表达鸡大肠杆菌外膜蛋白重组菌及其构建方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种表达鸡大肠杆菌外膜蛋白重组菌及其构 建方法。
【背景技术】
[0002] 鸡大肠杆菌病是由大肠埃希氏菌（Escherichiacoll)的某些血清型菌株所引起 的一种鸡的传染病。不同品种不同日龄的鸡都可发生。由于感染途径不同，临床主要表现 为败血症、关节炎、心包炎、肝周炎、气囊炎、输卵管炎、腹膜炎、大肠杆菌肉芽肿和全眼球炎 等多种病型。1885年Escherch首先发现大肠杆菌，1894年Ligniers系统报导了本病并分 离出病原，在相当长的一段时间，大肠杆菌一直被认为是正常肠道菌群的组成部分，直到上 世纪中叶才认识到一些特殊血清型的大肠杆菌对人和畜禽有病原性。随着养鸡业的发展， 病原性大肠杆菌在各国的流行日益严重。此病在瑞典、荷兰、法国、匈牙利、保加利亚、美国、 前苏联及其它养殖业发达的国家均有发生。随着我国养鸡业集约化程度的不断提高，该病 不断地在我国蔓延和扩散，全国大部分省、市、自治区皆有报导。
[0003] 大肠杆菌致病性菌株的致病因子（或称毒力因子）主要由该病原体的三个特 征确定：侵袭力、感染性和致病性潜力；其致病力因素则主要有细菌菌毛、毒素、外膜蛋白 (Outermembraneprotein,Omp)、铁转运系统等等。菌毛蛋白（或称粘着素、定居因子）、 肠毒素、和外膜蛋白是大肠杆菌的主要毒力因子。研究表明，位于外膜外侧的鸡源大肠杆菌 外膜蛋白能客观反映大肠杆菌分离株的遗传相关性，且在大肠杆菌致病机理及免疫机理中 具有重要作用，致病株和非致病株毒力不同，可能是外膜蛋白的改变，由遗传因素造成。〇mp 可以加快巨噬细胞对抗原的摄取，激活淋巴细胞的增殖反应，刺激机体体液免疫，加强细胞 免疫功能，从而抵抗同源菌和异源菌的攻击，这提示了其在预防疾病方面具有很大潜力，是 一种重要的致病因子。
[0004] 在药物治疗方面，由于大量抗生素长期使用和滥用，致使耐药菌株越来越多，耐药 谱不断扩展、产生耐药性的能力越来越强。使得药物控制难度越来越大，可供选择药物的空 间也越来越小。这就给药物防治鸡大肠杆菌病带来很大的困难。因此研制有效的疫苗来预 防鸡大肠杆菌病，越来越受到重视并被广泛的采用。由于鸡致病性大肠杆菌抗原结构复杂， 血清型众多，不同血清型菌株之间缺乏完全交叉保护，加之不同地区的优势血清型又存在 很大的差异。因此，解决此问题的关键在于找出禽大肠杆菌共同的保护性抗原，以制备对不 同血清型菌株均有保护作用的疫苗，使用基因工程疫苗预防本病具有重要意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种表达鸡大肠杆菌外膜蛋白重组菌，以提高免疫的效 果，降低防治鸡大肠杆菌疫苗的生产成本。
[0006] 本发明的另一目的是提供上述表达鸡大肠杆菌外膜蛋白重组菌的构建方法。
[0007] 本发明还有一目的是提供上述表达鸡大肠杆菌外膜蛋白重组菌在制备鸡大肠杆 菌病免疫疫苗中的应用。
[0008] 本发明的再一目的是提供一种鸡大肠杆菌外膜蛋白基因工程亚单位疫苗。
[0009] 为达到上述目的，采用的技术方案如下：
[0010] 一种表达鸡大肠杆菌外膜蛋白重组菌，其导入了鸡大肠杆菌外膜蛋白操纵子基因 重组质粒。其中，受体菌株为DH5a和BL21。
[0011] 上述表达鸡大肠杆菌外膜蛋白重组菌的构建方法，包括如下步骤：
[0012] 1、鸡大肠杆菌外膜蛋白结构基因及各功能性基因的PCR扩增；
[0013]2、能够呈现表达鸡大肠杆菌外膜蛋白重组质粒的构建。
[0014] 其中，步骤1所述的鸡大肠杆菌外膜蛋白操纵子基因的PCR扩增包括如下步骤：
[0015]A、引物的设计与合成；
[0016]B、DNA片段的提取；
[0017]C、鸡大肠杆菌外膜蛋白操纵子基因的扩增、连接、转化与表达。
[0018] 其中，步骤2所述的重组质粒的构建方法包括如下步骤：鸡大肠杆菌外膜蛋白操 纵子基因的PCR扩增产物的连接、质粒构建和操纵子基因表达质粒的连接、构建与鉴定、以 及表达的外膜蛋白的抗原制备。
[0019] 其中，步骤2中所使用的质粒为pUCm-T和pET-28a。
[0020] 表达鸡大肠杆菌外膜蛋白重组菌,在制备鸡大肠杆菌病免疫疫苗中的应用。
[0021] 一种鸡大肠杆菌外膜蛋白基因工程亚单位疫苗，它是通过如下方法制得：将表达 鸡大肠杆菌外膜蛋白重组菌的表达产物与吐温-80按体积96:4混匀作为水相，白油与司 班-80按体积94:6加热溶解作为油相，油相与水相按体积比3:1的比例乳化。
[0022] 本发明具有如下有益效果：
[0023] 本发明的表达鸡大肠杆菌外膜蛋白重组菌，其表达产物产量高，成本低，易于实现 疫苗产业化生产。
【附图说明】
[0024] 图1外膜蛋白C基因的PCR扩增产物电泳，其中，M泳道是核酸DNAMarker，L1为 外膜蛋白CPCR扩增产物约llOObp。
[0025] 图2为质粒pUCm-C酶切电泳，其中，M泳道是核酸DNAMarker，L1为BamHI和 Hindlll双酶切结果。
[0026] 图3为pET-C酶切电泳，其中，M泳道是核酸DNAMarker，L1为BamHI和Hindlll 双酶切结果。
[0027] 图4为pET-C蛋白电泳，其中，泳道M为低分子量蛋白Marker，泳道LI、L2为 pET-C，泳道L3、L4为空质粒pET-28a。
[0028] 图5为pET-C表达蛋白在大肠杆菌中的分布蛋白电泳，其中，泳道M为低分子量蛋 白Marker，泳道L1为pET-C可溶性形式存在，泳道L2为pET-C包涵体形式存在。
[0029] 图6为外膜蛋白C基因表达产物的Westernblot分析，其中L1为空质粒对照，L2 为pET_C表达蛋白，M为Marker。
【具体实施方式】
[0030] 以下实施例中使用的材料如下：
[0031] 1、宿主菌：受体菌株DH5a和BL21。
[0032] 2、质粒：pUCm-T和pET_28a。
[0033] 实施例1 :鸡大肠杆菌外膜蛋白操纵子基因的PCR扩增
[0034] 1、引物设计与合成
[0035] 根据GenBank公布的鸡源外膜蛋白C基因全序列设计了一对引物P01，P02。P01， P02引物中分别含有BamHI和Hindlll酶切位点，引物序列如下：
[0036] P01:5'-CGCGGATCCAACATGAAAGTTAAAGTACTGTCCCTC-3'
[0037] BamHI
[0038] P02 :5,-CCCAAGCTTTTAGAACTGGTAAACCAGGCC-3,
[0039]Hindlll
[0040] 2、模版的制备
[0041] 将鸡大肠杆菌单菌株用LB培养基扩增培养，提取基因组，作为模板。
[0042] 3、PCR反应体系及扩增条件
[0043]PCR反应在 50iiL体系中进行，lOXBuffer5.OilL，dNTP4.OilL，P012.OilL， P022. 0iiL，DNA模板 1iiL，Taq酶 0? 5iiL，双蒸水 35. 5iiL。
[0044]混匀后按下列条件PCR扩增：94°C5min，94°Clmin，45°Clmin，72°C2min，共进行 30个循环，再72°C延伸10min，4°C保存。见图1外膜蛋白C基因的PCR扩增产物电泳，其 中，M泳道是核酸DNAMarker，L1为外膜蛋白CPCR扩增产物约llOObp。
[0045] 4、PCR产物的鉴定及纯化回收
[0046] (1)琼脂糖凝胶电泳
[0047] 用lXTAE(40mmol/LTris-乙酸，lmmol/LEDTA)缓冲液配成所需浓度的琼脂糖凝 胶溶液，微波炉加热使琼脂糖完全溶解之后，加DNA核酸染色剂，混匀后倒入根据需要选定 并封固好的电泳胶模中，凝胶厚度在3~5mm之间，插入宽度相当的梳子，梳子距底板大约 0. 5~1mm。待凝胶完全凝固后（约30~45min)，小心拔出梳子，拆去封条，将凝胶放入装 有1XTAE的电泳缓冲液的电泳槽中，使电泳缓冲液刚没过胶面（约1mm)。然后取适量待电 泳的DNA样品滴在Parafilm膜上与1/6体积的电泳上样缓冲液6XLoadingbuffer混匀， 用微量加样器将混合样品加到加样槽中，以5V/cm的电压电泳