专利名称：一种从大肠杆菌悬浮液中提取谷胱甘肽的方法
技术领域：
本发明属于生物化工领域，涉及一种从大肠杆菌悬浮液中提取、制备低蛋白质含量、高品质的谷胱甘肽的方法，属于谷胱甘肽制备技术领域。
背景技术：
谷胱甘肽，即是L -谷氨酰-L -半胱氨酰甘氨酸(缩写GSH)，是由L-谷氨酸、L -半胱氨酰和甘氨酸经肽键缩合而成的一种同时具有谷氨酰基和巯基的生物活性三肽化合物。谷胱甘肽有两种形式还原型GSH和氧化型GSSG，只有GSH才具有活性，而生物体内的GSSG需还原后才能发挥其重要的生理功能。还原型谷胱甘肽固体较为稳定，但其水溶液在空气中极易被氧化成氧化型谷胱甘肽GSSG。GSH在自然界中广泛分布于动物、植物和微生物细胞内。GSH在生物体内有着多种重要的生理功能，特别是对于维持生物体内适宜的 氧化还原环境起着至关重要的作用。GSH还具有独特的生理功能，被称为长寿因子和抗衰老因子。由于GSH在强化食品风味的同时对人体有保健作用，它的应用前景显然要优于其它类型的防腐剂或抗氧化剂。随着GSH的生理生化功能和性质被不断研究发现，GSH作为一种多功能的生物活性添加剂在食品加工业中的应用将会愈来愈广，GSH的需求量正日益增大。生物发酵法生产谷胱甘肽的方法不断得到改进，已经成为目前国内外生产谷胱甘肽最普遍的方法。但要从菌体发酵液中获得纯度很高的GSH，一直成为国内外研究的热点。到目前为止报道的分离提纯GSH的方法有铜盐法、离子交换、亲和层析、双水相分离等。铜盐法是一种比较传统的方法，有一定实用价值，目前仍然被一些GSH生产工艺所应用，但污染较大，工艺复杂，所以随着各项新的分离纯化技术的出现，必将逐渐被淘汰。由于氨基酸和多肽类物质为具有弱碱性和弱酸性官能团的两性化合物，因此采用阴阳离子交换树脂吸附、解吸的方法来使得氨基酸和肤类化合物和其他物质快速有效的分离。该方法经济效益较高，可望完全代替铜盐法。亲和层析方法是一种有效的分离纯化GSH的方法。一般而言含汞树脂对酸碱比较敏感，稳定性比较差，在工业应用上有一定的限制。近年来我国离子交换树脂工业发展迅速，国产离子交换树脂的价格相对于进口树脂价格大大降低，使得离子交换法在生化物质的分离方面的研究不断深入。离子交换法能够将带电情况不同的物质进行分离，广泛应用于天然活性成分的研究中。对于离子交换法，国内外对阳离子交换树脂的研究比较多，但大多GSH的回收率很低，只达到32. 9%—57. 6%，同时获得的产品纯度普遍较低。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术存在的不足，提供一种从大肠杆菌悬浮液中提取谷胱甘肽的方法，是利用生物发酵法在大肠杆菌中表达积累谷胱甘肽后，通过先进的分离纯化手段制备高品质、高含量的谷胱甘肽的方法，制备的产品以富含谷胱甘肽的作为高端食品添加剂存在。为解决上述技术问题，本发明所提供的技术方案是一种从大肠杆菌悬浮液中提取谷胱甘肽的方法，包括步骤如下
(I)用2±0· 5moIH2SO4调节大肠杆菌悬浮液的pH值为2-3，经过2. 5±0· 5MPa匀浆均质机破壁得破壁好的悬浮液，所述的破壁时间为45-60min ；
(2)将破壁好的悬浮液离心得到离心上清液，离心转速为5000土 lOOrpm，时间为10-15 min ；
(3)将离心上清液经阳离子交换树脂和阴离子交换树脂连续吸附与解吸，收集富含谷胱甘肽的高峰液；
(4)将谷胱甘肽高峰液进行低温浓缩成谷胱甘肽浓缩液，再将谷胱甘肽浓缩液冷冻干燥即得白色粉末状谷胱甘肽成品。
进一步在上述从大肠杆菌悬浮液中提取谷胱甘肽的方法中，所述步骤3的阳离子树脂交换是指将型号为DOOl阳离子交换树脂装柱，柱体积6CmX80Cm，将离心上清液直接上柱，其上柱时pH值为2-3，流速为100ml/min，上样直至饱和；用3_5倍柱体积的以盐酸调pH值为4的蒸馏水洗树脂柱，将杂质洗去，再用3-5倍柱体积的I. 5%HC1洗脱，其洗脱速度为100ml/min，洗脱收集DOOl阳离子高峰液。所述步骤3的阴离子树脂交换是指将型号为D293阴离子交换树脂装柱，柱体积6cmX80cm，将DOOl阳离子高峰液直接上柱，速度为100ml/min，收集富含谷胱甘肽的高峰液。所述步骤4的低温真空浓缩条件是真空度
O.9±0. IMPa，旋转速度130±20 rpm，温度55_60°C，浓缩至谷胱甘肽高峰液重量百分浓度的8-10倍，得谷胱甘肽浓缩液。所述步骤4的冷冻干燥条件是将谷胱甘肽在低温条件下经纳滤浓缩与真空低温浓缩后的浓缩液在_72±5°C下干燥28±2h，即得白色粉末状谷胱甘妝成品。与现有技术相比，本发明从谷胱甘肽大肠杆菌的悬浮液中提取GSH的过程分为提取和浓缩两个部分，提取为从含有谷胱甘肽的大肠杆菌中，通过菌体破壁抽提，悬浮液的固液分离，得到含有谷胱甘肽的上清液，经过离子交换树脂技术、代温纳滤浓缩、真空低温浓缩、冷冻干燥得到GSH。用2molH2S04调节pH值，经过高压匀质器破壁，高速离心得到含有的谷胱甘肽的上清液。采用在破壁前调节pH值，不仅有利于GSH的稳定，而且可以使大分子蛋白质变性沉淀，除去大部分蛋白质。阳阴离子交换技术去除大分子杂质和脂类色素物质，最终达到从悬浮液中分离、纯化、浓缩谷胱甘肽的操作工序，有效的去除菌体细胞碎片、大分子蛋白、有色物质，尤其是离子交换技术适合大规模的工业化生产。该法操作简单、高效、费用低廉、成品纯度较高、环境污染小、易于工业化。制得GSH产品的纯度为95%以上、蛋白质含量为I. 3%、提取收率为86. 5%的谷胱甘肽成品。
具体实施例方式为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明作进一步介绍，但需要说明的是，本发明所要求的保护的范围并不局限于实施例所表述的范围。实施例I
发酵培养得到的谷胱甘肽大肠杆菌悬浮液，成份分析结果菌体275g/L;GSH含量
3.95 g/L。将上述30L悬浮液用2 mo I/L硫酸调节pH至2_3范围内，经过高压匀质器破壁45-60min，将破碎好的悬浮液，经高速冷冻离心机分离，条件5°C -10°C，5000rpm，15min。得到离心上清液12L，取12L上清液直接上DOOl阳离子交换树脂柱，柱体积为6mX80cm，流速为100ml/min，上样直至饱和；用3_5倍柱体积的pH 4. O的PBS缓冲液洗树脂柱，将杂质洗去，再用3-5倍柱体积的I. 5% HCl洗脱，其洗脱速度为100ml/min，洗脱收集富含DOOl阳离子高峰液。再将DOOl阳离子高峰液直接上D293阴离子交换树脂柱，速度为100ml/min，收集富含谷胱甘肽的脱色高峰。此时GSH回收率为93. 1，蛋白质去除率为78%。将上述经吸附柱浓缩后的谷胱甘肽浓缩液进行真空浓缩，按照下列条件进行真空度O. 9MPa，旋转速度130 rpm，温度35V -60°C浓缩至8倍。将谷胱甘肽浓缩液进行冷冻干燥，于_72°C下干燥28 h后得到白色粉末状谷胱甘肽成品。此时谷胱甘肽的纯含量为102. 52 g，提取收率为86. 5%。谷胱甘肽呈白色粉末状物质，具有良好的感官品质。对比实施例I
改变破壁pH。在破壁前不用硫酸所调pH值，其它操作同实施例I 一样操作。 结果谷肤甘肽的纯含量为36. 85g，提取收率为31. 1%
对比实施例2
改变所用的洗脱剂，将I. 5%的HCl改为采用I. 5%NaCl为洗脱剂。其他操作同实施例I。结果提取收率为72. 4%，蛋白质去除率40. 6%
对比实施例3
阳离子交换树脂前不用调节PH值，其他操作同实施例1，结果离交后因杂质太多，无法离交高峰的纯度明显下降，纯含量只有38. 32%。对比实施例4
依照实施例I方法，将谷胱甘肽低温浓缩液进行真空干燥，最终得到谷胱甘肽26. 43g，提取收率为22. 3%。对比实施例5
对比其他的干燥方式，冻干的损失率最低，真空烘干损失率69. 3% ;鼓风烘干损失率87. 7%。通过上述对比说明，本发明操作简单、高效、费用低廉、成品纯度较高、环境污染小、易于工业化。
权利要求
1.一种从大肠杆菌悬浮液中提取谷胱甘肽的方法，其特征步骤如下 (1)用2±0·5moIH2SO4调节大肠杆菌悬浮液的pH值为2-3，经过2. 5±0· 5MPa匀浆均质机破壁得破壁好的悬浮液，所述的破壁时间为45-60min ； (2)将破壁好的悬浮液离心得到离心上清液，离心转速为5000±100rpm，时间为10-15min ； (3)将离心上清液经阳离子交换树脂和阴离子交换树脂连续吸附与解吸，收集富含谷胱甘肽的高峰液； (4)将谷胱甘肽高峰液进行低温浓缩成谷胱甘肽浓缩液，再将谷胱甘肽浓缩液冷冻干燥即得白色粉末状谷胱甘肽成品。
2.根据权利要求I所述的从大肠杆菌悬浮液中提取谷胱甘肽的方法，其特征在于所述步骤3的阳离子交换树脂是指将型号为DOOl阳离子交换树脂装柱，柱体积6cmX80cm，将离心上清液直接上柱，其上柱时pH值为2-3，流速为100ml/min，上样直至饱和；用3_5倍柱体积的PH值为4. O的PBS缓冲液洗树脂柱，将杂质洗去，再用3-5倍柱体积的I. 5%HC1洗脱，其洗脱速度为100ml/min，洗脱收集DOOl阳离子高峰液。
3.根据权利要求I所述的从大肠杆菌悬浮液中提取谷胱甘肽的方法，其特征在于所述步骤3的阴离子交换树脂是指将型号为D293阴离子交换树脂装柱，柱体积6cmX80cm，将DOOl阳离子高峰液直接上柱，速度为100ml/min，收集富含谷胱甘肽的高峰液。
4.根据权利要求I所述的从大肠杆菌悬浮液中提取谷胱甘肽的方法，其特征在于所述步骤4的低温真空浓缩条件是真空度O. 9±0. IMPa,旋转速度130±20 rpm,温度350C _60°C，浓缩至谷胱甘肽高峰液重量百分浓度的8-10倍，得谷胱甘肽浓缩液。
5.根据权利要求I所述的从大肠杆菌悬浮液中提取谷胱甘肽的方法，其特征在于所述步骤4的冷冻干燥条件是将谷胱甘肽超浓缩液在-72±5°C下干燥28±2h，即得白色粉末状谷胱甘肽成品。
全文摘要
本发明公开了一种从大肠杆菌中提取谷胱甘肽的方法，是通过调节大肠杆菌悬浮液的pH值、高压匀质破壁、离心分离得到上清液，再使用离子交换树脂去除大分子杂质和脂类色素，将离子交换纯化液低温浓缩后，冷冻干燥最终达到从大肠杆菌中分离纯化还原型谷胱甘肽成品。制得谷胱甘肽成品GSH产品的纯度95%以上、蛋白质含量为1.3%、提取收率为86.5%。
文档编号C07K1/18GK102942615SQ20121041192
公开日2013年2月27日 申请日期2012年10月25日 优先权日2012年10月25日
发明者朱义福, 吴平刚, 周新荣 申请人:广东肇庆星湖生物科技股份有限公司