析收集的0.78M NaCl洗脱峰液和0.28M NaCl洗脱的第3峰液中，纯度已经比较好。
图8是Sepharose SP柱层析纯化后样品PAGE-SDS电泳光密度扫描图纵坐标为光密度值，横坐标为距离；对电泳泳道的激光光密度扫描分析的结果是此次经过SP柱层析纯化后的人骨形成蛋白-4成熟肽纯度达到97.7％。
图9复性后rhBMP-4m的还原和非还原PAGE-SDS电泳电泳图谱R为还原电泳道；U非还原电泳道。
从电泳图谱可见复性后的rhBMP-4m约40％以二聚体形式存在。
具体实施例方式
现结合附图对本发明人骨形成蛋白-4成熟肽的大肠杆菌高表达载体的具体实施方式
做进一步说明实施例1人骨形成蛋白-4成熟肽的大肠杆菌高表达载体的具体实施方式
如下(1)新鲜人胎盘组织中提取总RNA；(2)反转录得cDNA文库；(3)设计并合成引物；(4)用PCR技术从cDNA文库中扩增得到编码人骨形成蛋白-4成熟肽的DNA序列(5)克隆入本课题组构建的pDH2载体(见附图1)；(6)获得pDH2-hB4m表达载体，进行限制性酶切鉴定和DNA序列测定鉴定(序列见前)(7)转化不同的大肠杆菌株，进行诱导表达及表达条件测试和菌株发酵罐高密度发酵试验；构建得到的表达载体pDH2-hB4m经双方向测定质粒DNA的核苷酸全序列，实际测定所得的质粒DNA全部4,014个核苷酸的序列已列出在发明内容中，由此全序列所绘出的表达载体的质粒环形结构示意图见附图1。构建得到的表达载体pDH2-hB4m分别转化大肠杆菌宿主菌如DH5α或TOP10、或TB1，经30℃摇瓶扩大培养后，42℃诱导表达，所表达的rhBMP-4m蛋白量占菌体总蛋白量在40-45％之间，pDH2-hB4m/DH5α表达的电泳分析结果见附图2。表明表达载体pDH2-hB4m有很强的表达能力，在不同的大肠杆菌宿主菌中表达rhBMP-4m蛋白量都有很高的水平。
实施例2以20040622批试验为例，结合图2～9对本发明用表达载体pDH2-hB4m制备rhBMP-4m方法做进一步说明，具体实施步骤如下。
步骤1用表达载体pDH2-hB4m转化大肠杆菌宿主菌DH5α采用常规方法用pDH2-hB4m转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经氨苄青霉素抗性筛选、提取质粒鉴定、诱导表达试验(见附图2)检测，获得转化菌pDH2-hB4m/DH5α。此转化菌经摇瓶30℃培养至OD600＝0.4时后，42℃诱导表达1小时，即可见到目的蛋白(rhBMP-4m)的表达，随诱导时间延长，细菌中的目的蛋白(rhBMP-4m)量增加，4小时达到平台，6小时目的蛋白(rhBMP-4m)量占细菌总蛋白量的41％(电泳分析见附图2)。DH5α/pDH2-hB4m培养传50代，所带的表达质粒pDH2-hB4m没有丢失，限制性酶切鉴定和序列测定结果插入的hBMP-4m蛋白编码基因没有变化；DH5α/pDH2-hB4m诱导后的rhBMP-4m蛋白表达水平没有改变，表明DH5α/pDH2-hB4m菌稳定可靠。在15升发酵罐中高密度发酵A600值达40上，rhBMP-4m蛋白表达量仍占菌体总蛋白量的35-40％(见附图3)，表明DH5α/pDH2-hB4m菌适合于大规模发酵生产使用。
步骤2采用在培养器中震摇培养液或在发酵罐中发酵等方法，对经表达载体pDH2-hB4m转化的大肠杆菌扩大培养后，升高温度，诱导表达人骨形成蛋白-4成熟肽在此次具体实施中，pDH2-hB4m/DH5α菌在15升发酵罐中，采用自动控制恒溶氧高密度发酵、诱导表达，方法和结果如下(1)、菌种复苏及培养扩增取-70℃保存的pDH2-hB4m/DH5α菌甘油菌种，划LB琼脂平板(含100μg Amp/ml)，32℃培养20hr。挑单菌落入6ml LB(含100μg Amp/ml)，30℃摇床培养16hr。转入300ml LB(含100μg Amp/ml)，30℃摇床培养10hr。
(2)、恒溶氧高密度培养转入15升发酵罐30℃培养，计算机自动控制搅拌、通气溶氧，30℃培养16hr。取样检测OD600值＝33。
(3)、恒溶氧高密度培养诱导表达15升发酵罐42℃诱导表达6hr。结束发酵，取出全部发酵液总量为8,900ml，取样检测OD600值＝43.5。SDS-PAGE电泳分析，目的蛋白(rhBMP-4m)占细菌总蛋白量39.0％(见附图3)。表明即使是在高密度发酵的条件下(发酵液OD600光密度值达到43.5)，pDH2-hB4m/DH5α菌仍然能够给出很高的目的蛋白(rhBMP-4m)表达水平，说明其适合于大规模生产之用。
(4)、离心收菌4℃、6000rpm，离心20min，收得菌体湿重531.4克。
步骤3收集经诱导表达后的细菌，用溶菌酶或超声波等化学物理手段裂解细菌，获得包涵体，洗涤包涵体此次具体实施中，向收得的湿菌体531克加入裂解缓冲液1,600ml，加溶菌酶，冰浴中超声裂菌。离心所得包涵体沉淀，经过4次离心洗涤，收得包涵体沉淀23.87g。取样作SDS-PAGE电泳分析，目的蛋白(rhBMP-4m)占细菌总蛋白量85％(见附图4)。这结果说明由于发酵时诱导表达目的蛋白(rhBMP-4m)的水平比较高，因此其后的纯化操作就比较容易，只是包涵体离心洗涤4次，目的蛋白(rhBMP-4m)的纯度已经比较高。
步骤4用尿素溶解包涵体，经离子交换层析纯化人骨形成蛋白-4成熟肽将洗涤后的包涵体23.87g溶解于690ml 8M尿素pH6.5缓冲液中，上Sepharose SP-FF阳离子柱，依次用0.28M NaCl、0.78M NaCl、1.0M NaCl洗脱，(层析图谱见附图5)。收集合并0.78M NaCl洗脱峰液和0.28M NaCl洗脱的第3峰液，透析去除尿素，离心，得湿沉淀22.72g。取沉淀样品，作SDS-PAGE电泳分析，(电泳图谱见附图6)，结果表明人骨形成蛋白-4成熟肽集中在SP-FF阳离子柱收集的0.78M NaCl洗脱峰液和0.28M NaCl洗脱的第3峰液中，而且纯度已经比较好。对电泳泳道进行激光光密度扫描(光密度扫描图见附图7)，结果rhBMP-4m纯度为97.7％。
步骤5用稀释复性或透析复性或凝胶过滤复性或层析柱上复性的通用蛋白质复性方法，使纯化的人骨形成蛋白-4成熟肽复性成为有生物学活性的产品此次具体实施采取透析法复性。将经离子交换柱层析纯化的蛋白质湿沉淀每1克溶解于50ml 8M尿素pH6.5缓冲液中，10℃环境下对6M尿素pH4.8缓冲液透析48h，再对10mMpH4.8缓冲液透析去除尿素。取出透析液，为无色透明液体，蛋白质处于完全溶解的水溶液状态，。
步骤6用凝胶过滤或离子交换层析或疏水层析或亲和层析的方法分离复性后的人骨形成蛋白-4成熟肽二聚体此次具体实施用凝胶过滤分离复性后的人骨形成蛋白-4成熟肽二聚体步骤7对复性后的人骨形成蛋白-4成熟肽进行理化鉴定包括以下内容(1)、蛋白质定量分析。用BCA法作蛋白质定量，复性的蛋白质溶液浓度为4.32mg/ml。计算经离子交换柱层析纯化的蛋白质湿沉淀每克含蛋白质为4.32mg/ml×50ml＝216mg，即按蛋白质约占湿沉淀重量的20％。计算rhBMP-4m的收获量22.72g湿沉淀中，纯度为98％的rhBMP-4m量约为4.54g，即每升发酵液约能获得纯度为98％的rhBMP-4m蛋白0.51g。
(2)、分析复性后的rhBMP-4m二聚体含量。取复性后的rhBMP-4m作还原和非还原SDS-PAGE电泳分析，还原电泳图显示rhBMP-4m纯度＞98％，非还原电泳图显示rhBMP-4m二聚体占蛋白量的43％(电泳图谱见附图8)。
(3)、测定纯化的rhBMP-4m氨基酸序列。测定纯化的rhBMP-4m氨基端(N-端)20个氨基酸序列和羧基端(C端)的氨基酸，结果与设计的预期完全一致，N-端的第一个蛋氨酸已被切除。从编码的cDNA序列推断和实际测定结果可知rhBMP-4m蛋白由116个氨基酸组成，全序列如下1 SPKHHSQRAR KKNKNCRRHS LYVDFSDVGW NDWIVAPPGY QAFYCHGDCP51 FPLADHLNST NHAIVQTLVN SVNSSIPKAC CVPTELSAIS MLYLDEYDKV101 VLKNYQEMVV EGCGCR对rhBMP-4m蛋白性质分析
步骤8检测复性后的人骨形成蛋白-4成熟肽的生物学活性(具体实施包括体外和整体生物学活性检测方法)1、对特定培养细胞株的刺激等体外实验方法在此试验中下述2种方法检测的结果都显示上述复性后的rhBMP-4m蛋白在1-10ng/ml的浓度水平就表现出活性。
(1)用培养的NIH3T3细胞株，在培养液中加入有活性的BMP，会刺激细胞增加碱性磷酸酶(ALP)的合成，可用现成的ALP检测盒进行检测。这是国内外都常用的检测BMP的方法[见参考文献32]。
(2)用本课题组建立并获得专利的C2C12-K4细胞(国家专利号ZL 01 1 31813.9)测定BMP活性。此检测法对BMP生物活性的检测更特异，其基本原理是本课题组所建立的C2C12-K4细胞，细胞膜表面有BMP受体，细胞基因组内整合有接受BMP受体传递的信息而表达的荧光素酶(luciferase)报告基因。当加入有生物学活性的BMP时，BMP与细胞膜表面的BMP受体相互作用而向细胞发出信号，经信号传导，使荧光素酶表达，能够分解酶的底物发出荧光，荧光的强弱可以反映BMP的生物活性。
2、整体动物诱导异位骨组织生成试验方法整体动物肌袋诱导异位成骨试验是世界公认的整体BMP生物活性检测试验。一般将1-2mg不溶性BMP(或将BMP吸附在某些载体上)，植入小鼠肌肉，通常在2周左右局部会诱导生成软骨，3周左右会形成骨组织。本方案具体实施是将复性后的rdhBMP-4m沉淀吸附在小块猪皮胶元上，植入小鼠肌肉，结果2-3周时局部已经形成硬块，取局部组织做组织切片染色，显微镜下观察，证实不同时间有软骨和骨组织的形成(显微镜照片见附图9)，证明复性后的rdhBMP-4m有良好的诱导异位成骨的活性。
权利要求
1.一种人骨形成蛋白-4成熟肽的大肠杆菌表达载体，其特征在于所述的人骨形成蛋白-4成熟肽的大肠杆菌表达载体是指用分子克隆技术将从人体组织cDNA文库中扩增得到人骨形成蛋白-4成熟肽的cDNA序列，再克隆重组获得的大肠杆菌表达载体pDH2-hB4m，该载体能够在大肠杆菌中高水平表达出人骨形成蛋白-4成熟肽，载体DNA全长4,014个核苷酸对，全部核苷酸序列如下1 AGATCTCTCT CACCTACCAA ACAATGCCCC CCTGCAAAAA ATAAATTCAT ATAAAAAACATCTAGAGAGA GTGGATGGTT TGTTACGGGG GGACGTTTTT TATTTAAGTA TATTTTTTGT61 TACAGATAAC CATCTGCGGT GATAAATTAT CTCTGGCGGT GTTGACATAA ATACCACTGGATGTCTATTG GTAGACGCCA CTATTTAATA GAGACCGCCA CAACTGTATT TATGGTGACC121 CGGTGATACT GAGCACATCA GCAGGACGCA CTGACCACCA TGAAGGTGAC GCTCTTAAAAGCCACTATGA CTCGTGTAGT CGTCCTGCGT GACTGGTGGT ACTTCCACTG CGAGAATTTT181 ATTAAGCCCT GAAGAAGGGC AGCATTCAAA GCAGAAGGCT TTGGGGTGTG TGATACGAAATAATTCGGGA CTTCTTCCCG TCGTAAGTTT CGTCTTCCGA AACCCCACAC ACTATGCTTT241 CGAAGCATTG GTTAAAAATT AAGGAGAATT CATGAAGCAT CACTCACAGC GGGCCAGGAAGCTTCGTAAC CAATTTTTAA TTCCTCTTAA GTACTTCGTA GTGAGTGTCG CCCGGTCCTT301 GAAGAATAAG AACTGCCGGC GCCACTCGCT CTATGTGGAC TTCAGCGATG TGGGCTGGAACTTCTTATTC TTGACGGCCG CGGTGAGCGA GATACACCTG AAGTCGCTAC ACCCGACCTT361 TGACTGGATT 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2.一种用权利要求1所述的人骨形成蛋白-4成熟肽的大肠杆菌表达载体制备人骨形成蛋白-4成熟肽的方法，包括宿主菌转化表达、培养、纯化、复性、活性鉴定过程，其特征在于具体步骤如下步骤1用权利要求1所述的表达载体pDH2-hB4m转化大肠杆菌宿主菌，构建成为能够表达人骨形成蛋白-4成熟肽的细菌；所述的大肠杆菌宿主菌是指公知的大肠杆菌DH5α或TOP10或TAP106或TB1或用于基因工程可转化的大肠杆菌；步骤2采用在培养器中震摇培养液或在发酵罐中发酵的方法，对经表达载体pDH2-hB4m转化的大肠杆菌扩大培养后，升高温度，诱导表达人骨形成蛋白-4成熟肽；步骤3收集经诱导表达后的细菌，用包括加入溶菌酶、DNA酶、超声波的化学物理手段裂解细菌，获得包涵体，对包涵体进行洗涤纯化；步骤4用变性剂溶解包涵体，经离子交换层析纯化人骨形成蛋白-4成熟肽；步骤5用稀释复性或透析复性或凝胶过滤复性或层析柱上复性的通用蛋白质复性方法，使纯化的人骨形成蛋白-4成熟肽复性成为有生物学活性的产品；步骤6用凝胶过滤或离子交换层析或疏水层析或亲和层析的方法分离复性后的人骨形成蛋白-4成熟肽二聚体；步骤7对复性后的人骨形成蛋白-4成熟肽进行理化鉴定；包括对复性后的人骨形成蛋白-4成熟肽进行蛋白质定量分析；用电泳、色谱手段鉴定复性后的人骨形成蛋白-4成熟肽及其二聚体；测定所取得的人骨形成蛋白-4成熟肽的氨基酸序列；步骤8检测复性后的人骨形成蛋白-4成熟肽及其二聚体的生物学活性；包括用对特定培养细胞株的刺激的体外实验方法、用整体动物诱导异位骨组织生成的方法检测复性后的人骨形成蛋白-4成熟肽的生物学活性。
3.根据权利要求2所述的制备人骨形成蛋白-4成熟肽的方法，其特征在于所述裂菌、包涵体洗涤步骤的具体过程如下(1)裂解缓冲液，加溶菌酶，冰浴中超声裂菌；(2)离心所得包涵体沉淀，2～6次离心洗涤，取包涵体沉淀样作电泳分析。
4.根据权利要求2所述的制备人骨形成蛋白-4成熟肽的方法，其特征在于所述离子柱层析分离步骤的具体过程如下(1)洗涤后的包涵体溶解于6～8M尿素pH3～7缓冲液中，上离子柱层析，依次用不同摩尔浓度NaCl洗脱得洗脱峰液1、2、3；(2)收集合并洗脱峰液2，透析去除尿素，离心，得湿沉淀。
5.根据权利要求4所述的制备人骨形成蛋白4成熟肽的方法，其特征在于所述的不同摩尔浓度NaCl溶液分别为0.1～0.3M、0.4～0.8M、0.9～1.2M。
全文摘要
本发明涉及人骨形成蛋白－4成熟肽的大肠杆菌表达载体及其所表达的人骨形成蛋白4成熟肽的制备方法。所述的载体是指用分子克隆技术重组获得的大肠杆菌表达载体pDH2－hB4m，载体全长4,014个核苷酸对；所述利用表达载体pDH2－hB4m制备具有生物学活性人骨形成蛋白－4成熟肽的方法，包括宿主菌转化表达、培养、纯化、复性、活性鉴定步骤。本发明所提供的大肠杆菌高表达载体和用该载体转化宿主菌表达人骨形成蛋白－4成熟肽的制备方法，可以作为新的基因工程产品及其方法推向临床治疗、诊断和科学研究应用，并推向市场。
文档编号C07K1/14GK1743457SQ20041007316
公开日2006年3月8日 申请日期2004年10月11日 优先权日2004年10月11日
发明者陈苏民, 秦云, 陈南春 申请人:中国人民解放军第四军医大学