来自脑膜炎/脓毒症相关性大肠杆菌的蛋白质和核酸的制作方法

专利名称：来自脑膜炎/脓毒症相关性大肠杆菌的蛋白质和核酸的制作方法
技术领域：
本发明属于大肠杆菌(E.coli)生物学领域，具体涉及能引起对肠外病原性大肠杆菌(ExPEC)菌株产生免疫的免疫原。

背景技术：
很少有微生物具有如大肠杆菌般的多用途。同时作为哺乳动物正常肠道微生物区系的重要成员，其已被广泛用作重组DNA技术的宿主。然而，大肠杆菌也可能成为致命病原体。
大肠杆菌菌株通常被分为共生性或病原性，病原性菌株再分成肠内或肠外菌株。也可根据‘K’抗原分类。研究得最透彻的‘K’抗原是‘K1’，认为它是引起新生儿脑膜炎的大肠杆菌菌株中毒力的主要决定因素。K1抗原是α-2，8-连接的唾液酸的均聚物，如脑膜炎球菌血清组B的荚膜糖。更新的分类技术如多基因座酶电泳法(MLEE)将大肠杆菌分为5类系统发生组(A、B1、B2、D和E)，这些分组与传统的分类不匹配。例如MLEE B1组包括共生性和病原性菌株，D组包括肠内和肠外菌株。
大肠杆菌的肠外病原性菌株(或’ExPEC’菌株[1])属于MLEE B2组和D组，包括尿路病原性(UPEC)菌株和脑膜炎/脓毒症相关性(MNEC)菌株。UPEC菌株引起尿路感染(UTI)，为膀胱炎的常见原因。它们还引起肾盂肾炎(及其并发症如脓毒症)和尿导管相关感染。MNEC菌株引起病例致死率范围在25％-40％的新生儿脑膜炎(每1000个活新生儿中出现0.1例)，还引起大约1/6的脓毒症病例。
最早的ExPEC疫苗基于细胞裂解物或细胞结构。SOLCOUROVACTM包括10种不同的热杀细菌，包括6种ExPEC菌株，参考文献2中报道了成功的II期临床实验。URO-VAXOMTM是一种含有18种选择的大肠杆菌菌株的冻干细菌裂解物的口服片剂疫苗[3]。Baxter Vaccines研制出一种基于6-10种不同菌株来源的菌毛的UTI疫苗，但该产品已被放弃。MedImmune研制出的一种基于FimH粘附素复合物的名为MEDI516的产品显示效力不够。而且，这种疫苗存在影响正常肠道菌丛中的非病原性FimH+ve菌株的风险，同时，由于其膀胱特异性粘附机制，预计这种疫苗仅对UPEC菌株有效，而其它ExPEC菌株不受它的控制。
因此，需要一种改良的ExPEC疫苗，这包括需要从天然细胞裂解物转移到更明确的分子，以及需要鉴定适于包含入疫苗的其它抗原，尤其是那些在临床ExPEC菌株中很普遍、而在共生性菌株中不存在的抗原。在ExPEC群体中，特别需要鉴定出适用于引起对MNEC菌株产生免疫的抗原。
参考文献5报道了满足上述需要的一种方法，其发明人寻找在MLEE B2类型和D类型的基因组中存在但在MLEE A类型和B1类型中不存在的基因。基于扣除杂交的其它比较方法参见参考文献6和7。参考文献8中也鉴定了ExPEC菌株的毒力基因。参考文献9分析了UPEC大肠杆菌菌株536中的四个毒力岛(pathogenicity island)。
参考文献10采用UPEC(O6K2H1)菌株CFT073的基因组序列[11，12]来鉴定在非病原性大肠杆菌菌株中不存在的序列。参考文献13比较了大肠杆菌人肾盂肾炎分离物536(O6K15H31)(一种UPEC)的基因组序列与菌株CFT073(UPEC)、EDL933(肠出血性)和MG1655(非病原性实验菌株)的序列数据。病原性菌株的基因组序列获自数据库中的登录号AE005174、BA000007和NC-004431。非病原性菌株的序列获自登录号U00096。
本发明的目的是提供用于引起对病原性大肠杆菌菌株、具体是ExPEC菌株、更具体是MNEC菌株产生免疫的其它抗原。
发明概述 本发明者从引起新生儿脑膜炎(MNEC)的大肠杆菌中鉴定了各种开放阅读框，并且鉴定了在制备能引起对MNEC感染产生免疫的组合物中特别感兴趣的它们的子集。
本发明一方面涉及一种多肽，其包含(a)选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO706、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、408、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440、442、444、446、448、450、452、454、456、458、460、462、464、466、468、470、472、474、476、478、480、482、484、486、488、490、492、494、496、498、500、502、504、506、508、510、512、514、516、518、520、522、524、526、528、530、532、534、536、538、540、542、544、546、548、550、552、554、556、558、560、562、564、566、568、570、572、574、576、578、580、582、584、586、588、590、592、594、596、598、600、602、604、606、608、610、612、614、616、618、620、622、624、626、628、630、632、634、636、638、640、642、644、646、648、650、652、654、656、658、660、662、664、666、668、670、672、674、676、678、680、682、684、686、688、690、692、694、696、698、700、702、704、708、710、712、714、716、718、720、722、724、726、728、730、732、734、736、738、740、742、744、746、748、750、752、754、756、758、760、762、764、766、768、770、772、774、776、778、780、782、784、786、788、790、792、794、796、798、800、802、804、806、808、810、812、814、816、818、820、822、824、826、828、830、832、834、836、838、840、842、844、846、848、850、852、854、856、858、860、862、864、866、868、870、872、874、876、878、880、882、884、886、888、890、892、894、896、898、900、902、904、906、908、910、912、914、916、918、920、922、924、926、928、930、932、934、936、938、940、942、944、946、948、950、952、954、956、958、960、962、964、966、968、970、972、974、976、978、980、982、984、986、988、990、992、994、996、998、1000、1002、1004、1006、1008、1010、1012、1014、1016、1018、1020、1022、1024、1026、1028、1030、1032、1034、1036、1038、1040、1042、1044、1046、1048、1050、1052、1054、1056、1058、1060、1062、1064、1066、1068、1070、1072、1074、1076、1078、1080、1082、1084、1086、1088、1090、1092、1094、1096、1098、1100、1102、1104、1106、1108、1110、1112、1114、1116、1118、1120、1122、1124、1126、1128、1130、1132、1134、1136、1138、1140、1142、1144、1146、1148、1150、1152、1154、1156、1158、1160、1162、1164、1166、1168、1170、1172、1174、1176、1178、1180、1182、1184、1186、1188、1190、1192、1194、1196、1198、1200、1202、1204、1206、1208、1210、1212、1214、1216、1218、1220、1222、1224、1226、1228、1230、1232、1234、1236、1238、1240、1242、1244、1246、1248、1250、1252、1254、1256、1258、1260、1262、1264、1266、1268、1270、1272、1274、1276、1278、1280、1282、1284、1286、1288、1290、1292、1294、1296、1298、1300、1302、1304、1306、1308、1310、1312、1314、1316、1318、1320、1322、1324、1326、1328、1330、1332、1334、1336、1338、1340、1342、1344、1346、1348、1350、1352、1354、1356、1358、1360、1362、1364、1366、1368、1370、1372、1374、1376、1378、1380、1382、1384、1386、1388、1390、1392、1394、1396、1398、1400、1402、1404、1406、1408、1410、1412、1414、1416、1418、1420、1422、1424、1426、1428、1430、1432、1434、1436、1438、1440、1442、1444、1446、1448、1450、1452、1454、1456、1458、1460、1462、1464、1466、1468、1470、1472、1474、1476、1478、1480、1482、1484、1486、1488、1490、1492、1494、1496、1498、1500、1502、1504、1506、1508、1510、1512、1514、1516、1518、1520、1522、1524、1526、1528、1530、1532、1534、1536、1538、1540、1542、1544、1546、1548、1550、1552、1554、1556、1558、1560、1562、1564、1566、1568、1570、1572、1574、1576、1578、1580、1582、1584、1586、1588、1590、1592、1594、1596、1598、1600、1602、1604、1606、1608、1610、1612、1614、1616、1618、1620、1622、1624、1626、1628、1630、1632、1634、1636、1638、1640、1642、1644、1646、1648、1650、1652、1654、1656、1658、1660、1662、1664、1666、1668、1670、1672、1674、1676、1678、1680、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1706、1708、1710、1712、1714、1716、1718、1720、1722、1724、1726、1728、1730、1732、1734、1736、1738、1740、1742、1744、1746、1748、1750、1752、1754、1756、1758、1760、1762、1764、1766、1768、1770、1772、1774、1776、1778、1780、1782、1784、1786、1788、1790、1792、1794、1796、1798、1800、1802、1804、1806、1808、1810、1812、1814、1816、1818、1820、1822、1824、1826、1828、1830、1832、1834、1836、1838、1840、1842、1844、1846、1848、1850、1852、1854、1856、1858、1860、1862、1864、1866、1868、1870、1872、1874、1876、1878、1880、1882、1884、1886、1888、1890、1892、1894、1896、1898、1900、1902、1904、1906、1908、1910、1912、1914、1916、1918、1920、1922、1924、1926、1928、1930、1932、1934、1936、1938、1940、1942、1944、1946、1948、1950、1952、1954、1956、1958、1960、1962、1964、1966、1968、1970、1972、1974、1976、1978、1980、1982、1984、1986、1988、1990、1992、1994、1996、1998、2000、2002、2004、2006、2008、2010、2012、2014、2016、2018、2020、2022、2024、2026、2028、2030、2032、2034、2036、2038、2040、2042、2044、2046、2048、2050、2052、2054、2056、2058、2060、2062、2064、2066、2068、2070、2072、2074、2076、2078、2080、2082、2084、2086、2088、2090、2092、2094、2096、2098、2100、2102、2104、2106、2108、2110、2112、2114、2116、2118、2120、2122、2124、2126、2128、2130、2132、2134、2136、2138、2140、2142、2144、2146、2148、2150、2152、2154、2156、2158、2160、2162、2164、2166、2168、2170、2172、2174、2176、2178、2180、2182、2184、2186、2188、2190、2192、2194、2196、2198、2200、2202、2204、2206、2208、2210、2212、2214、2216、2218、2220、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中，本发明这方面的多肽包含含有至少一个(a)的B细胞表位的片段。
在第二个方面，本发明涉及一种多肽，其包含(a)选自下组的氨基酸序列SEQID NO 512、2454、2456、2678、2692、4596、4748、7004、7052、8168、4628和5700；(b)与氨基酸序列(a)的序列相同性至少为80％的氨基酸序列；(c)作为氨基酸序列(a)中至少10个连续氨基酸的片段的氨基酸序列；或(d)与氨基酸序列(a)的序列相同性至少为80％并包含氨基酸序列(a)中至少10个连续氨基酸的片段的氨基酸序列。在一个具体实施方式
中，本发明这方面的多肽包含含有至少一个(a)的B细胞表位的片段。
另一方面，本发明涉及一种多肽，其包含(a)选自下组的氨基酸序列SEQ IDNO 8564、2728、9872、4672、5680、534、3222、3226和7004；(b)与氨基酸序列(a)的序列相同性至少为80％的氨基酸序列；(c)作为氨基酸序列(a)中至少10个连续氨基酸的片段的氨基酸序列；或(d)与氨基酸序列(a)的序列相同性至少为80％并包含氨基酸序列(a)中至少10个连续氨基酸的片段的氨基酸序列。在一个具体实施方式
中，本发明这方面的多肽包含含有至少一个(a)的B细胞表位的片段。
本发明也涉及一种核酸，其包含(a)选自下组的核苷酸序列SEQ ID NO 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223、8225、8227、8229、8231、8233、8235、8237、8239、8241、8243、8245、8247、8249、8251、8253、8255、8257、8259、8261、8263、8265、8267、8269、8271、8273、8275、8277、8279、8281、8283、8285、8287、8289、8291、8293、8295、8297、8299、8301、8303、8305、8307、8309、8311、8313、8315、8317、8319、8321、8323、8325、8327、8329、8331、8333、8335、8337、8339、8341、8343、8345、8347、8349、8351、8353、8355、8357、8359、8361、8363、8365、8367、8369、8371、8373、8375、8377、8379、8381、8383、8385、8387、8389、8391、8393、8395、8397、8399、8401、8403、8405、8407、8409、8411、8413、8415、8417、8419、8421、8423、8425、8427、8429、8431、8433、8435、8437、8439、8441、8443、8445、8447、8449、8451、8453、8455、8457、8459、8461、8463、8465、8467、8469、8471、8473、8475、8477、8479、8481、8483、8485、8487、8489、8491、8493、8495、8497、8499、8501、8503、8505、8507、8509、8511、8513、8515、8517、8519、8521、8523、8525、8527、8529、8531、8533、8535、8537、8539、8541、8543、8545、8547、8549、8551、8553、8555、8557、8559、8561、8563、8565、8567、8569、8571、8573、8575、8577、8579、8581、8583、8585、8587、8589、8591、8593、8595、8597、8599、8601、8603、8605、8607、8609、8611、8613、8615、8617、8619、8621、8623、8625、8627、8629、8631、8633、8635、8637、8639、8641、8643、8645、8647、8649、8651、8653、8655、8657、8659、8661、8663、8665、8667、8669、8671、8673、8675、8677、8679、8681、8683、8685、8687、8689、8691、8693、8695、8697、8699、8701、8703、8705、8707、8709、8711、8713、8715、8717、8719、8721、8723、8725、8727、8729、8731、8733、8735、8737、8739、8741、8743、8745、8747、8749、8751、8753、8755、8757、8759、8761、8763、8765、8767、8769、8771、8773、8775、8777、8779、8781、8783、8785、8787、8789、8791、8793、8795、8797、8799、8801、8803、8805、8807、8809、8811、8813、8815、8817、8819、8821、8823、8825、8827、8829、8831、8833、8835、8837、8839、8841、8843、8845、8847、8849、8851、8853、8855、8857、8859、8861、8863、8865、8867、8869、8871、8873、8875、8877、8879、8881、8883、8885、8887、8889、8891、8893、8895、8897、8899、8901、8903、8905、8907、8909、8911、8913、8915、8917、8919、8921、8923、8925、8927、8929、8931、8933、8935、8937、8939、8941、8943、8945、8947、8949、8951、8953、8955、8957、8959、8961、8963、8965、8967、8969、8971、8973、8975、8977、8979、8981、8983、8985、8987、8989、8991、8993、8995、8997、8999、9001、9003、9005、9007、9009、9011、9013、9015、9017、9019、9021、9023、9025、9027、9029、9031、9033、9035、9037、9039、9041、9043、9045、9047、9049、9051、9053、9055、9057、9059、9061、9063、9065、9067、9069、9071、9073、9075、9077、9079、9081、9083、9085、9087、9089、9091、9093、9095、9097、9099、9101、9103、9105、9107、9109、9111、9113、9115、9117、9119、9121、9123、9125、9127、9129、9131、9133、9135、9137、9139、9141、9143、9145、9147、9149、9151、9153、9155、9157、9159、9161、9163、9165、9167、9169、9171、9173、9175、9177、9179、9181、9183、9185、9187、9189、9191、9193、9195、9197、9199、9201、9203、9205、9207、9209、9211、9213、9215、9217、9219、9221、9223、9225、9227、9229、9231、9233、9235、9237、9239、9241、9243、9245、9247、9249、9251、9253、9255、9257、9259、9261、9263、9265、9267、9269、9271、9273、9275、9277、9279、9281、9283、9285、9287、9289、9291、9293、9295、9297、9299、9301、9303、9305、9307、9309、9311、9313、9315、9317、9319、9321、9323、9325、9327、9329、9331、9333、9335、9337、9339、9341、9343、9345、9347、9349、9351、9353、9355、9357、9359、9361、9363、9365、9367、9369、9371、9373、9375、9377、9379、9381、9383、9385、9387、9389、9391、9393、9395、9397、9399、9401、9403、9405、9407、9409、9411、9413、9415、9417、9419、9421、9423、9425、9427、9429、9431、9433、9435、9437、9439、9441、9443、9445、9447、9449、9451、9453、9455、9457、9459、9461、9463、9465、9467、9469、9471、9473、9475、9477、9479、9481、9483、9485、9487、9489、9491、9493、9495、9497、9499、9501、9503、9505、9507、9509、9511、9513、9515、9517、9519、9521、9523、9525、9527、9529、9531、9533、9535、9537、9539、9541、9543、9545、9547、9549、9551、9553、9555、9557、9559、9561、9563、9565、9567、9569、9571、9573、9575、9577、9579、9581、9583、9585、9587、9589、9591、9593、9595、9597、9599、9601、9603、9605、9607、9609、9611、9613、9615、9617、9619、9621、9623、9625、9627、9629、9631、9633、9635、9637、9639、9641、9643、9645、9647、9649、9651、9653、9655、9657、9659、9661、9663、9665、9667、9669、9671、9673、9675、9677、9679、9681、9683、9685、9687、9689、9691、9693、9695、9697、9699、9701、9703、9705、9707、9709、9711、9713、9715、9717、9719、9721、9723、9725、9727、9729、9731、9733、9735、9737、9739、9741、9743、9745、9747、9749、9751、9753、9755、9757、9759、9761、9763、9765、9767、9769、9771、9773、9775、9777、9779、9781、9783、9785、9787、9789、9791、9793、9795、9797、9799、9801、9803、9805、9807、9809、9811、9813、9815、9817、9819、9821、9823、9825、9827、9829、9831、9833、9835、9837、9839、9841、9843、9845、9847、9849、9851、9853、9855、9857、9859、9861、9863、9865、9867、9869、9871、9873、9875、9877、9879、9881、9883、9885、9887、9889、9891、9893、9895、9897、9899、9901、9903、9905、9907、9909、9911、9913、9915、9917、9919、9921、9923、9925、9927、9929、9931、9933、9935、9937、9939、9941、9943、9945、9947、9949、9951、9953、9955、9957、9959、9961、9963、9965、9967、9969、9971、9973、9975、9977、9979、9981、9983、9985、9987、9989；(b)与氨基酸序列(a)的序列相同性至少为80％的核苷酸序列；(c)作为来自核苷酸序列(a)的至少10个连续核苷酸的片段的核苷酸序列；或(d)与核苷酸序列(a)的序列相同性至少为80％、并包含核苷酸序列(a)的至少10个连续核苷酸的片段的核苷酸序列。
另一方面，本发明涉及一种核酸，其包含(a)选自下组的核苷酸序列SEQ IDNO 511、2453、2455、2677、2691、4595、4747、7003、7051、8167、4627和5699；(b)与氨基酸序列(a)的序列相同性至少为80％的核苷酸序列；(c)作为来自核苷酸序列(a)的至少10个连续核苷酸的片段的核苷酸序列；或(d)与核苷酸序列(a)的序列相同性至少为80％、并包含核苷酸序列(a)的至少10个连续核苷酸的片段的核苷酸序列。
另一方面，本发明涉及一种核酸，其包含(a)选自下组的核苷酸序列SEQ IDNO 8563、2727、9871、4671、5679、533、3221、3225和7003，(b)与氨基酸序列(a)的序列相同性至少为80％的核苷酸序列；(c)作为来自核苷酸序列(a)的至少10个连续核苷酸的片段的核苷酸序列；或(d)与核苷酸序列(a)的序列相同性至少为80％、并包含核苷酸序列(a)的至少10个连续核苷酸的片段的核苷酸序列。
本发明也涉及编码本发明多肽的本发明核酸，还涉及本发明多肽的特异性单克隆抗体。
本发明多肽、核酸和抗体可用于药物和用于制造在患者中产生免疫应答的药物。
本发明也涉及含有与药学上可接受的载体混合的本发明多肽、核酸或抗体的药物组合物。本发明还涉及含有与药学上可接受的载体混合的两种或多种本发明多肽的药物组合物。在一个具体实施方式
中，本发明药物组合物还含有疫苗佐剂。本发明还涉及含有表达或过度表达下组编码的一种或多种多肽的一种或多种外膜泡(OMV)的免疫原性组合物(a)选自下组的核苷酸序列SEQ ID NO 511、2453、2455、2677、2691、4595、4747、7003、7051、8167、4627和5699；(b)与氨基酸序列(a)的序列相同性至少为80％的核苷酸序列；(c)作为来自核苷酸序列(a)的至少10个连续核苷酸的片段的核苷酸序列；或(d)与核苷酸序列(a)的序列相同性至少为80％、并包含核苷酸序列(a)的至少10个连续核苷酸的片段的核苷酸序列。
本发明也涉及含有表达或过度表达下组编码的一种或多种多肽的一种或多种OMV的免疫原性组合物(a)选自下组的核苷酸序列SEQ ID NO 8563、2727、9871、4671、5679、533、3221、3225和7003；(b)与氨基酸序列(a)的序列相同性至少为80％的核苷酸序列；(c)作为来自核苷酸序列(a)的至少10个连续核苷酸的片段的核苷酸序列；或(d)与核苷酸序列(a)的序列相同性至少为80％、并包含核苷酸序列(a)的至少10个连续核苷酸的片段的核苷酸序列。
本发明也涉及在患者中产生免疫应答的方法，所述方法包括给予所述患者本发明药物组合物或免疫原性组合物的步骤。在一个具体实施方式
中，所述免疫反应是保护性抵抗ExPEC感染，具体抵抗MNEC感染。本发明的其它方面描述如下。
附图简要说明

图1显示了用热灭活IHE3034或对照(′fisiol′)免疫后，用IHE3034刺激后随时间变化的小鼠存活率％，以及24小时后的菌血症水平(cfu/ml)。
图2显示了用热灭活细菌(上图)或ΔtolR突变体的小泡(下图)免疫后，用IHE3034刺激后的小鼠存活率％。从IHE3034菌株或对照菌株(DH5)制备免疫原。
图3显示了用IroN或对照(上图)和血清抗-IroN Ig效价(下图)免疫后，用IHE3034刺激后的小鼠存活率％。
图4类似于图3，但采用IbeA而非IroN。
发明详述 本发明者从K1/B2 MNEC菌株鉴定了4995种开放阅读框，并鉴定了在制备抵抗MNEC菌株的免疫原性组合物中特别感兴趣的它们的子集。
多肽 本发明提供了含有实施例中所述氨基酸序列的多肽。这些序列是序列表SEQ IDNO 2-9990中偶数编号的序列。
SEQ ID NO 2-9990中的优选氨基酸序列见表2。其它优选氨基酸序列是现有技术中未鉴定的序列，如参考文献5、6、7、8、9、10、11和13中未鉴定的序列。
本发明也提供了核酸序列SEQ ID NO 9991-10273中任一种或SEQ ID NO10274内编码的多肽。核酸中的编码序列优选开始于起始密码子，终止于终止密码子。优选的多肽是现有技术中未鉴定的序列，如参考文献5、6、8、10和11中未鉴定的序列。
本发明还提供包含与实施例中公开的氨基酸序列具有序列相同性的氨基酸序列的多肽。相似地，本发明提供了含有与SEQ ID NO 9991-10273或SEQ ID NO10274内编码的氨基酸序列有序列相同性的氨基酸序列的多肽。针对特定序列，序列相同性程度优选大于50％(如60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)。这些多肽包括同源物、直向同源物、等位基因变体和突变体。一般地，两种多肽序列之间相同性为50％或更高被认为是功能等效的标志。优选用MPSRCH程序(Oxford Molecular)中运行的Smith-Waterman同源性检索算法来确定多肽间的相同性，其采用带有参数缺口开放罚分＝12和缺口延伸罚分＝1的仿射缺口检索来进行。
与实施例的序列相比，这些多肽可包含一个或多个(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等)保守的氨基酸取代，即用具有相关侧链的另一种氨基酸取代原有氨基酸。遗传编码氨基酸通常分成4种家族(1)酸性，即天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性，即赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性，即丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不带电荷的极性氨基酸，即甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。有时将苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸一起称为芳族氨基酸。通常，这些家族中的单个氨基酸的替换不会对生物活性产生重要影响。而且，相对于参比序列，所述多肽可以有一个或多个(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等)单个氨基酸的缺失。而且，相对于参比序列，所述多肽可包含一个或多个(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等)插入(如1、2、3、4或5个氨基酸)。
优选的多肽包含那些脂质化的、位于外膜中的、位于内膜中的、或位于周质中的多肽。尤其优选的多肽是同时属于这些范畴中1种以上的多肽，如位于外膜中的脂质化多肽。翻译后加工信号肽后脂蛋白的N端半胱氨酸共价连接于脂质。
可以进行脂质化的多肽包括SEQ ID NO620、630、660、724、946、1196、1304、1510、1530、1548、1600、1700、1958、2030、2396、2610、3040、3364、3414、3422、3554、3678、3824、4072、4116、4178、4240、4374、4412、4462、4576、4664、4856、5178、5286、5362、5662、5682、5984、6018、6132、6256、6286、6532、6714、6754、6764、6790、6938、7144、7442、7674、7872、8278、8498、8564、8782、8784、9276和9580。SEQ ID NO 5662(ORF02831)和8564(ORF04282)是优选的脂蛋白。
优选的多肽见表2。
本发明还提供包含实施例中公开的氨基酸序列的片段的多肽。相似地，本发明提供了含有SEQ ID NO 9991-10273或SEQ ID NO10274内编码的氨基酸序列的片段的多肽。所述片段包含该序列中至少n个连续氨基酸，针对特定序列，n为7或更大(如8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100或更大)。所述片段可包含该序列的至少一个T细胞表位，或优选地，B细胞表位。T细胞表位和B细胞表位可凭经验鉴定(如采用PEPSCAN[14、15]或类似方法)或预测(如采用Jameson-Wolf抗原性指数[16]、矩阵基方法[17]、TEPITOPE[18]、神经网络[19]、OptiMer&EpiMer[20、21]、ADEPT[22]、Tsites[23]、亲水性[24]、抗原性指数[25]或参考文献26公开的方法等)。其它优选片段为(a)本发明多肽的N端信号肽、(b)不具有N端信号肽的本发明多肽、(c)不具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个N端氨基酸残基的本发明多肽。
其它优选的片段为以可能的起始密码子(ATG、GTG、TTG)编码的氨基酸开始的那些片段。从所示起始密码子下游的起始密码子编码的甲硫氨酸处开始的片段为本发明多肽。
其它优选的片段为那些与本发明多肽以及与由参考文献5、6、8、10和11中的任一篇鉴定的多肽相同的片段。
本发明多肽可以许多方式制备，如化学合成(全部或部分)、用蛋白酶消化较长多肽、对RNA进行翻译、从细胞培养物(如重组表达的细胞培养物)或生物体本身(如经过细菌培养或直接来自患者的生物体)进行纯化等。制备长度＜40个氨基酸的多肽的优选方法包括体外化学合成[27、28]。尤其优选固相的肽合成，如基于tBoc或Fmoc[29]化学的方法。也可部分或全部采用酶合成[30]。作为对化学合成的替代方法，还可采用生物合成，例如可以通过翻译来制备多肽。这可在体外或体内进行。生物学方法通常限于制备L氨基酸多肽，然而操控翻译机器(如氨酰基tRNA分子)可用于引入D氨基酸(或其它非天然氨基酸，如碘化酪氨酸或甲基苯丙氨酸、叠氮高丙氨酸等)[31]。然而，含有D氨基酸时，优选采用化学合成方法。可在C末端和/或N末端对本发明多肽进行共价修饰。
本发明多肽可采取各种形式(如天然、融合、糖基化、非糖基化、脂质化、非脂质化、磷酸化、非磷酸化、十四烷基化、非十四烷基化、单体、多聚体、颗粒、变性等)。
优选提供纯化或基本纯化形式，即基本上不含其它多肽(如不含天然产生的多肽)，尤其是不含其它ExPEC或宿主细胞多肽的本发明多肽，通常至少约50％纯(重量)，通常至少约90％纯，即其它表达多肽占该组合物的约50％以下，更优选约10％以下(如5％或更少)。本发明多肽优选为ExPEC多肽，更优选MNEC多肽。
本发明多肽可连接于固相载体。本发明多肽可包含检测标记(如放射性或荧光标记或生物素标记)。
术语“多肽”指任何长度的氨基酸聚合物。所述聚合物可以是直链或支链，它可包含修饰氨基酸，并且可被非氨基酸所中断。所述术语还涵盖经天然修饰或介入(intervention)修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其它操控或修饰，如与标记组分偶联。该定义还包括(例如)含有一个或多个氨基酸类似物(包括(如)非天然氨基酸等)以及其它本领域公知修饰的多肽。多肽可以单链或结合链的形式存在。本发明多肽可以是天然或人工糖基化的多肽(即所述多肽的糖基化模式与在相应的天然产生多肽中发现的糖基化模式不同)。
本发明多肽的长度可以是至少40个氨基酸(如至少40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、350、400、450、500或更多)。本发明多肽可短于500个氨基酸(如不超过40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、350、400或450个氨基酸)。
本发明提供的多肽包含序列-X-Y-或-Y-X-，其中-X-为上述定义的氨基酸序列，-Y-并非上述定义的序列，即本发明提供融合蛋白。当多肽编码序列的N末端密码子并非ATG时，所述密码子将会按照该密码子的标准氨基酸进行翻译而不是翻译成Met，这种情况发生在该密码子翻译成起始密码子时。
本发明提供一种制备本发明多肽的方法，包括在诱导多肽表达的条件下培养本发明的宿主细胞的步骤。
本发明提供一种制备本发明多肽的方法，其中所述多肽部分或完全用化学方法合成。
本发明提供一种含有两种或多种(如2、3、4、5、6或更多种)本发明多肽的组合物。可选择不同多肽，以使它们参与不同的细菌代谢和/或信号转导途径，如从2、3、4、5、6或更多种以下分类中选择粘附素；自体转运蛋白；毒素；摄铁蛋白(ironacquisitions protein)；和膜结合蛋白，具体包括完整的外膜蛋白。这种抗原组合可靶向对抗细菌生活周期的不同方面的免疫应答，产生更有效的免疫应答。
本发明还提供一种以通式NH2-A-[-X-L-]n-B-COOH表示的杂交多肽，其中X为上述定义的本发明多肽，L为任选的接头氨基酸序列，A为任选的N末端氨基酸序列，B为任选的C末端氨基酸序列，n为大于1的整数。n值在2和x之间，x值一般为3、4、5、6、7、8、9或10。优选地，n为2、3或4；更优选地为2或3；最优选地，n＝2。在每种n的例子中，-X-可以相同或不同。在[-X-L-]的每种n的例子中，接头氨基酸序列-L-可有或无。例如，当n＝2时，该杂交体可以是NH2-X1-L1-X2-L2-COOH、NH2-X1-X2-COOH、NH2-X1-L1-X2-COOH、NH2-X1-X2-L2-COOH等。接头氨基酸序列-L-一般为短序列(如20个或更少氨基酸，即19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个)。例子包括有助于克隆的短肽序列、聚甘氨酸接头(即Glyn，其中n＝2、3、4、5、6、7、8、9、10或更大)、和组氨酸标签(即Hisn，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更大)。其它合适的接头氨基酸序列对本领域技术人员而言是显而易见的。-A-和-B-为任选序列，一般为短序列(如40个或更少氨基酸，即39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个)。例子包括指导多肽运输的前导序列，或有助于克隆或纯化的短肽序列(如组氨酸标签，即Hisn，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更大)。其它合适的N末端和C末端氨基酸序列对本领域技术人员而言是显而易见的。
可采用各种试验来评估本发明多肽的体内免疫原性。例如，多肽可重组表达并通过免疫印迹法用来筛选患者血清。多肽和患者血清之间发生阳性反应说明患者以前对所研究蛋白产生了免疫应答，即该蛋白为免疫原。这种方法还可用来鉴定优势免疫蛋白。
抗体 本发明提供与本发明多肽结合的抗体。它们可以是多克隆或单克隆抗体，并可由任何合适方法制备(如通过重组表达)。为了增加其与人免疫系统的相容性，所述抗体可以是嵌合抗体或人源化抗体[如，参考文献32和33]，或可采用完全人抗。所述抗体可以包含检测标记(如用于诊断试验)。本发明抗体可以连接于固相载体。本发明抗体优选为中和抗体。
单克隆抗体对鉴定和纯化与之结合的单独多肽尤其有用。本发明的单克隆抗体也可以用作免疫测定、放射性免疫试验(RIA)或酶联免疫吸附试验(ELISA)等的试剂。在这些应用中，可用分析检测试剂如放射性同位素、荧光分子或酶标记抗体。以上述方法制备的单克隆抗体还可用于本发明多肽的分子鉴定或表征(表位作图)。
本发明抗体优选对大肠杆菌的ExPEC菌株具有特异性，即，相对于其它细菌(如，相对于非ExPEC大肠杆菌和相对于非大肠杆菌细菌)，它们优选地与ExPEC大肠杆菌结合。更优选地，所述抗体对MNEC菌株具有特异性，即相对于其它细菌，包括相对于其它ExPEC大肠杆菌，它们优选地与MNEC细菌结合。
本发明抗体优选地以纯化或基本纯化形式提供。一般地，抗体存在于基本上不含其它多肽的组合物中，如组合物中其它多肽少于90％(重量)，通常少于60％，更通常少于50％。
本发明抗体可以是任何同种型(如IgA、IgG、IgM，即α、γ或μ重链)，然而通常为IgG。在IgG同种型中，抗体可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4亚类。本发明抗体可具有κ或λ轻链。
本发明抗体可具有各种形式，包括完整抗体，抗体片段如F(ab’)2和F(ab)片段、Fv片段(非共价异二聚体)、单链抗体(如单链Fv分子(scFv))、小抗体、寡抗体(oligobody)等。术语“抗体”不暗指任何特定来源，并包括由非常规方法(如噬菌体呈现)所获得的抗体。
本发明提供一种检测本发明多肽的方法，包括如下步骤(a)在适于形成抗体-抗原复合物的条件下将生物样品与本发明抗体接触；和(b)检测所述复合物。
本发明提供一种检测本发明抗体的方法，包括如下步骤(a)在适于形成抗体-抗原复合物的条件下将生物样品(如血液或血清样品)与本发明多肽接触；和(b)检测所述复合物。
优选抗体与本发明多肽结合的亲和力明显大于本领域公知抗体。优选地，该亲和力至少比本领域公知抗体强1.5倍、2倍、5倍、10倍、100倍、103倍、104倍、105倍、106倍等。
核酸 本发明还提供包含编码本发明多肽的核苷酸序列的核酸(如SEQ ID NO1-9989的奇数编码)。本发明也提供含有SEQ ID NO 9991-10273中任一项的核酸。本发明还提供包含与所述核苷酸序列有序列相同性的核苷酸序列的核酸。序列之间的相同性优选用上述Smith-Waterman同源检索算法确定。对于具体序列，序列相同性程度优选大于50％(如60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)。
本发明还提供可与这些核酸杂交的核酸。杂交反应可以在不同“严格”条件下进行。本领域众所周知并公开了提高杂交严格性的条件[如参考文献34第7.52页]。相关条件的例子包括(以严格性递增的顺序)培育温度25℃、37℃、50℃、55℃和68℃；缓冲液浓度10×SSC、6×SSC、1×SSC、0.1×SSC(其中SSC为0.15M NaCl和15mM柠檬酸盐的缓冲液)及采用其它缓冲体系的等效物；甲酰胺浓度0％、25％、50％和75％；培育时间从5分钟到24小时；1次、2次或更多次洗涤步骤；1分钟、2分钟或15分钟的洗涤培育时间；洗涤溶液6×SSC、1×SSC、0.1×SSC或去离子水。杂交技术及其优化为本领域公知[如见参考文献34-37等]。
一些实施方式中，本发明核酸在低严格条件下与靶点杂交；在其它实施方式中它在中等严格条件下杂交；优选实施方式中，它在高度严格条件下杂交。低严格杂交条件的示例性参数组为50℃和10×SSC。中等严格杂交条件的示例性参数组为55℃和1×SSC。高度严格杂交条件的示例性参数组为68℃和0.1×SSC。
还提供了包含这些序列片段的核酸。它们应该包含序列中的至少n个连续核苷酸，根据特定序列，n为10或更多(如12、14、15、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200或更多)。优选的片段为与本发明核酸序列和参考文献5、6、8、10和11中任一篇所鉴定的核苷酸序列相同的那些片段。
本发明提供通式5′-X-Y-Z-3′的核酸，其中-X-为由x个核苷酸组成的核苷酸序列；-Z-为z个核苷酸组成的核苷酸序列；-Y-为由以下片段组成的核苷酸序列(a)选自SEQ ID NO1-9989中奇数编码的核酸序列的片段；或(b)SEQ ID NO 9991-10273中任一项的片段；(c)SEQ ID NO10274的片段；或(d)(a)或(b)或(c)的互补物；所述核酸5′-X-Y-Z-3′不是(i)SEQ ID NO1-9989中奇数编码的核酸或SEQ ID NO9991-10273或SEQ ID NO10274的片段，也不是(ii)(i)的互补物。-X-和/或-Z-部分可包含启动子序列(或其互补物)。
本发明也提供了含有SEQ ID 10274的至少n个连续核苷酸的片段的核酸，其中n为10或更大，如12、14、15、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、3000、4000、5000、10000、100000、1000000或更大。此核酸可以是单链(至少为部分单链)，以便用作杂交探针和/或扩增引物。在一些实施方式中，该片段不是、或不包含现有ExPEC序列的片段，如不是参考文献5、6、7、8、9、10、11和13中任一篇特别公开的核酸序列的片段。在其它实施方式中，该片段也是现有ExPEC序列的片段，如与参考文献5、6、7、8、9、10、11和13中任一篇特别公开的核酸序列的片段相同。
本发明包括含有与这些序列互补的序列的核酸(如作为反义链或探针，或用作引物)。
本发明核酸可用于杂交反应(如Northern杂交或Southern印迹、或用于核酸微阵列或‘基因芯片’)、扩增反应(如PCR、SDA、SSSR、LCR、TMA、NASBA等)和其它核苷酸技术。
本发明核酸可具有各种形式(如单链、双链、载体、引物、探针、标记等)。本发明核酸可以是环状或支链，然而通常为直链。除非另有限定或要求，采用核酸的本发明任何实施方式均可采用双链形式和组成该双链形式的两条互补的单链形式。引物和探针通常为单链，反义核苷酸通常也是单链。
优选以纯化或基本纯化的形式，即基本上不含其它核酸(如不含天然产生的核酸)、尤其不含其它ExPEC或宿主细胞核酸的形式提供本发明核酸，通常为至少约50％纯(重量)，通常至少约90％纯。本发明核酸优选地为ExPEC核酸。
本发明核酸可以多种方式制备，如完全或部分采用化学合成(如DNA的亚磷酰胺合成)，用核酸酶消化较长核酸(如限制性酶)，连接基因组或cDNA文库中的较短核酸或核苷酸(如采用连接酶或聚合酶)等。
本发明核酸可以连接于固相载体(如珠子、平板、滤纸、膜、玻片、微阵列载体、树脂等)。可用(如)放射性标记或荧光标记、或生物素标记标记本发明核酸。当该核酸用于检测技术，如该核酸是引物或探针时，标记特别有用。
术语“核酸”通常包括任何长度的核苷酸的聚合形式，其包含脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或其类似物。它包括DNA、RNA、DNA/RNA杂交体。它还包括DNA或RNA类似物，如含有修饰主链(如肽核酸(PNA)或硫代磷酸酯)或修饰碱基的类似物。因此本发明包括mRNA、tRNA、rRNA、核酶、DNA、cDNA、重组核酸、支链核酸、质粒、载体、探针、引物等。当本发明的核酸采用RNA形式时，它可能或可能不带有5′帽。
本发明核酸包含序列，然而它们还可以包含非ExPEC序列(如上述通式5′-X-Y-Z-3′的核酸)。这对探针而言尤其适用，从而可使探针包含与靶核酸互补的第一序列和不与靶核酸互补的第二序列。引物中的任何此类非互补序列优选位于互补序列的5′。典型的非互补序列包含限制性位点或启动子序列。
本发明的核酸可用许多方法制备，如化学合成(至少一部分)，用核酸酶(如限制性酶)消化较长核酸，连接基因组或cDNA文库中的较短核酸(如采用连接酶或聚合酶)等。
本发明核酸可以是载体的一部分，即设计用于转导/转染一种或多种细胞类型的核酸构建物的一部分。载体可以是，例如，设计用来分离、增殖和复制插入核苷酸的“克隆载体”，设计用来在宿主细胞中表达核苷酸序列的“表达载体”，设计用来生产重组病毒或病毒样颗粒的“病毒载体”，或包括超过一种类型的载体的属性的“穿梭载体”。优选的载体为质粒。“宿主细胞”包括单个细胞或细胞培养物，其可以作为或已经作为外源核酸的受体。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代，并且由于天然、偶然或有意的突变和/或改变，所述后代不一定与原始亲代细胞完全相同(形态方面或总DNA互补物(complement)方面)。宿主细胞包括用本发明核酸在体内或体外转染或感染的细胞。
当核酸为DNA时，应理解，RNA序列中的“U”会被DNA中的“T”取代。相似地，当核酸为RNA时，应理解，DNA序列中的“T”会被RNA中的“U”取代。
当术语“互补物”或“互补”用于核酸时，指Watson-Crick碱基配对。因此C的互补物为G，G的互补物为C，A的互补物为T(或U)，T(或U)的互补物为A。还可能使用如I(嘌呤肌苷)这样的碱基，与嘧啶(C或T)互补。所述术语还暗示了方向，即5′-ACAGT-3′的互补物为5′-ACTGT-3′而不是5′-TGTCA-3′。
本发明核酸可用于，如制备多肽；作为在生物样品中检测核酸的杂交探针；产生核酸的额外拷贝；产生核酶或反义寡核苷酸；作为单链DNA引物或探针；或作为三链形式寡核苷酸。
本发明提供一种制备本发明核酸的方法，其中所述核酸为部分或全部采用化学方法合成的。
本发明提供包含本发明核苷酸序列的载体(如，克隆或表达载体)和转染有所述载体的宿主细胞。
本发明还提供包含用于扩增ExPEC核酸序列内所含模板序列的引物(如PCR引物)的试剂盒，所述试剂盒包括第一引物和第二引物，其中所述第一引物与所述模板序列基本互补，所述第二引物与所述模板序列的互补物基本互补，其中基本互补的所述引物部分确定了待扩增模板序列的末端。所述第一引物和/或第二引物可包括可检测标记(如荧光标记)。
本发明还提供一种试剂盒，其包括第一和第二单链寡核苷酸，其可以扩增单链或双链核酸(或其混合物)内所含的ExPEC模板核酸序列，其中(a)所述第一寡核苷酸包含与所述模板核酸序列基本互补的引物序列；(b)所述第二寡核苷酸包含与所述模板核酸序列的互补物基本互补的引物序列；(c)所述第一寡核苷酸和/或所述第二寡核苷酸包含不与所述模板核酸互补的序列；和(d)所述引物序列确定了待扩增模板序列的末端。所述特征(c)的非互补序列优选位于所述引物序列的上游(即其5′方向)。(c)序列中一种或两种可包含限制性位点[如参考文献38]或启动子序列[如39]。第一寡核苷酸和/或第二寡核苷酸可包括可检测标记(如荧光标记)。
所述模板序列可以是基因组序列的任何部分(如SEQ ID NO10274)。例如，可以是rRNA基因(如Turenne等(2000)J. Clin.Microbiol.38513-520)或蛋白编码基因。所述模板序列优选为ExPEC特异性，更优选为MNEC特异性序列。
本发明也提供了计算机可读介质(如软盘、硬盘、CD-ROM、DVD等)和/或含有序列表中一个或多个序列的计算机数据库。该介质优选含有SEQ ID NO10274。
本发明提供了检测本发明核酸的方法，所述方法包括以下步骤(a)在杂交条件下将生物样品与本发明核酸探针接触以形成双链体；和(b)检测所述双链体。
本发明提供检测生物样品(如血液)的方法，包括如下步骤在杂交条件下将生物样品与本发明核酸接触。所述方法可以包括核酸扩增(如，PCR、SDA、SSSR、LCR、TMA、NASBA等)或杂交(如微阵列、印迹、在溶液中与探针杂交等)。已经报道过用PCR检测临床样品中的ExPEC[如，见参考文献40]。在参考文献41中总体描述了基于核酸的临床试验。
本发明提供一种制备靶序列片段的方法，其中通过延伸核酸引物制备所述片段。所述靶序列和/或引物为本发明的核酸。所述引物延伸反应可包括核酸扩增(如，PCR、SDA、SSSR、LCR、TMA、NASBA等)。
本发明的核酸扩增可以是定量和/或实时扩增。
就本发明的某些实施方式而言，核酸长度优选为至少7个核苷酸(如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、225、250、275、300个核苷酸或更长)。
就本发明的某些实施方式而言，核酸长度优选为至多500个核苷酸(如450、400、350、300、250、200、150、140、130、120、110、100、90、80、75、70、65、60、55、50、45、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15个核苷酸或更短)。
本发明的引物和探针，以及其它用于杂交的核酸的长度优选为10-30个核苷酸(如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸)。
突变细菌 本发明提供了本文所鉴定的一种或多种基因的表达已被敲除的大肠杆菌。基因敲除技术是本领域熟知的，以前报道了大肠杆菌的敲除突变体。
优选用编码区的等基因缺失进行敲除，但可采用任何其它合适技术，如启动子的缺失或突变、起始密码子的缺失或突变、反义抑制、抑制性RNA等。然而，在获得的细菌中，编码该基因产物的mRNA不存在和/或其翻译被抑制(如至野生型水平的1％以下)。
该细菌可用标记物基因取代敲除基因，如抗生素抗性标记物。
小泡 参考文献42描述了通过敲除mltA(胞壁质溶解性糖基转移酶)或大肠杆菌Tol-Pal复合物的一种或多种组分(如tolA、tolQ、tolB、pal和/或tolR)从MNEC菌株中制备小泡的方法。可以对细菌染色体进行一个或多个遗传改变或插入″特别的″附加型元件(如表达载体)来增加小泡表面保护性抗原的量和/或免疫可及性″接触″，从而改进小泡。
获得此类改进的一种方法是上调本发明多肽保护性抗原的表达。本领域熟知增加靶蛋白表达的多种不同遗传方案，它们可以分成两大类一类依赖对染色体的修饰(如用较强的启动子替换野生型启动子、使天然抑制基因失活等)以增加内源性基因的表达，另一类则基于附加型元件(如高拷贝数质粒、携带工程改造的靶基因的载体等)或染色体中整合外源性保护性靶基因进行的重组表达。这些方法的实施例可以在参考文献44-50中找到。
提高小泡免疫原性和选择性的另一种方法是下调免疫优势非保护性抗原的表达或下调与共生菌株中找到的蛋白同源的蛋白。可以通过对LPS的脂质A部分进行脱毒降低小泡的可能毒性，从而获得进一步改进。先前描述了相似的改变，以从其它革兰阴性病原体中产生改进小泡(参见参考文献51和52)。
所有上述方案均可单独使用或联用以获得用于免疫原性组合物的改进小泡。本发明提供一种敲除了mltA和/或其Tol-Pal复合物的组分和下组中一种或多种的病原性大肠杆菌(尤其是MNEC)(i)在一种与编码本发明多肽的基因天然相连的启动子相比使本发明多肽表达水平升高的启动子的控制下编码本发明多肽的染色体基因；(ii)编码本发明多肽的自主复制的染色体外元件；和/或(iii)相对于野生型LPS减弱大肠杆菌LPS的脂质A部分毒性的遗传修饰。
本发明还提供可通过培育此类细菌获得的小泡，例如在细菌培养时，释放入培养基中的小泡。
药物组合物 本发明提供的组合物含有(a)本发明的多肽、抗体、小泡和/或核酸；和(b)药学上可接受的载体。这些组合物可能适合用作免疫原性组合物，例如，或者用作诊断试剂，或者用作疫苗。本发明的疫苗可以是预防性疫苗或治疗性疫苗，但一般是预防性疫苗。
在一个具体方面，本发明提供了含有表达或过度表达下组编码的一种或多种多肽的一种或多种外膜泡(OMV)的免疫原性组合物(a)选自下组的核苷酸序列SEQ IDNO 511、2453、2455、2677、2691、4595、4747、7003、7051、8167、4627和5699；(b)与氨基酸序列(a)的序列相同性至少为80％的核苷酸序列；(c)作为来自核苷酸序列(a)的至少10个连续核苷酸的片段的核苷酸序列；或(d)与核苷酸序列(a)的序列相同性至少为80％，并包含核苷酸序列(a)的至少10个连续核苷酸的片段的核苷酸序列。
另一方面，本发明提供了含有表达或过度表达下组编码的一种或多种多肽的一种或多种外膜泡(OMV)的免疫原性组合物(a)选自下组的核苷酸序列SEQ ID NO8563、2727、9871、4671、5679、533、3221、3225和7003；(b)与氨基酸序列(a)的序列相同性至少为80％的核苷酸序列；(c)作为来自核苷酸序列(a)的至少10个连续核苷酸的片段的核苷酸序列；或(d)与核苷酸序列(a)的序列相同性至少为80％，并包含核苷酸序列(a)的至少10个连续核苷酸的片段的核苷酸序列。
“药学上可接受的载体”包括自身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体的任何载体。合适的载体一般为大的、代谢缓慢的大分子如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、多聚氨基酸、氨基酸共聚物、蔗糖、海藻糖、乳糖和脂质聚集体(如油滴或脂质体)。此类载体对本领域技术人员为公知技术。所述疫苗还可包含稀释剂，如水、盐水、甘油等。此外，可存在助剂，如湿润剂或乳化剂、pH缓冲物质等。无菌无热原的磷酸盐缓冲生理盐水是典型的载体。对药学上可接受赋形剂的详细讨论参见参考文献289。
本发明的组合物可包含抗微生物剂、尤其是以多剂量形式包装时。
本发明的组合物可包含去污剂，如吐温(聚山梨醇酯)，例如吐温80。去污剂的含量通常很低，如＜0.01％。
本发明的组合物可包含钠盐(如氯化钠)以提供涨度(tonicity)。NaCl浓度一般为10±2mg/ml。
本发明的组合物通常包含缓冲液。一般为磷酸盐缓冲液。
本发明的组合物，尤其是当其将被冻干或当它们包含由冻干材料重建获得的物质时，可包含(如)约15-50mg/ml(如25mg/ml)的糖醇(如甘露醇)或二糖(如蔗糖或海藻糖)。在冻干前可将用于冻干的组合物的pH调整为约6.1。
本发明的多肽可与其它免疫调节剂一起给药。具体说，组合物通常包含疫苗佐剂。所述佐剂可选自TH1佐剂和TH2佐剂中的一种或多种，下面进行进一步论述。可用于本发明组合物的佐剂包括，但不限于 A.含矿物质的组合物 适合用作本发明佐剂的含矿物质的组合物包括无机盐、如铝盐和钙盐。本发明包括无机盐，如氢氧化物(例如羟基氧化物)、磷酸盐(例如羟磷酸盐、正磷酸盐)、硫酸盐等[例如参见参考文献53的第8和9章]或不同无机化合物的混合物(如，磷酸盐和氢氧化物佐剂的混合物，任选地磷酸盐过量)，该化合物采用任何合适的形式(例如凝胶、晶体、无定形等)，优选吸附于盐。含矿物质的组合物制成金属盐颗粒[54]。
本发明疫苗中可含有铝盐，使Al3+剂量为每剂0.2-1.0mg。
在另一实施方式中，本发明佐剂含有磷酸铝和氢氧化铝。在一个更具体的实施方式中，该佐剂中磷酸铝的含量大于氢氧化铝，如磷酸铝与氢氧化铝的重量比为2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1或大于9∶1。更具体说，疫苗中的铝盐含量为每个疫苗剂量中0.4-1.0mg，或每个疫苗剂量中0.4-0.8mg，或每个疫苗剂量中0.5-0.7mg，或每个疫苗剂量中约0.6mg。
通常，通过优化分子之间的静电吸引选择优选的铝系佐剂或多种铝系佐剂如磷酸铝与氢氧化铝的比例，以便在所需pH下该抗原携带的电荷与所述佐剂相反。例如，在pH 7.4时pI～4的磷酸铝佐剂静电吸附溶菌酶，而非白蛋白。如果白蛋白是靶点，则应选择氢氧化铝佐剂(如pH 11.4)。或者，用磷酸盐预处理氢氧化铝能降低其pI，使其成为更多碱性抗原优选的佐剂。
典型的磷酸铝佐剂为无定形羟基磷酸铝，其PO4/Al摩尔比为0.84-0.92，包括约0.6mg Al3+/ml。可以采用低剂量磷酸铝进行吸附，如每剂量每个偶联物采用50-100μg Al3+。当采用磷酸铝并且不希望使抗原吸附于佐剂时，宜在溶液中包含游离磷酸根离子(如通过采用磷酸盐缓冲液)。
B.油乳剂 适合用作本发明佐剂的油乳剂组合物包括鲨烯-水乳剂，如MF59(采用微流化机将5％鲨烯、0.5％吐温80和0.5％Span 85制成亚微米颗粒)[参考文献53的第10章；还参见参考文献55-57，参考文献58的第12章]。MF59用作FLUADTM流感病毒三价亚基疫苗的佐剂。所述乳剂宜包含柠檬酸根离子，如10mM柠檬酸钠缓冲液。
用于该组合物中的尤其优选佐剂为亚微米水包油乳剂。本发明采用的优选的亚微米水包油乳剂为鲨烯/水乳剂，任选地包含不同量的MTP-PE，如含有4-5％(重量/体积)鲨烯、0.25-1.0％(重量/体积)吐温80(聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯)、和/或0.25-1.0％的Span85(山梨聚糖三油酸酯)以及任选的N-乙酰胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰氨酰基-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰基-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)的亚微米水包油乳剂。参考文献55和59-60中详细描述了用于组合物的亚微米水包油乳剂、其制备方法和免疫刺激剂如胞壁酰肽。
可以采用鲨烯、生育酚和吐温80的乳剂。所述乳剂可包含磷酸盐缓冲盐水。还可包含Span85(如1％)和/或卵磷脂。这些乳剂可含有2-10％的鲨烯、2-10％的生育酚和0.3-3％的吐温80，并且鲨烯生育酚的重量比优选≤1，以提供更稳定的乳剂。此类乳剂中的一种可以通过以下方法制备将吐温80溶于PBS以获得2％溶液，然后将90ml所述溶液与5g DL-α-生育酚和5ml鲨烯的混合物混合，然后微流化所述混合物。得到的乳剂可含有(如)平均直径为100-250nm，优选约180nm的亚微米油滴。
可以采用鲨烯、生育酚和Triton去污剂(如Triton X-100)的乳剂。
可以采用鲨烯、聚山梨醇80和泊洛沙姆401(“PluronicTML121”)的乳剂。可用磷酸盐缓冲盐水，pH7.4配制所述乳剂。所述乳剂可用作胞壁酰二肽的递送载体，并与苏氨酰-MDP一起用于“SAF-1”佐剂[61](0.05-1％Thr-MDP、5％鲨烯、2.5％普朗尼克(Pluronic)L121和0.2％聚山梨醇80)。它还可以在没有苏氨酰-MDP的情况下用作“AF”佐剂[62](5％鲨烯、1.25％普朗尼克(Pluronic)L121和0.2％聚山梨醇80)。优选进行微流化。
还可将完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)用作本发明佐剂。
C.皂苷制剂[参考文献53第22章] 皂苷制剂也可用作本发明的佐剂。皂苷为甾醇糖苷和三萜糖苷的异种组，其发现于广泛的植物种类的树皮、叶、茎、根甚至花中。分离自皂树(QuillaiaSaponaria，Molina)树皮的皂苷作为佐剂已广泛研究。在商业上，皂苷还可获自丽花菝葜(Smilax ornata)(墨西哥菝葜)、满天星(Gypsophillapaniculata)(婚纱花)和肥皂草(Saponaria officianalis)(皂根)。皂苷佐剂制剂包括纯化制剂如QS21和脂质制剂如ISCOM。
皂苷组合物采用HPLC和RP-HPLC纯化。已鉴定出采用这些技术特别纯化的部分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。优选地，皂苷为QS21。制备QS21的一种方法示于参考文献63。皂苷制剂还可包含甾醇，如胆固醇[64]。
皂苷和胆固醇的组合可用于形成免疫刺激复合物(ISCOM)的独特颗粒[参考文献53第23章]。ISCOM通常也包含磷脂，如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。任何已知皂苷均可用于ISCOM。优选地，ISCOM包含一种或多种QuilA、QHA和QHC。ISCOM在参考文献64-66中进一步描述。任选地，ISCOM不含另外的去污剂[67]。
有关皂苷基佐剂的进展的综述可见参考文献68和69。
D.病毒体或病毒样颗粒 病毒体和病毒样颗粒(VLP)也可用作本发明的佐剂。这些结构通常包含一种或多种来自病毒的蛋白，所述病毒任选结合磷脂或用磷脂配制。它们通常为不致病、不复制且通常不含有任何天然病毒基因组。所述病毒蛋白可由重组方法制备或从完整病毒中分离。这些适用于病毒体或VLP的病毒蛋白包括由如下病毒衍生的蛋白流感病毒(如HA或NA)、乙肝病毒(如核心蛋白或衣壳蛋白)、戊肝病毒、麻疹病毒、辛德比斯病毒(Sindbis)、轮状病毒、口蹄疫病毒、反转录病毒、诺沃克病毒(Norwalk)、人乳头状瘤病毒、HIV、RNA噬菌体、Qβ噬菌体(如外被蛋白)、GA噬菌体、fr噬菌体、AP205噬菌体、和Ty(如反转录转座子Ty蛋白p1)。VLP在参考文献70-75中进一步讨论。病毒体在参考文献76中进一步讨论。
E.细菌或微生物衍生物 适用于本发明的佐剂包括细菌或微生物衍生物，如肠细菌脂多糖(LPS)的非毒性衍生物、脂质A衍生物、免疫刺激性寡核苷酸和ADP核糖基化毒素及其脱毒衍生物。
LPS的非毒性衍生物包括单磷酰脂质A(MPL)和3-O-脱酰化MPL(3dMPL)。3dMPL为带有4、5或6条酰化链的3脱-O-酰化单磷酰脂质A的混合物。优选的“小颗粒”形式的3脱-O-酰化单磷酰脂质A在参考文献77中公开。此类3dMPL“小颗粒”足够小，能通过0.22μm膜进行无菌过滤[77]。其它非毒性LPS衍生物包括单磷酰脂质A模拟物，如氨烷基氨基葡糖苷磷酸衍生物，如RC529[78、79]。
脂质A衍生物包括大肠杆菌来源的脂质A的衍生物，如OM174。OM174在参考文献80和81中进行了描述。
适合用作本发明佐剂的免疫刺激性寡核苷酸包括含有CpG基序(含有通过磷酸键与鸟嘌呤连接的未甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列)的核苷酸序列。含有回文或聚(dG)序列的双链RNA和寡核苷酸也显现出免疫刺激性。
CpG可包括核苷酸修饰/类似物，如硫代磷酸修饰并可为双链或单链。参考文献82、83和84公开了可能的类似物取代，如用2′-脱氧-7-脱氮鸟苷代替鸟苷。CpG寡核苷酸的佐剂效果在参考文献85-90中进一步讨论。
CpG序列可指向TLR9，如基序GTCGTT或TTCGTT[91]。CpG序列可特异性诱导Th1免疫应答，如CpG-A ODN，或可更特异性地诱导B细胞应答，如CpG-B ODN。CpG-A和CpG-B ODN在参考文献92-94中讨论。优选的CpG为CpG-A ODN。
优选地，构建CpG寡核苷酸使5′端能进行受体识别。可选地，两种CpG寡核苷酸以其3′端相连以形成“免疫聚体(immunomers)”。参见例如，参考文献91和95-97。
其它免疫刺激性寡核苷酸包括双链RNA、或含有回文序列的寡核苷酸、或含有聚(dG)序列的寡核苷酸。
细菌ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物可用作本发明的佐剂。优选地，蛋白获自大肠杆菌(大肠杆菌热不稳定肠毒素“LT”)、霍乱(“CT”)或百日咳(“PT”)。采用脱毒ADP-核糖基化毒素作为粘膜佐剂在参考文献98中描述，作为肠道外佐剂在参考文献99中描述。毒素或类毒素优选为包含A和B亚基的全毒素形式。优选地，A亚基包含脱毒突变；B亚基优选不突变。优选地，佐剂为脱毒LT突变体，如LT-K63、LT-R72和LT-G192。采用ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物，尤其是LT-K63和LT-R72作为佐剂可参见参考文献100-107。氨基酸取代的参比数字优选根据参考文献108(特别纳入本文作参考)中所列的ADP-核糖基化毒素的A和B亚基的比对得到。
式I、II或III化合物或其盐也可以用作佐剂 IIIIII
如参考文献109所述，如‘ER803058’、‘ER803732’、‘ER804053’、‘ER804058’、‘ER804059’、‘ER804442’、‘ER804680’、‘ER804764’、‘ER803022’或‘ER804057’例如
F.人免疫调制剂 适合用作本发明佐剂的人免疫调制剂包括细胞因子如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12[110]等)[111]、干扰素(如干扰素γ)、巨噬细胞集落刺激因子、肿瘤坏死因子和巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)和MIP-1β[112]。
G.生物粘合剂和粘膜粘合剂 生物粘合剂和粘膜粘合剂也可用作本发明的佐剂。合适的生物粘合剂包括酯化透明质酸微球体[113]或粘膜粘合剂如聚(丙烯酸)、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纤维素的交联衍生物。壳聚糖及其衍生物也可用作本发明的佐剂[114]。
H.微粒 微粒也可用作本发明的佐剂。优选为可生物降解及无毒性物质(如聚(α羟酸)、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚己酸内酯等)材料形成的颗粒(即直径在～100nm-～150μm的颗粒，更优选直径在～200nm-30μm，最优选直径在～500nm-～10μm)，优选具有丙交酯乙交酯共聚物，任选处理以具有带负电表面(如用SDS处理)或带正电表面(例如用阳离子去污剂如CTAB处理)。
I.脂质体(参考文献53第13和14章) 适合用作佐剂的脂质体制剂的例子如参考文献115-117中所述。
J.聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯制剂 适用于本发明的佐剂包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯[118]。此类制剂进一步包括结合有辛苯昔醇的聚氧乙烯山梨聚糖酯表面活性剂[119]和结合有至少一种其它非离子表面活性剂如辛苯昔醇的聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂[120]。优选的聚氧乙烯醚选自聚氧乙烯-9-月桂基醚(laureth 9)、聚氧乙烯-9-硬脂酰醚、聚氧乙烯-8-硬脂酰醚、聚氧乙烯-4-月桂基醚、聚氧乙烯-35-月桂基醚和聚氧乙烯-23-月桂基醚。
K.磷腈如PCPP 磷腈佐剂包括参考文献121和122中所述的聚[二(羧基苯氧基)磷腈](poly[di(carboxylatophenoxy)phosphazene]，“PCPP”)。
L.胞壁酰肽 适合用作本发明佐剂的胞壁酰肽的例子包括N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-去甲胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(去甲MDP)和N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)。
M.咪唑并喹啉(imidazoquinolone)化合物 咪唑并喹啉佐剂包括咪喹莫特(“R-837”)[123、124]、雷西莫特(“R-848”)[125]及其类似物；和它们的盐(如盐酸盐)。关于免疫刺激性咪唑并喹啉的进一步细节可以在参考文献126-130中找到。
N.硫代缩氨基脲化合物 硫代缩氨基脲化合物的例子以及适合用作本发明佐剂的化合物的配制方法、制备方法和筛选方法包括如参考文献131所述的内容。所述硫代缩氨基脲对刺激人外周血单核细胞产生细胞因子(如TNF-α)特别有效。
O.色胺酮化合物 色胺酮化合物的例子以及适合用作本发明佐剂的化合物的配制方法、制备方法和筛选方法包括如参考文献132所述的内容。所述色胺酮化合物对刺激人外周血单核细胞产生细胞因子(如TNF-α)特别有效。
P.核苷类似物 各种核苷类似物可用作佐剂，如(a)Isatorabine(ANA-245；7-硫杂-8-氧代鸟苷)及其前药
(b)ANA975；(c)ANA-025-1；(d)ANA380；(e)如参考文献133-135公开的化合物；(f)具有下式的化合物
式中 R1和R2各自独立地是H、卤素、-NRaRb、-OH、C1-6烷氧基、取代C1-6烷氧基、杂环基、取代杂环基、C6-10芳基、取代C6-10芳基、C1-6烷基或取代C1-6烷基； R3不存在，或者是H、C1-6烷基、取代C1-6烷基、C6-10芳基、取代C6-10芳基、杂环基或取代杂环基； R4和R5各自独立地是H、卤素、杂环基、取代杂环基、-C(O)-Rd、C1-6烷基、取代C1-6烷基、或结合在一起形成如R4-5所示的5元环
在

表示的化学键处实现结合 X1和X2各自独立地是N、C、O或S； R8为H、卤素、-OH、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、-OH、-NRaRb、-(CH2)n-O-Rc、-O-(C1-6烷基)、-S(O)pRe或-C(O)-Rd； R9为H、C1-6烷基、取代C1-6烷基、杂环基、取代杂环基或R9a，其中 R9a为
在

表示的化学键处实现结合 R10和R11各自独立地是H、卤素、C1-6烷氧基、取代C1-6烷氧基、-NRaRb或-OH； Ra和Rb各自独立地是H、C1-6烷基、取代C1-6烷基、-C(O)Rd、C6-10芳基； Rc各自独立地是H、磷酸、二磷酸、三磷酸、C1-6烷基或取代C1-6烷基； Rd各自独立地是H、卤素、C1-6烷基、取代C1-6烷基、C1-6烷氧基、取代C1-6烷氧基、-NH2、-NH(C1-6烷基)、-NH(取代C1-6烷基)、-N(C1-6烷基)2、-N(取代C1-6烷基)2、C6-10芳基或杂环基； Re各自独立地是H、C1-6烷基、取代C1-6烷基、C6-10芳基、取代C6-10芳基、杂环基或取代杂环基； Rf各自独立地是H、C1-6烷基、取代C1-6烷基、-C(O)Rd、磷酸、二磷酸或三磷酸； n各自独立地是0、1、2或3； p各自独立地是0、1或2；或 或(g)(a)-(f)中任一项的药学上可接受的盐、(a)-(b)中任一项的互变异构体、或所述互变异构体的药学上可接受的盐。
Q.连到含磷酸无环主链上的脂质 包含连接于含磷酸无环主链的脂质的佐剂包括TLR4拮抗剂E5564[136、137]
R.小分子免疫增强剂(SMIP) SMIP包括 ·N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺； ·N2，N2-二甲基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺； ·N2-乙基-N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺； ·N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N2-丙基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺； ·1-(2-甲基丙基)-N2-丙基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺； ·N2-丁基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺； ·N2-丁基-N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺； ·N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N2-戊基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺； ·N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N2-丙-2-烯基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺； ·1-(2-甲基丙基)-2-[(苯基甲基)硫]-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺； ·1-(2-甲基丙基)-2-(丙硫基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺； ·2-[[4-氨基-1-(2-甲基丙基)1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2基](甲基)氨基]乙醇； ·乙酸2-[[4-氨基-1-(2-甲基丙基)1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2基](甲基)氨基]乙酯； ·4-氨基-1-(2-甲基丙基)-1，3-二氢-2H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2-酮； ·N2-丁基-1-(2-甲基丙基)-N4，N4-双(苯基甲基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺； ·N2-丁基-N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N4，N4-双(苯基甲基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺； ·N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N4，N4-双(苯基甲基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺； ·N2，N2-二甲基-1-(2-甲基丙基)-N4，N4-双(苯基甲基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺； ·1-{4-氨基-2-[甲基(丙基)氨基]-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1基}-2-甲基丙-2醇； ·1-[4-氨基-2-(丙基氨基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1基]-2-甲基丙-2醇； ·N4，N4-二苄基-1-(2-甲氧基-2-甲基丙基)-N2-丙基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺。
S.蛋白体 一种佐剂为由第一种革兰阴性菌制备的外膜蛋白蛋白体制备物和由第二种革兰阴性菌制备的脂糖类(liposaccharide)制备物的组合，其中所述外膜蛋白蛋白体和脂糖类制备物形成稳定的非共价佐剂复合物。此类复合物包括“IVX-908”，它是由脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)外膜和脂多糖组成的复合物。它们已被用作流感疫苗的佐剂[138]。
T.其它佐剂 作为免疫刺激剂的其它物质公开于参考文献53的第7章、参考文献53和58。有用的佐剂物质还包括 ·甲基肌苷5′单磷酸(“MIMP”)[139]。
·一种多羟基化的吡咯烷士定化合物[140]，如下式化合物
式中R选自氢，直链或支链的、未取代或取代的、饱和或不饱和的酰基、烷基(如环烷基)、烯基、炔基或芳基、或者其药学上可接受的盐或衍生物。例子包括，但不限于木麻黄素(casuarine)、木麻黄素-6-α-D-吡喃葡萄糖、3-表-木麻黄素、7-表-木麻黄素、3，7-二表-木麻黄素等。
·γ菊糖[141]或其衍生物，如algammulin。
·参考文献142中公开的化合物。
·参考文献143中公开的化合物，包括酰基哌嗪化合物、吲哚二酮化合物、四氢异喹啉(tetrahydraisoquinoline，THIQ)化合物、苯并环二酮化合物、氨基氮杂乙烯基化合物、氨基苯并咪唑喹啉酮(ABIQ)化合物[144、145]、氢化邻苯二甲酰胺(hydrapthalamide)化合物、二苯甲酮化合物、异唑化合物、甾醇化合物、喹唑啉酮化合物、吡咯化合物[146]、蒽醌化合物、喹啉化合物、三嗪化合物、吡唑并嘧啶(Pyrazalopyrimidine)化合物和吲哚化合物[147]。
·罗唑利宾(7-烯丙基-8-氧代鸟苷)[148]。
·阳离子脂类和(通常为中性的)共脂如氨基丙基-二甲基-肉豆蔻酰氧基-溴化丙铵-二植烷酰基磷脂酰基-乙醇胺(“VaxfectinTM”)或氨基丙基-二甲基-双-十二烷氧基-溴化丙铵-二油酰基磷脂酰基-乙醇胺(“GAP-DLRIEDOPE”)的制剂。优选含有(±)-N-(3-氨基丙基)-N，N-二甲基-2，3-双(顺式-9-四癸烯氧基)-1-丙铵盐的制剂。
本发明还包含上述一种或多种佐剂的组合。例如，以下组合物可用作本发明佐剂组合物(1)皂苷和水包油乳剂[150]；(2)皂苷(如QS21)+非毒性LPS衍生物(如3dMPL)[151]；(3)皂苷(如QS21)+无毒性LPS衍生物(如3dMPL)+胆固醇；(4)皂苷(如QS21)+3dMPL+IL-12(可选地+甾醇)[152]；(5)3dMPL与QS21和/或水包油乳剂的组合[153]；(6)SAF，含有10％角鲨烷、0.4％吐温80TM、5％普朗尼克嵌段聚合物L121和thr-MDP，经微流化形成亚微米乳剂或经涡旋形成较大粒度的乳剂。(7)RibiTM佐剂体系(RAS)(Ribi免疫化学)，其含有2％角鲨烯、0.2％吐温80TM和选自下组的一种或多种细菌细胞壁组分单磷酰基脂质A(MPL)、二霉菌酸海藻糖酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)，优选为MPL+CWS(DetoxTM)；(8)一种或多种无机盐(如铝盐)+无毒性LPS衍生物(如3dMPL)；和(9)一种或多种无机盐(如铝盐)+免疫刺激性寡核苷酸(如包含CpG基序的核苷酸序列)。
本发明的组合物优选地引起细胞介导免疫应答和体液免疫应答以有效地应对尿路病原性感染。所述免疫应答优选地诱导出长效(如中和)抗体和细胞介导的免疫力从而在遇到MNEC-相关抗原时能够快速应答。
通常认为两类T细胞CD4和CD8细胞是启动和/或增强细胞介导免疫和体液免疫必需的。CD8 T细胞能够表达CD8共受体，通常被称为细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。CD8细胞能够识别MHC I类分子呈现的抗原或与之相互作用。CD4T细胞可表达CD4共受体，通常被称为T辅助细胞，CD4细胞能够识别与MHC II类分子结合的抗原性肽。通过与MHC II类分子相互作用，CD4细胞可分泌诸如细胞因子这样的因子。这些分泌的细胞因子可激活B细胞、细胞毒性T细胞、巨噬细胞和参与免疫应答的其它细胞。辅助T细胞或CD4+细胞可进一步分成两种功能不同的亚组TH1表型和TH2表型，其不同之处在于细胞因子和效应器功能。
活化的TH1细胞增强细胞免疫(包括增加抗原特异性CTL的产量)并因此对细胞内感染的应答具有特殊价值。活化的TH1细胞可以分泌IL-2、IFN-γ和TNF-β中的一种或多种。TH1免疫应答可通过激活巨噬细胞、NK(自然杀伤)细胞和CD8细胞毒性T细胞(CTL)而导致局部炎性反应。TH1免疫应答还可通过以IL-12来刺激B细胞和T细胞的生长，从而扩展免疫应答。经TH1刺激的B细胞可分泌IgG2a。
活化的TH2细胞增加抗体产生并因此对细胞外感染的应答具有特殊价值。活化的TH2细胞可分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10中的一种或多种。TH2免疫应答会导致产生IgG1、IgE、IgA和记忆B细胞，用于将来的防卫。
增强的免疫应答可包括增强的TH1免疫应答和TH2免疫应答中的一种或多种。增强的TH1免疫应答可包括CTL增加，一种或多种TH1免疫应答相关性细胞因子(如IL-2、IFN-γ和TNF-β)的增加、活化巨噬细胞的增加、NK活性的增加或IgG2a产量的增加中的一种或多种反应。优选地，增强的TH1免疫应答包括IgG2a产量的增加。增强的TH2免疫应答可包括一种或多种TH2免疫应答相关性细胞因子(如IL-4、IL-5、IL-6和IL-10)的增加、或IgG1、IgE、IgA和记忆B细胞的产量的增加中的一种或多种反应。优选地，增强的TH2免疫应答包括IgG1产量的增加。
采用TH1佐剂会引起TH1免疫应答。TH1佐剂通常引起IgG2a产量相对于无佐剂抗原免疫增加。适用于本发明的TH1佐剂可包括例如皂苷制剂、病毒体和病毒样颗粒、肠杆菌脂多糖(LPS)的无毒衍生物、免疫刺激性寡核苷酸。免疫刺激性寡核苷酸，如含有CpG基序的寡核苷酸，为优选的用于本发明的TH1佐剂。
采用TH2佐剂会引起TH2免疫应答。TH2佐剂通常引起IgG1产量相对于无佐剂抗原免疫增加。适用于本发明的TH2佐剂包括例如含矿物质的组合物、油乳剂和ADP核糖基化毒素及其脱毒衍生物。含矿物质的组合物，如铝盐为优选的适用于本发明的TH2佐剂。
优选地，本发明包括含有TH1佐剂和TH2佐剂的组合的组合物。优选地，此类组合物引起增强的TH1和增强的TH2应答，即相对于无佐剂免疫，IgG1和IgG2a的产量均有增加。更优选地，包含TH1和TH2佐剂组合的所述组合物相对于单佐剂免疫(即相对于单以TH1佐剂或单以TH2佐剂进行免疫)引起增强的TH1和/或增强的TH2免疫应答。
所述免疫应答可以是TH1免疫应答和TH2免疫应答中的一种或两种。优选地，免疫应答为增强的TH1应答和增强的TH2应答中的一种或两种。
所述增强的免疫应答可以是全身性和粘膜性免疫应答中的一种或两种。优选地，所述免疫应答为增强的全身性和增强的粘膜性免疫应答中的一种或两种。优选地，粘膜性免疫应答为TH2免疫应答。优选地，粘膜性免疫应答包括IgA产量的增加。
尤其优选采用氢氧化铝或磷酸铝佐剂，抗原通常吸附于此类盐。磷酸钙为另一种优选佐剂。
本发明的组合物的pH优选在6-8之间，优选地为大约7。采用缓冲液维持pH的稳定。当组合物包含氢氧化铝盐时，优选采用组氨酸缓冲液[154]。组合物可以是无菌和/或无热原的。本发明的组合物可与人体等渗。
所述组合物可装在小瓶中，或者它们可装在预填充的注射器中。所述注射器可以带有或不带有针头。注射器包括单剂量的组合物，而小瓶可包括单剂量或多剂量。可注射组合物通常为液体溶液或悬液。或者，其可以固态形态存在(如冻干)，在注射前用液态载体溶解或悬浮。
本发明的组合物可以单位剂量形式或以多剂量形式包装。就多剂量形式而言，小瓶优于预填充注射器。可以常规方法得到有效剂量体积，但注射用组合物的人体剂量一般为0.5ml。
当本发明的组合物需要在临用前临时制备(如一组分以冻干形式存放)并以药盒形式存放时，所述药盒可包括两个小瓶，或者可包括一个预填充的注射器和一个小瓶，注射之前用注射器中的内容物将小瓶中的内容物再激活。
因此本发明提供一种试剂盒，包括第一组分和第二组分，其中所述第一组分包含一种或多种本发明的多肽、抗体、小泡和/或核酸；所述第二组分包含下组中的一种或多种将组合物给予患者的说明书、注射器或其它递送装置、佐剂和/或药学上可接受的配制溶液。
本发明还提供一种预填充有本发明的免疫原性组合物的递送装置(如注射器)。
用作疫苗的免疫原性组合物包括免疫学有效量的抗原、和其它任何所需组分。‘免疫学有效量’指将所述量(以单剂量给药或作为连续剂量的一部分给药)给予个体能有效治疗或预防。所述量取决于待治疗个体的健康和身体状况、年龄、待治疗个体的分类组(如非人灵长类、灵长类等)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需保护程度、疫苗的剂型、治疗医生对医学状况的评估和其它相关因素。预计所述量将落入可通过常规试验确定的相对宽的范围内，每个剂量中每种脑膜炎球菌糖抗原的含量一般为每抗原1μg-10mg。
药物应用 本发明还提供一种治疗患者的方法，包括给予患者治疗有效量的本发明组合物。患者可能自身处于患该病的风险中或可能为孕妇(‘母体免疫’[155])。
本发明提供用作药剂(如作为免疫原性组合物或作为疫苗)或用作诊断试剂的本发明的核酸、多肽、小泡或抗体。它还提供使用本发明的核酸、多肽、小泡或抗体来制造(i)治疗或预防由ExPEC细菌引起的疾病和/或感染的药剂；(ii)检测针对ExPEC细菌的抗体是否存在的诊断试剂；和/或(iii)能产生针对ExPEC细菌的抗体的试剂。所述ExPEC细菌可以是任何血清型或菌株，但优选为MNEC菌株，如K1血清型和/或B2MLEE型。
本发明可用于预防和/或治疗疾病如菌血症、脑膜炎、尿路感染、肾盂肾炎和/或膀胱炎。本发明尤其可用于治疗脓毒症和/或脑膜炎。
患者优选为人。人可以是儿童(如年龄为0-18岁或0-5岁)，可以是青少年(如年龄为15-19岁)、成年人(如年龄为19-54岁)，或者可以是老年人(如年龄为55岁或更大年纪)。女性青少年和成年人是优选的患者。打算施用于儿童或青少年的疫苗也可给予成人，(例如)以评估其安全性、剂量、免疫原性等。
其它可能的动物患者包括犬，其可能为ExPEC携带者[156、157]。
一种检验治疗性治疗效果的方法包括在给予本发明组合物之后监控感染情况。一种检验预防治疗效果的方法包括在给药后监控针对给予的多肽的免疫应答情况。本发明的组合物的免疫原性可通过如下方法确定将它们给予测试对象(如12-16个月大的儿童、或动物模型如小鼠模型)，然后确定包括ELISA效价(GMT)在内的IgG的标准参数。通常在给予该组合物大约4周后测定这些免疫应答情况，并与给予组合物之前测定的值进行比较。当给予一个以上剂量的组合物时，可进行一次以上的给药后测定。也可以用脓毒症的成年小鼠模型、UTI的小鼠模型和新生大鼠中脑膜炎的被动保护评价效力。
给予多肽抗原为一种优选的诱导免疫的治疗方式。
给予本发明的抗体为另一种优选的治疗方式。这种被动免疫方式尤其适用于新生婴儿或怀孕妇女。这一方法一般采用单克隆抗体，如人源化抗体或完整的人抗体。
本发明的组合物通常直接给予患者。直接递送可通过如下方式实现胃肠道外注射(如皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内或组织间隙)、直肠施用、口服(如片剂、喷雾剂)、阴道施用、局部施用、经皮施用、经皮肤施用、鼻内施用、舌下施用、眼部施用、耳部施用、肺部施用或其它粘膜施用。优选肌肉内施用到大腿或上臂。注射可通过针头(如皮下注射针头)实现，然而还可使用无针注射。典型的肌肉内剂量为0.5ml。
本发明可用于引起全身性和/或粘膜性免疫。优选地，所述全身性和/或粘膜性免疫表现为增强的TH1和/或TH2免疫应答。优选地，增强的免疫应答包括IgG1和/或IgG2a和/或IgA的产量增加。
剂量治疗可以是单剂量方案或多剂量方案。多剂量可用于初次免疫方案和/或用于加强免疫方案。加强剂量方案可接在初次剂量方案之后。在多剂量方案中，可采用同样或不同的途径，如胃肠道外初次免疫和粘膜加强免疫、粘膜初次免疫和胃肠道外加强免疫等给予各种剂量。初次剂量之间的合适间隔(如4-16周)、以及初次和加强免疫之间的合适间隔可用常规方法确定。例如，疫苗接种的初次疗程包括1-10个单独剂量，之后以维持和/或加强免疫应答所必需的时间间隔给予其它剂量，例如，第二剂在1-4个月时给予，当需要时，几个月后给予后续剂量。
细菌感染影响身体的各个部分，因此组合物可以制备成各种形式。例如，组合物可以制备为液体溶液或悬液形式的注射剂。还可制备适于在注射前溶解或悬浮于液体载体中的固体形式(如冻干或喷雾冷冻干燥的组合物)。该组合物可制备成局部给药剂型，如软膏剂、乳膏剂或粉末剂。该组合物可制备成口服给药剂型，如片剂或胶囊、喷雾剂或糖浆(任选地进行调味)。所述组合物可制备成肺部给药剂型，如使用细粉或喷雾的吸入器。所述组合物可制备成栓剂或阴道栓剂。所述组合物可制备成鼻、耳或眼给药剂型，如喷雾剂、滴剂、凝胶或粉末[如参考文献158和159]。所述组合物可以为药盒形式，设计成临近给予患者前重建成混合的组合物。此类药盒可包括一种或多种液体形式的抗原和一种或多种冻干抗原。
本发明的组合物可以在与其它疫苗基本上相同的时间(如在相同的医疗咨询或问诊期间)给予患者，如基本上与下述疫苗相同的时间麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、风疹疫苗、MMR疫苗、水痘疫苗、MMRV疫苗、白喉疫苗、破伤风疫苗、百日咳疫苗、DTP疫苗、偶联的b型流感嗜血杆菌(H.influenzae)疫苗、人乳头瘤病毒疫苗、灭活脊髓灰质炎病毒疫苗、乙肝病毒疫苗、肺炎球菌偶联疫苗、脑膜炎球菌偶联疫苗等。类似地，它们可在与抗生素，尤其是对MNEC有活性的抗生素化合物基本上相同的时间(如在相同的医疗咨询或问诊期间)给予患者。
本发明组合物的其它抗原组分 本发明还提供一种包含本发明多肽和一种或多种下述其它抗原的组合物 -脑膜炎奈瑟球菌(N.meningitides)血清组A、C、W135和/或Y(优选所有四种)的糖抗原，如在参考文献160中公开的血清组C的寡糖[还参见参考文献161]或参考文献162中的寡糖。
-脑膜炎奈瑟球菌血清组B的抗原，如参考文献163-171等公开的抗原。
-肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)的糖抗原[如172、173、174]。
-甲肝病毒抗原，如灭活病毒[如175、176]。
-乙肝病毒抗原，如表面抗原和/或核心抗原[如176、177]。
-白喉抗原，如白喉类毒素[如参考文献178第3章]如CRM197突变体。
-丙肝病毒的抗原[如180]。
-HIV抗原[181]。
-破伤风抗原，如破伤风类毒素[如参考文献178第4章]。
-百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)的抗原，如百日咳博德特菌的百日咳全毒素(PT)和丝状血凝素(FHA)，任选地还与百日咳杆菌黏附素(pertactin)和/或凝集原2和3混合[如参考文献182和183]。
-流感嗜血杆菌B(Haemophilus influenzae B)的糖抗原[如161]。
-骨髓灰质炎抗原[如184、185]如IPV。
-麻疹、腮腺炎和/或风疹抗原[如参考文献178第9、10和11章]。
-水痘抗原。
-流感抗原[如参考文献178第19章]，如血凝素和/或神经氨酸酶表面蛋白。流感抗原可衍生自大规模流行性(每年)流感毒株。流感抗原可衍生自有可能引起大规模爆发的毒株(即与目前循环毒株的血凝素相比具有新的血凝素的流感毒株，或者对家禽具有病原性并且有可能横向传播给人群的流感毒株，或对人具有病原性的流感毒株)。流感抗原可衍生自在鸡蛋或细胞培养物中生长出来的病毒。
-卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)的抗原[如186]。
-无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(B型链球菌)的糖抗原。
-无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(B型链球菌)的蛋白抗原[如187、188]。
-淋病奈瑟球菌(N.gonorrhoeae)的抗原[如189-192]。
-肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)的抗原[如参考文献193-199]或来自肺炎衣原体的抗原的组合[如200]。
-沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)的抗原，或来自沙眼衣原体的抗原的组合[如201]。
-牙龈炎卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)的抗原[如202]。
-狂犬病抗原[如203]，如冻干的灭活病毒[如204，RabAvertTM]。
-副粘病毒如呼吸道合胞病毒(RSV[205、206])和/或副流感病毒(PIV3[207])的抗原。
-炭疽杆菌(Bacillus anthracis)抗原[如208、209、210]。
-酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(A型链球菌)的抗原[如188、211、212]。
-金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抗原[如213]。
-黄病毒属病毒的抗原，如黄热病病毒、日本脑炎病毒、登格热病毒的四种血清型、蜱传播性脑炎病毒、西尼罗河病毒的抗原。
-瘟病毒抗原，如经典猪热病病毒、牛病毒性腹泻病毒和/或边界病病毒的抗原。
-细小病毒，如细小病毒B19的抗原。
-人乳头瘤病毒(HPV)抗原[214]。
本组合物可包含一种或多种这些其它抗原。
优选的淋球菌抗原包括ngs13(OmpA)、OmpH、ngs576(肽基脯氨酰顺/反异构酶(PPI酶)蛋白)、ngs41和ngs117中的一种或多种。
优选的HPV抗原包括HPV16、HPV18、HPV6和HPV11中的一种或多种。
优选的沙眼衣原体抗原包括下组的一种或多种CT045、CT089、CT242、CT316、CT381。CT396、CT398、CT444、CT467、CT547、CT587、CT823、CT761和这些抗原的特定组合，其公开于WO 05/002619。
优选的肺炎衣原体抗原包括下组的一种或多种CPn0324、Cpn0301、Cpn0482、Cpn0503、Cpn0525、Cpn0558、Cpn0584、Cpn0800、Cpn0979、Cpn0498、Cpn0300、Cpn0042、Cpn0013、Cpn450、Cpn0661、Cpn0557、Cpn0904、Clpn0795、Cpn0186和Cpn0604以及这些抗原的特定组合，其公开于WO05/084306。
优选的GBS抗原包括GBS80、GBS104、GBS59、GBS67、GBS322和GBS276中的一种或多种。
在另一个实施方式中，将本发明抗原与适用于经设计能保护女性不得泌尿系统和/或性传播疾病的疫苗中的一种或多种其它非大肠杆菌抗原混合。例如，所述抗原可与衍生自下组的抗原混合无乳链球菌、沙眼衣原体、淋病奈瑟球菌、乳头瘤病毒和单纯疱疹病毒。使用人乳头状瘤病毒抗原时，它们可能来自HPV16、HPV18、HPV6和/或HPV11中的一种或多种。
在另一个实施方式中，本发明的抗原组合与适用于经设计能保护老年人或免疫削弱个体的疫苗中的一种或多种其它非大肠杆菌抗原混合。例如，所述抗原组合可与衍生自下组的抗原混合粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、单核细胞增生利斯特菌(Listeria monocytogenes)、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidies)、流感病毒和副流感病毒(‘PIV’)。
在需要时可对毒性蛋白抗原进行脱毒(如通过化学和/或遗传方法对百日咳毒素进行脱毒[183])。
该组合物中含有白喉抗原时，优选还包含破伤风抗原和百日咳抗原。类似地，在包含破伤风抗原的情况下，优选还包含白喉抗原和百日咳抗原。类似地，在包含百日咳抗原的情况下，优选还包含白喉抗原和破伤风抗原。因此优选DTP组合物。
糖抗原优选为偶联物形式。偶联物的载体蛋白包括细菌毒素(例如白喉类毒素或破伤风类毒素)、脑膜炎奈瑟球菌外膜蛋白[215]、合成肽[216、217]、热激蛋白[218、219]、百日咳蛋白[220、221]、来自流感嗜血杆菌的蛋白D[222、223]、细胞因子[224]、淋巴因子[224]、流感嗜血杆菌蛋白、激素[224]、生长因子[224]、来自艰难梭菌(C.difficile)的毒素A或毒素B[225]、摄铁蛋白[226]、含有各种病原体衍生抗原的多个人CD4+T细胞表位的人工蛋白[227]例如N19蛋白[228]、肺炎球菌表面蛋白PspA[229]、肺炎球菌溶血素[230]等。优选的载体蛋白为CRM197蛋白[231]。
该组合物中各抗原的浓度一般为至少1μg/ml。总体而言，任何给定抗原的浓度都足以引起针对该抗原的免疫应答。
优选地，抗原吸附于铝盐。
核酸免疫 上述免疫原性组合物包括来自MNEC的多肽抗原。作为将蛋白抗原用于本发明免疫原性组合物的替代方法，可以采用编码该抗原的核酸(优选为DNA，如质粒形式)，以提供基于核酸免疫的组合物、方法和用途。目前核酸免疫已经是一个成熟的领域(如，参考文献232-239等)，已应用于许多疫苗。
编码免疫原的核酸在被递送到患者体内后进行体内表达，表达的免疫原进而刺激免疫系统。活性成分通常采用包含以下组件的核酸载体形式(i)启动子；(ii)编码免疫原的序列，其操作性连接于所述启动子；和任选的(iii)选择性标记。优选的载体还可包含(iv)复制起点；和(v)位于(ii)下游并与之操作性连接的转录终止子。通常，(i)和(v)为真核来源，而(iii)和(iv)为原核来源。
优选的启动子为病毒启动子，如巨细胞病毒(CMV)的启动子。除了启动子外，该载体还可包括转录调控序列(如增强子)，其在功能上与启动子相互作用。优选的载体包括立即早期CMV增强子/启动子，更优选的载体还包括CMV内含子A。启动子操作性连接于编码免疫原的下游序列，从而对免疫原编码序列的表达进行控制。
使用标记时，其优选在微生物宿主中(如在原核生物中、在细菌中、在酵母中)起作用。所述标记优选为原核选择性标记(如在原核启动子的控制下转录)。方便起见，标记一般为抗生素抗性基因。
本发明的载体优选为自主复制附加型载体或自主复制染色体外载体，如质粒。
本发明的载体优选包含复制起点。优选地，所述复制起点在原核生物中有活性而在真核生物中无活性。
因此，优选的载体包括用于选择该载体的原核标记、原核性复制起点，还包括用于驱动免疫原编码序列转录的真核启动子。因此所述载体(a)在原核宿主中扩增并选择而不表达多肽，但(b)在真核宿主中表达而不扩增。这种安排对核酸免疫载体很理想。
本发明的载体可包含位于编码序列下游的真核转录终止子序列。这将提高转录水平。当编码序列自身不具有聚腺苷酸化序列时，本发明的载体优选具有该序列。优选的聚腺苷酸化序列来自牛生长激素。
本发明的载体可包含多克隆位点。
除了编码免疫原和标记的序列外，该载体可包含第二真核编码序列。所述载体在所述第二序列的上游还可包含IRES，以便从与免疫原相同的转录物翻译出第二真核多肽。或者，所述免疫原编码序列可以在IRES下游。
本发明的载体可包含未甲基化CpG基序，如未甲基化DNA序列，它们的共同之处在于胞嘧啶后接鸟苷、侧接两个5′嘌呤和两个3′嘧啶。这些DNA基序的非甲基化形式被证明为几种类型的免疫细胞的有效刺激物。
可以靶向方式递送载体。受体介导的DNA治疗技术描述于(如)参考文献240-245中。在基因治疗方法中，以约100ng-200mg的DNA量给予含有核酸的治疗组合物，以进行局部给药。在基因治疗方法中，DNA浓度范围还可以是约500ng-50mg、约1μg-2mg、约5μg-500μg和约20μg-100μg。各种因素如作用方式(如提高或抑制编码基因产物的水平)以及转化和表达效力均被认为会影响达到最终效力所需的剂量。当需要在较大组织面积上表达得更多时，为了达到阳性治疗结果，可能需要施用更大量的载体、或通过连续给药方式再次施用同样量载体、或多次施用于邻近或附近组织部位。所有这些情况中，临床试验中的常规试验可以确定达到最优疗效所需的特定范围。
可通过基因递送载体进行递送载体。所述基因递送载体可以是病毒或非病毒来源(大致参见参考文献246-249)。
用于递送所需核酸并在所需细胞中的表达的病毒载体为本领域公知。示例性病毒载体包括但不限于重组逆转录病毒(如参考文献250-260)、α病毒载体(如辛德比斯病毒载体、塞姆利基森林病毒(ATCC VR-67；ATCC VR-1247)、罗斯河病毒(ATCCVR-373；ATCC VR-1246)和委内瑞拉马脑炎病毒(ATCC VR-923；ATCCVR-1250；ATCC VR-1249；ATCC VR-532)；还可采用这些病毒的杂交体或嵌合体)、痘病毒载体(如牛痘病毒、禽痘病毒、金丝雀痘病毒、修饰的安卡拉牛痘病毒等)、腺病毒载体、和腺伴随病毒(AAV)载体(如见参考文献261-266)。还可采用与杀死的腺病毒相连的DNA进行给药[267]。
还可采用非病毒递送载体和方法，包括但不限于，单独与杀死的腺病毒连接或不连接的聚阳离子凝聚DNA[如267]、配体连接的DNA[268]、真核细胞递送载体细胞[如，参考文献269-273]和核电荷(nucleic charge)中和或与细胞膜发生融合。还可使用裸露DNA。示例性裸露DNA引入方式描述于参考文献274和275中。可作为基因递送载体的脂质体(如免疫脂质体)描述于参考文献276-280中。其它方式描述于参考文献281和282中。
适用于本发明的其它非病毒递送包括机械递送系统，如描述于参考文献282中的方式。而且，所述编码序列及其表达产物可通过光聚合水凝胶物质的沉积或采用电离辐射进行递送[如参考文献283和284]。可用于递送编码序列的其它基因递送常规方法包括，例如，采用手持式基因转移颗粒枪[285]或采用电离辐射以激活转移基因[283和286]。
采用PLG(丙交酯-乙交酯共聚物)微粒递送DNA为尤其优选的方法，如，通过将DNA吸附到经任选处理以具有负电荷表面(如用SDS处理)或正电荷表面(如用阳离子去污剂如CATB)的微粒上。
概述 所述术语“包含”涵盖“包括”及“由...组成”，如“包含”X的组合物可仅由X组成或可包括其它附加物，如X+Y。
涉及数值x的术语“约”指(例如)x±10％。
所述术语“基本上”并不排除“完全地”，如“基本上不含”Y的组合物可以是完全不含Y。在需要时，术语“基本上”可从本发明的定义中省略。
序列表中的氨基酸序列的N端残基通常为由对应核苷酸序列的第一个密码子编码的氨基酸。当第一密码子不是ATG时(如SEQ ID NO1、7、19、39、43、49、51、55、63、73、119、127、129、137、143、145、147、149、155、159、165、173、181、183、205、209、219、221、229、235、247、263、269、271、297、303、325、327、341、345、359、363、373、395、401、413、443、447、453、459、463、465、469、473、477、479、495、505、507、517、527、533、535、537、539、549、569、575、579、581、583、587、591、593、599、613、621、635、637、643、655、661、665、669、671、681、683、687、693、707、709、721、723、729、743、757、763、765、769、781、791、793、813、817、823、837、839、855、861、865、881、885、897、907、909、911、917、921、941、949、957、965、975、977、979、981、983、989、993、997、1001、1005、1011、1015、1017、1019、1027、1029、1033、1037、1043、1051、1053、1073、1087、1097、1101、1103、1107、1113、1115、1117、1121、1123、1135、1143、1147、1149、1175、1181、1227、1263、1271、1287、1295、1305、1307、1311、1317、1323、1331、1341、1345、1349、1351、1355、1359、1363、1373、1375、1383、1399、1411、1415、1417、1423、1433、1451、1477、1483、1485、1493、1495、1501、1503、1511、1519、1521、1525、1529、1553、1559、1579、1585、1603、1609、1611、1619、1621、1623、1629、1631、1643、1653、1669、1675、1677、1687、1693、1705、1713、1717、1727、1739、1751、1763、1769、1785、1789、1799、1801、1817、1819、1825、1827、1829、1831、1833、1839、1857、1867、1911、1919、1925、1929、1939、1947、1955、1957、1979、1981、1985、1989、1993、1995、2003、2005、2009、2027、2035、2037、2047、2049、2059、2063、2079、2093、2123、2135、2139、2141、2163、2165、2173、2177、2189、2195、2197、2203、2209、2211、2241、2247、2275、2291、2321、2327、2357、2361、2373、2377、2379、2397、2399、2405、2433、2437、2443、2447、2451、2455、2457、2487、2491、2503、2505、2507、2513、2515、2521、2541、2545、2549、2553、2565、2577、2579、2591、2613、2623、2629、2631、2633、2635、2639、2641、2649、2657、2659、2661、2663、2665、2667、2669、2671、2681、2687、2689、2699、2701、2705、2713、2719、2721、2729、2735、2743、2745、2759、2781、2785、2787、2789、2795、2801、2809、2813、2815、2823、2825、2845、2847、2869、2885、2891、2897、2905、2907、2911、2913、2915、2925、2939、2945、2947、2975、2993、3015、3043、3055、3061、3063、3075、3107、3117、3127、3131、3175、3179、3191、3193、3207、3209、3213、3221、3229、3243、3253、3259、3261、3267、3283、3289、3307、3313、3331、3337、3339、3353、3357、3361、3367、3379、3381、3383、3411、3419、3429、3433、3435、3437、3445、3449、3453、3471、3491、3501、3507、3515、3559、3563、3571、3573、3577、3579、3583、3595、3607、3619、3621、3623、3625、3629、3633、3635、3637、3663、3671、3679、3685、3687、3699、3701、3707、3713、3721、3723、3739、3741、3743、3759、3763、3777、3797、3807、3811、3821、3829、3833、3855、3857、3863、3865、3867、3869、3873、3881、3891、3893、3901、3919、3925、3931、3937、3949、3951、3955、3959、3969、3973、3981、3991、4003、4013、4029、4033、4049、4057、4069、4071、4077、4081、4089、4107、4131、4139、4171、4193、4195、4199、4201、4223、4225、4245、4249、4273、4279、4281、4287、4293、4301、4319、4321、4327、4337、4351、4353、4361、4363、4365、4369、4377、4379、4387、4395、4403、4411、4417、4423、4429、4443、4463、4479、4483、4485、4493、4495、4523、4527、4529、4541、4549、4553、4563、4577、4583、4585、4595、4619、4635、4651、4677、4683、4685、4699、4703、4709、4711、4719、4751、4753、4761、4789、4803、4805、4819、4829、4833、4837、4839、4847、4851、4857、4863、4869、4887、4891、4893、4909、4925、4927、4931、4935、4939、4943、4949、4957、4963、4965、4973、5019、5033、5063、5073、5081、5083、5085、5089、5093、5113、5167、5179、5183、5193、5209、5211、5213、5227、5231、5237、5245、5273、5281、5283、5297、5299、5301、5305、5309、5329、5333、5347、5353、5365、5367、5369、5385、5389、5401、5435、5437、5439、5453、5465、5475、5515、5517、5525、5543、5545、5559、5571、5605、5611、5619、5639、5651、5655、5665、5685、5701、5715、5761、5769、5771、5775、5781、5793、5795、5801、5817、5819、5831、5855、5861、5865、5873、5887、5889、5909、5911、5927、5945、5949、5957、5959、5965、5973、5987、5997、6003、6013、6015、6023、6025、6027、6037、6063、6091、6093、6095、6097、6111、6117、6119、6135、6143、6147、6165、6177、6187、6189、6191、6195、6197、6199、6203、6223、6227、6229、6237、6245、6247、6249、6253、6255、6259、6267、6297、6305、6311、6317、6345、6361、6389、6419、6421、6435、6457、6461、6463、6467、6471、6487、6499、6535、6553、6559、6561、6565、6617、6631、6633、6643、6677、6699、6707、6733、6745、6781、6783、6789、6799、6813、6843、6847、6851、6861、6941、6943、6957、6961、6967、6973、6985、6993、6995、7021、7023、7045、7047、7051、7063、7065、7069、7077、7085、7089、7091、7097、7099、7107、7113、7123、7129、7131、7167、7191、7199、7219、7223、7241、7247、7263、7277、7289、7309、7339、7345、7383、7401、7409、7411、7413、7429、7439、7443、7455、7459、7461、7465、7477、7489、7497、7499、7513、7523、7525、7527、7533、7549、7555、7557、7567、7581、7601、7611、7615、7617、7623、7633、7641、7651、7653、7659、7665、7687、7693、7701、7709、7723、7727、7779、7789、7797、7809、7849、7859、7869、7877、7885、7891、7893、7905、7907、7917、7929、7933、7937、7943、7945、7951、7953、7969、7971、8015、8017、8027、8055、8059、8061、8069、8107、8137、8145、8149、8151、8153、8171、8179、8217、8219、8231、8239、8245、8247、8261、8269、8301、8313、8341、8365、8371、8381、8387、8393、8421、8447、8453、8455、8457、8461、8465、8471、8493、8501、8505、8515、8523、8531、8545、8575、8579、8581、8617、8645、8647、8655、8667、8677、8679、8683、8689、8691、8697、8709、8715、8721、8727、8731、8739、8745、8775、8793、8797、8807、8815、8823、8827、8833、8859、8863、8869、8889、8899、8901、8909、8913、8915、8929、8933、8935、8949、8951、8955、8967、8993、8995、8997、9003、9009、9013、9019、9033、9037、9061、9065、9067、9079、9101、9103、9123、9153、9157、9163、9185、9189、9197、9201、9223、9225、9227、9241、9243、9247、9273、9275、9281、9297、9313、9321、9331、9339、9369、9383、9385、9387、9409、9413、9435、9449、9469、9471、9491、9495、9497、9499、9503、9527、9529、9545、9547、9557、9559、9565、9577、9589、9599、9601、9603、9605、9607、9621、9633、9635、9653、9655、9663、9681、9701、9705、9717、9731、9747、9765、9797、9807、9809、9811、9831、9851、9853、9855、9875、9899、9915、9929、9931、9939、9941、9945、9949、9953、9959、9989)，应该理解为当密码子用作起始密码子时应该翻译成甲硫氨酸，而当该序列位于融合伙伴的C端时应该翻译为所示的非甲硫氨酸氨基酸。本发明特别公开并涵盖序列表中每一种以N端甲硫氨酸残基(如甲酰-甲硫氨酸残基)代替任何所示非甲硫氨酸残基的氨基酸序列(如SEQ ID NO236、662、758、770、782、792、838、918、1182、1312、1374、1632、2064、2378、2400、2456、2516、2636、2670、2682、2688、2744、3384、3702、37 14、4058、4678、4704、4804、4806、4848、6026、6112、7022、7242、7710、8582、9682)。它还特别公开并涵盖序列表中每一种从序列内部的任何甲硫氨酸残基开始的氨基酸序列。
如上所述，本发明的核酸和多肽可包括如下序列 (a)与序列表中公开的序列相同(即100％相同)的序列； (b)与序列表中公开的序列有序列相同性的序列； (c)与序列(a)或(b)相比，具有分离或连续的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个单核苷酸或氨基酸改变(缺失、插入、取代)的序列；和 (d)当采用逐对比对算法与序列表的特定序列进行比对时，x个单体(氨基酸或核苷酸)的移动窗口从起点(N端或5′)移到终点(3′C端)，从而对延长至p个单体(p＞x)的比对而言，有p-x+1个此类窗口，每个窗口有至少x·y个相同的比对单体，其中x选自20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200；y选自0.50、0.60、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98、0.99；并且当x·y不是整数时四舍五入为整数。优选的逐对比对算法为Needleman-Wunsch全局比对算法[287]，采用默认参数(如开口开放罚分＝10.0，开口延伸罚分＝0.5，采用EBLOSUM62评分距阵)的。用EMBOSS软件包中的Needle工具很方便地实施该算法[288]。
本发明的核酸和多肽还可能在序列(a)-(d)的N端/5′和/或C端/3′处连有其它序列。
除非另有说明，本发明的实施将采用本领域技术人员能够实施的常规的化学方法、生物化学方法、分子生物学方法、免疫学方法和药理学方法。此类技术已在参考文献中得到充分阐述。见，如，参考文献289-296等。
实验 下面是实施本发明的具体实施方式
的例子。所述例子仅为说明性使用，而不以任何方式限制本发明的范围。
我们努力保证所用数值(如量、温度等)的精确性，然而还是应该允许一些实验性误差和偏差。
实施本发明的方式 MNEC菌株IHE3034 IHE3034是已知的MNEC致病型大肠杆菌菌株。参考文献297的表1报道，IHE3034分为O18K1H7/9血清型，属于ECOR B2类。已知水平转移的DNA元件上的毒力相关性基因是sfaII、ibeA、iro、kps(II型)、fyuA和malX。它还携带编码细胞致死性膨胀毒素的cdt基因簇。
对大肠杆菌K1菌株IHE3034测序产生283个毗连序列群。它们是SEQ ID NO9991-10273，以长度递减的顺序排列。
通过分析大肠杆菌K1菌株IHE3034的基因组序列，鉴定了4995种开放阅读框(ORF)，将它们命名为ORFnnnnn，其中nnnnn是00001-04995的数字。这些ORF的序列为SEQ ID NO1-9990，奇数SEQ ID NO为DNA序列，偶数ID为氨基酸序列。可按下述方法将此nnnnn编号转变为序列表的SEQ ID NO编号就氨基酸序列而言，SEQ IDNO＝nnnnn x 2；就核苷酸序列而言，SEQ ID NO＝[nnnnn x 2]-1。因此，可以在SEQ ID NO2467和2468处找到ORF01234，如表1所示。
表1中给出了4995种ORF的初步功能注释。
表3显示了与共生菌株ORF同源性低的ORF(共计1194个)。优选这些ORF的原因是，在核酸测试和免疫交叉反应性方面，它们相对于共生菌株、对病原性大肠杆菌特异。潜在致病性岛(island)位于ORF00028-70、ORF000330-353、ORF00655-687、ORF00883-910、ORF01031-1058、ORF1078-1119、ORF1186-1228、ORF01313-1376、ORF01479-1514、ORF01523-1543、ORF01550-1578、ORF01810-1865、ORF02295-02315、ORF02351-2375、ORF02382-2405、ORF02436-2472、ORF02788-02816、ORF02844-2891、ORF03011-3056、ORF03340-3365、ORF03499-3522、ORF04416-4439、ORF04661-4679、ORF04915-4930和ORF04946-4966. 根据本发明者采用的不同标准，选择4995种ORF中的142种(2.8％)进行免疫应用。这142种ORF见表2。选择这些ORF的标准包括但不限于与共生性大肠杆菌菌株的ORF的同源性低；长度＞100aa；并且有合适的细胞定位(见表2下部)。
克隆编码这142种蛋白质的基因，在细菌中(例如在非病原性实验室大肠杆菌宿主中或在芽孢杆菌如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)或巨大芽孢杆菌(B.megaterium)中)表达，纯化，然后用于免疫受试动物(如小鼠)。然后，用Western印迹、ELISA和FACS试验分析小鼠中产生的血清，并在体外和体内实验中进一步检测。合适的体外试验包括检测抗体诱导补体介导的细菌杀伤的能力和/或调理吞噬作用的活性、阻断MNEC菌株(或纯化抗原)与人上皮细胞或其它细胞系结合的能力、和/或抑制大肠杆菌(如K1菌株)粘附/侵入脑微血管内皮细胞(BMEC)的能力。检测对菌血症和脑膜炎的效力的合适的体内试验包括在用大肠杆菌K1菌株刺激的5日龄大鼠中进行主动或被动全身性免疫和刺激以及用MNEC菌株免疫和腹膜内感染成年小鼠。
所述蛋白对细菌生活周期的重要性可通过建立等基因敲除突变体来进行检验。所述突变体还可用于确保抗原产生的血清对该抗原的特异性。采用微阵列研究表达模式。通过对来自多种不同ExPEC菌株的序列进行测序来评估保守和变异。
进行试验以选出预测的表面暴露蛋白，其对MNEC菌株具有特异性并在非病原性菌株(共生菌株和试验菌株)中不存在。一旦选中，即表达并纯化这些蛋白，并用于免疫小鼠。
从参考文献43中可知，大肠杆菌任一tol-pal基因的突变都会导致含有天然外膜蛋白的小泡的形成。通过比较MNEC菌株和非病原性菌株的小泡中存在的蛋白，可能选出一小组可用作潜在抗原的蛋白。
共生和病原性大肠杆菌中的λ红介导的基因操作 本方法为基于PCR的快速方法，用于使野生型大肠杆菌菌株中的tolR基因失活[298]。简单地说，步骤1由独立扩增靶基因(tolR)的上游和下游区域以及抗性标记盒组成。将步骤1得到的两种PCR产物与等摩尔浓度的AB盒的扩增机器混合并进行第二轮PCR(三元PCR)，以产生其上游和下游侧接的500bp(或更长)部分与靶基因同源的抗性标记盒。在步骤3中，将大量(1μg)所需直链DNA电穿孔到λ红感受态细胞中。
小泡制备 1.通过TCA沉淀制备小泡 用平板上培养的细菌接种LB培养基，在轻柔振摇下37℃过夜培养。用该培养物接种200ml LB使OD600＝0.1。细菌生长到OD600 0.4(或按规定)。培养物以4000×g离心10分钟，上清液通过0.22mm滤器过滤以除去残留细菌。
在限铁条件下往LB培养基中添加二吡啶基(Dipyridyl)(0.25mM)以进行同样的实验。
通过往培养物上清液中添加终浓度为10％的100％(重量/体积)TCA、0.4％(重量/体积)脱氧胆酸盐来进行沉淀。所述沉淀过程在4℃下进行30分钟。通过在4℃以20000×g离心10分钟回收沉淀。该沉淀以10％TCA(重量/体积)洗涤一次并用纯乙醇洗涤两次。所述沉淀用SpeedVac干燥并保存于-20℃。
对野生型和突变型菌株进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，从中可以观察到突变型菌株上清液中产生的条带远远多于野生型菌株。随机选择的条带证实上清液中的所有蛋白均为膜蛋白。
2.通过超速离心以制备小泡 培养物的上清液在4℃以200000×g超速离心2小时。沉淀以PBS洗涤，重悬于PBS并保存于-20℃。
3.小泡的胍盐变性 在进行胍盐变性前，小泡用乙醇沉淀。通过加入冷的纯乙醇到终浓度为90％沉淀PBS溶液中的10μg OMV。沉淀过程在-20℃下进行20分钟。通过13000×g离心10分钟回收沉淀。将该沉淀重悬于50ml 6M胍盐、15mM DTT、200mM Tris-HCl，pH8.0。变性过程在60℃下进行60分钟。消化之前，溶液用1.5M Tris pH8.0溶液1/8稀释并往所述稀释溶液中添加5mg胰蛋白酶。消化过程在37℃过夜。通过添加终浓度为0.1％的甲酸终止反应。用Oasis抽提试剂盒(cartridge)对肽进行抽提。通过LC耦连MS-MS分析肽。
4.表面消化 将5mg胰蛋白酶加入10mg小泡的PBS溶液中，并在37℃孵育3小时。添加0.1％终浓度的甲酸终止反应。通过30Kda截断滤器过滤回收肽，用Oasis抽提试剂盒进行抽提。通过LC耦连MS-MS分析肽。
小泡分析 蛋白定量 用Bradford法、以BSA作为标准品进行蛋白定量。
SDS-PAGE 采用十二烷基硫酸钠(SDS)4-12％聚丙烯酰胺凝胶和Mini-protean II电泳装置分析样品。将样品悬浮于SDS样品缓冲液中(0.06M Tris-HCl pH6.8、10％(体积/体积)甘油、2％(重量/体积)SDS、5％(体积/体积)2-巯基乙醇、10mg/ml溴酚蓝)并加热到100℃5分钟，然后进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后，凝胶用考马斯蓝染色。
MALDI-TOF质谱测定 从凝胶中将蛋白条带和蛋白点切下，用50mM碳酸氢铵/乙腈(50/50，体积/体积)洗涤，并用SpeedVac离心(Savant)干燥。加入7-10ml含有5mM碳酸氢铵、0.012mg测序级胰蛋白酶的溶液于37℃消化干燥的蛋白点2小时。消化后，吸取0.6ml加到预点阵列靶(matrix pre-spotted target)上并空气干燥。蛋白点用0.6ml含有70％乙醇、0.1％三氟醋酸的溶液洗涤。从超挠性(ultraflex)MALDI-TOF质谱仪上获得质谱信息。谱型信息采用靶上预点的标准品组合进行外部校准。采用Mascot程序对质量范围在700-3,000Da内的试验生成的肽的同位素单峰与计算机生成的指纹进行自动或手工比较以鉴定蛋白。
二维电泳 将200mg小泡重悬于Immobiline再溶胀溶液(7M尿素、2M硫脲、2％(重量/体积)CHAPS、(2％重量/体积)ASB14、2％(体积/体积)IPG缓冲液pH 3-10NL、2mM TBP、65mM DTT)，并过夜吸附于7厘米的Immobiline DryStrip(pH3-10NL)柱。然后经2维电泳分离蛋白。第一维电泳的进行采用IPGphor等电位聚焦单位，连续施加150伏电压35分钟、500伏35分钟、1,000伏30分钟、2,600伏10分钟、3,500伏15分钟、4,200伏15分钟，最后施加5,000伏至10kVh。对于第二维电泳，条带在4M尿素、2M硫脲、30％甘油、2％SDS、5mM TBP、50mM Tris HCl pH8.8、2.5％丙烯酰胺、0.2％溴酚蓝中孵育2次10分钟以平衡。然后，在线性4-12％预制聚丙烯酰胺凝胶上分离蛋白。
凝胶用胶质考马斯蓝染色，并用个人光密度计SI扫描。图像用Image Master 2DElite软件进行分析。
纳米-LC/MS/MS 肽由连接于装有纳米喷射源的Q-ToF Micro ESI质谱仪的CapLC HPLC系统上的纳米LC进行分离。通过一个C18收集柱(300μm i.d.×5mm)将样品装入Atlantis C18NanoEase柱(100μm i.d.×100mm)。50分钟内以400nl/分钟的流速用2％-60％的溶于0.1％甲酸溶液的95％ACN的梯度进行洗脱。经洗提的肽采用MassLynx软件(4.0版)进行自动的数据依赖型采集程序，其中用MS测量扫描在400-2,000的m/z范围内自动选择多电荷肽以进行进一步的MS/MS片段化。最多有3种不同组分同时进行MS/MS片段化。采集到数据之后，用MassLynx对单个MS/MS谱型数据进行组合、校平和确定质心。通过MASCOT的授权版本的批量模式对肽进行检索和鉴定。所述MASCOT检索参数为(1)种ExPEC；(2)允许的切割失败数目(仅针对胰蛋白酶水解)6；(3)可变的翻译后修饰甲硫氨酸氧化；(4)肽容限±500ppm；(5)MS/MS容限±0.3Da和(6)肽电荷从+1到+4。就前述平台而言，仅考虑由MASCOT概率分析确定的显著命中。接受至少一种肽的蛋白测定结果的分数阈值由MASCOT设定，胰蛋白酶消化的阈值为18，蛋白酶K消化的阈值为36。
结果 上述分析的结果为，鉴定了10种优选抗原。即orf03526(SEQ ID No7051+7052)、orf01339(SEQ ID No2677+2678)、orf00256(SEQ ID No511+512)、orf01346(SEQ ID No2691+2692)、orf04084(SEQ ID No8167+8168)、orf02374(SEQID No4747+4748)、orf03 502(SEQ ID No7003+7004)、orf02298(SEQ ID No4595+4596)、orf01228(SEQ ID No2455+2456)、orf01227(SEQ ID No2453+2454)、orf02314(SEQ ID NO4627+4628)和orf02850(SEQ ID NO5699+5700)。见表4，其中也给出了这些蛋白与UPEC菌株CFT073中的蛋白的相同性。其它优选抗原是与用上述相同方法鉴定的CFT073菌株的优选抗原的相同性大于60％的抗原。这些优选抗原是orf04282(SEQ ID No8563+8564)、orf01364(SEQ ID No2727+2728)、orf04936(SEQ ID No9871+9872)、orf02336(SEQ ID No4671+4672)、orf02840(SEQ ID No5679+5680)、orf00267(SEQ ID No533+534)、orf01611(SEQ ID No3221+3222)、orf01613(SEQ ID No3225+3226)和orf03502(SEQ ID No7003+7004)。
抗原分析 全身感染的小鼠模型 为了筛选由对病原性和非病原性大肠杆菌菌株进行的比较基因组分析所选出来的大量抗原，建立了基于经典毒力试验的保护模型。
实验模型(免疫和感染)采用5周龄的CD1远交小鼠，采用腹膜内接种有毒力的IHE3034大肠杆菌菌株进行刺激。刺激剂量通过试验确定为能够在72小时内杀死80％成年小鼠的细菌量，对IHE3034菌株而言，该剂量对应为1×107cfu/只小鼠。
将称为毒力因子和潜在保护性抗原的两种蛋白用作阳性对照。这些蛋白是IbeA[299]和IroN(SEQ ID No2691、2692和参考文献300、301)。表达重组蛋白，并用于免疫实验。
免疫方法 通过皮下注射150μl使用弗氏佐剂的蛋白溶液免疫小鼠3次，如下表所示 在第一次免疫前一天(免疫前血清)、第34天和第48天(刺激前一天)收集血样，用western印迹和ELISA试验检测免疫小鼠的血清以测定抗体效价。
刺激 在第48天，用大肠杆菌IHE3034的冻存液在LB琼脂平板上划线，在培养箱中于37℃培养过夜(ON)。在第49天用所述ON平板-培养物接种50ml LB培养基，直到O.D.600＝0.1，并在37℃振摇培养1.5小时，直到细菌培养物达到O.D.600＝0.6，其对应为5×108cfu/ml的IHE3034菌株。用生理溶液稀释该培养物，直到细菌浓度为1×108/ml (一般用8ml生理溶液稀释2ml细菌培养物)，并用标准的平板计数法铺板，以核实接种物。用1ml注射器将含有1×107IHE3034细菌的100μl细胞悬液注射到对照和免疫小鼠的腹膜内。记录感染24、48和72小时后各动物组的死亡数。
通过比较刺激72小时后小鼠疫苗接种组中的存活率和对照组中的存活率，来评估由于接种疫苗所获得的保护。由下式计算相对于对照的存活率百分比
结果 如上所述用阳性对照IroN和IbeA进行免疫。如图3和4所示，用IroN或IbeA免疫后，再用IHE3034刺激的％小鼠存活率升高。
用热灭活的IHE3034进行免疫。如图1所示，用热灭活的IHE3034免疫后，再用IHE3034刺激的％小鼠存活率升高。
也用IHE3034ΔTol-R的小泡进行免疫。如图2所示，用IHE3034ΔTol-R免疫后，再用IHE3034刺激的％小鼠存活率升高。
免疫研究 选择抗原组合得到本发明组合物。BALB/c小鼠被分成9组并按照如下方式进行免疫 以2周间隔免疫小鼠。最后一次免疫后2-3周，用合适的MNEC菌株刺激所有小鼠。当采用粘膜免疫(如鼻内)时，也以粘膜方式刺激动物模型以测试粘膜免疫原的保护效果。临近刺激前，对小鼠采血以检测针对所给予抗原的抗体的效价。
就小鼠刺激而言，有毒力的细菌要在合适的培养基中生长。通过离心收获细菌，重悬，连续稀释成刺激接种物。对BALB/c小鼠进行刺激并在接触后30天内每天观察。
可以采用完整细菌和纯化重组蛋白的ELISA试验来测定不同免疫方案产生的小鼠血清中的总IgG和IgG1/IgG2A亚型。而且，可通过多参数FACS分析评价分离自免疫接种小鼠的脾细胞和/或PBMC中的抗原特异性CD4+和CD8+Th细胞，以评估抗原特异性T细胞的细胞因子表达情况。具体地，IFN-γ和IL-5的产量可在用纯化抗原体外刺激T细胞之后进行测量。此外，用各抗原/疫苗制剂免疫的小鼠的脾细胞和/或PBMC可以在最后一次免疫剂量后10-12天收集，并用MNEC细菌来刺激。经过4小时的刺激之后，往后的12个小时内往细胞中加入布雷菲德菌素A以阻断细胞因子分泌。然后，固定细胞并用抗体染色，以检测表达IFN-γ和IL-5的MNEC特异性T细胞。
可以通过本领域技术人员了解的各种方法从外周血淋巴细胞(PBL)中分离T细胞。例如，可以通过去除辅助细胞和B细胞从PBL群中“富集”T细胞群。具体地，可使用抗MHC II类单克隆抗体清除非T细胞来富集T细胞。类似地，其它抗体可用于消耗特定的非T细胞群。例如，抗Ig抗体分子可用于消耗B细胞，抗MacI抗体分子可用于消耗巨噬细胞。
还可用本领域技术人员已知技术将T细胞分成许多不同的亚群。两类主要的亚群可以基于其细胞表面标记CD4和CD8的表达差异进行分离。例如，在上述T细胞富集之后，可采用对CD4特异性的抗体富集CD4+细胞。所述抗体可以偶联于固体支持物如磁珠上。相反地，CD8+细胞可使用对CD4特异性的抗体进行富集(去除CD4+细胞)，或可使用偶联于固体支持物的CD8抗体进行分离。在转导之前或之后，可以离体扩增感染MNEC的患者的CD4淋巴细胞。
T细胞纯化之后，纯化的T细胞用各种细胞因子(包括但不限于rIL-2、IL-10、IL-12和IL-15)进行预刺激，以促进淋巴细胞的生长和活化。
可以用上述免疫原性多肽进行活化MNEC特异性T细胞。MNEC特异性T细胞可以是CD8+或CD4+。MNEC特异性CD8+T细胞可以是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，其能杀死呈现与MHC I类分子复合的任何上述多肽或其片段的MNEC感染细胞。衣原体特异性CD8+T细胞可以通过如51Cr释放试验进行检测。51Cr释放试验检测MNEC特异性CD8+T细胞裂解呈现一种或多种这些表位的靶细胞的能力。本发明还考虑了表达抗病毒物质如IFNγ的MNEC特异性CD8+T细胞，它们也可通过免疫学方法进行检测，优选用一种或多种上述MNEC多肽进行体外刺激后对IFNγ或类似细胞因子进行细胞内染色来检测。MNEC特异性CD4+T细胞可以通过淋巴增殖试验进行检测。淋巴增殖试验检测MNEC特异性CD4+T细胞对一种或多种上述多肽应答而增殖的能力。
应该理解，本发明仅通过实施例的方式进行描述，可以在本发明的范围和精神内进行改变。
表1-ORF00001-ORF04995的注释 表2-142种优选抗原 ORF00010ORF00017ORF00029ORF00041ORF00130ORF00250 ORF00251ORF00252ORF00332ORF00333ORF00342ORF00353 ORF00394ORF00405ORF00469ORF00631ORF00773ORF00905 ORF00908ORF01034ORF01037ORF01056ORF01090ORF01103 ORF01104ORF01108ORF01115ORF01118ORF01119ORF01194 ORF01202ORF01207ORF01208ORF01214ORF01228ORF01236 ORF01337ORF01338ORF01339ORF01340ORF01341ORF01342 ORF01344ORF01348ORF01349ORF01350ORF01351ORF01365 ORF01371ORF01462ORF01477ORF01491ORF01503ORF01506 ORF01589ORF01590ORF01592ORF01656ORF01660ORF01705 ORF01722ORF01723ORF01855ORF01932ORF02307ORF02314 ORF02392ORF02412ORF02424ORF02470ORF02554ORF02735 ORF02816ORF02828ORF02829ORF02830ORF02831ORF02832 ORF02833ORF02834ORF02847ORF02866ORF02868ORF02878 ORF02888ORF03011ORF03020ORF03021ORF03025ORF03044 ORF03166ORF03174ORF03176ORF03235ORF03252ORF03262 ORF03300ORF03348ORF03349ORF03364ORF03459ORF03501 ORF03504ORF03507ORF03512ORF03515ORF03516ORF03517 ORF03518ORF03519ORF03520ORF03522ORF03535ORF03539 ORF03540ORF03541ORF03542ORF03575ORF03576ORF03579 ORF03580ORF03613ORF04162ORF04163ORF04184ORF04203 ORF04204ORF04282ORF04390ORF04391ORF04402ORF04477 ORF04608ORF04693ORF04694ORF04844ORF04845ORF04849 ORF04851ORF04922ORF04924ORF04925 胞质定位ORF00252、ORF01056、ORF01337、ORF01341、ORF01344、ORF01348、ORF01371、 ORF01477、ORF02424、ORF02833、ORF03348、ORF03504、ORF03542、ORF04162、ORF04844. 内膜定位ORF00010、ORF00017、ORF00029、ORF00041、ORF00130、ORF00332、ORF00333、 ORF00342、ORF00353、ORF00394、ORF00405、ORF00631、ORF00773、ORF00905、ORF01034、 ORF01037、ORF01090、ORF01103、ORF01104、ORF01108、ORF01115、ORF01118、ORF01119、 ORF01194、ORF01202、ORF01207、ORF01208、ORF01214、ORF01338、ORF01339、ORF01349、 ORF01350、ORF01365、ORF01462、ORF01491、ORF01503、ORF01506、ORF01590、ORF01705、 ORF01722、ORF01723、ORF01855、ORF01932、ORF02314、ORF02392、ORF02412、ORF02470、 ORF02554、ORF02735、ORF02847、ORF02868、ORF02878、ORF02888、ORF03020、ORF03021、 ORF03025、ORF03044、ORF03174、ORF03176、ORF03235、ORF03300、ORF03349、ORF03364、 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·％ID比对长度上相同残基的百分数
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权利要求
1.一种多肽，其包含(a)选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO 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22、8224、8226、8228、8230、8232、8234、8236、8238、8240、8242、8244、8246、8248、8250、8252、8254、8256、8258、8260、8262、8264、8266、8268、8270、8272、8274、8276、8278、8280、8282、8284、8286、8288、8290、8292、8294、8296、8298、8300、8302、8304、8306、8308、8310、8312、8314、8316、8318、8320、8322、8324、8326、8328、8330、8332、8334、8336、8338、8340、8342、8344、8346、8348、8350、8352、8354、8356、8358、8360、8362、8364、8366、8368、8370、8372、8374、8376、8378、8380、8382、8384、8386、8388、8390、8392、8394、8396、8398、8400、8402、8404、8406、8408、8410、8412、8414、8416、8418、8420、8422、8424、8426、8428、8430、8432、8434、8436、8438、8440、8442、8444、8446、8448、8450、8452、8454、8456、8458、8460、8462、8464、8466、8468、8470、8472、8474、8476、8478、8480、8482、8484、8486、8488、8490、8492、8494、8496、8498、8500、8502、8504、8506、8508、8510、8512、8514、8516、8518、8520、8522、8524、8526、8528、8530、8532、8534、8536、8538、8540、8542、8544、8546、8548、8550、8552、8554、8556、8558、8560、8562、8564、8566、8568、8570、8572、8574、8576、8578、8580、8582、8584、8586、8588、8590、8592、8594、8596、8598、8600、8602、8604、8606、8608、8610、8612、8614、8616、8618、8620、8622、8624、8626、8628、8630、8632、8634、8636、8638、8640、8642、8644、8646、8648、8650、8652、8654、8656、8658、8660、8662、8664、8666、8668、8670、8672、8674、8676、8678、8680、8682、8684、8686、8688、8690、8692、8694、8696、8698、8700、8702、8704、8706、8708、8710、8712、8714、8716、8718、8720、8722、8724、8726、8728、8730、8732、8734、8736、8738、8740、8742、8744、8746、8748、8750、8752、8754、8756、8758、8760、8762、8764、8766、8768、8770、8772、8774、8776、8778、8780、8782、8784、8786、8788、8790、8792、8794、8796、8798、8800、8802、8804、8806、8808、8810、8812、8814、8816、8818、8820、8822、8824、8826、8828、8830、8832、8834、8836、8838、8840、8842、8844、8846、8848、8850、8852、8854、8856、8858、8860、8862、8864、8866、8868、8870、8872、8874、8876、8878、8880、8882、8884、8886、8888、8890、8892、8894、8896、8898、8900、8902、8904、8906、8908、8910、8912、8914、8916、8918、8920、8922、8924、8926、8928、8930、8932、8934、8936、8938、8940、8942、8944、8946、8948、8950、8952、8954、8956、8958、8960、8962、8964、8966、8968、8970、8972、8974、8976、8978、8980、8982、8984、8986、8988、8990、8992、8994、8996、8998、9000、9002、9004、9006、9008、9010、9012、9014、9016、9018、9020、9022、9024、9026、9028、9030、9032、9034、9036、9038、9040、9042、9044、9046、9048、9050、9052、9054、9056、9058、9060、9062、9064、9066、9068、9070、9072、9074、9076、9078、9080、9082、9084、9086、9088、9090、9092、9094、9096、9098、9100、9102、9104、9106、9108、9110、9112、9114、9116、9118、9120、9122、9124、9126、9128、9130、9132、9134、9136、9138、9140、9142、9144、9146、9148、9150、9152、9154、9156、9158、9160、9162、9164、9166、9168、9170、9172、9174、9176、9178、9180、9182、9184、9186、9188、9190、9192、9194、9196、9198、9200、9202、9204、9206、9208、9210、9212、9214、9216、9218、9220、9222、9224、9226、9228、9230、9232、9234、9236、9238、9240、9242、9244、9246、9248、9250、9252、9254、9256、9258、9260、9262、9264、9266、9268、9270、9272、9274、9276、9278、9280、9282、9284、9286、9288、9290、9292、9294、9296、9298、9300、9302、9304、9306、9308、9310、9312、9314、9316、9318、9320、9322、9324、9326、9328、9330、9332、9334、9336、9338、9340、9342、9344、9346、9348、9350、9352、9354、9356、9358、9360、9362、9364、9366、9368、9370、9372、9374、9376、9378、9380、9382、9384、9386、9388、9390、9392、9394、9396、9398、9400、9402、9404、9406、9408、9410、9412、9414、9416、9418、9420、9422、9424、9426、9428、9430、9432、9434、9436、9438、9440、9442、9444、9446、9448、9450、9452、9454、9456、9458、9460、9462、9464、9466、9468、9470、9472、9474、9476、9478、9480、9482、9484、9486、9488、9490、9492、9494、9496、9498、9500、9502、9504、9506、9508、9510、9512、9514、9516、9518、9520、9522、9524、9526、9528、9530、9532、9534、9536、9538、9540、9542、9544、9546、9548、9550、9552、9554、9556、9558、9560、9562、9564、9566、9568、9570、9572、9574、9576、9578、9580、9582、9584、9586、9588、9590、9592、9594、9596、9598、9600、9602、9604、9606、9608、9610、9612、9614、9616、9618、9620、9622、9624、9626、9628、9630、9632、9634、9636、9638、9640、9642、9644、9646、9648、9650、9652、9654、9656、9658、9660、9662、9664、9666、9668、9670、9672、9674、9676、9678、9680、9682、9684、9686、9688、9690、9692、9694、9696、9698、9700、9702、9704、9706、9708、9710、9712、9714、9716、9718、9720、9722、9724、9726、9728、9730、9732、9734、9736、9738、9740、9742、9744、9746、9748、9750、9752、9754、9756、9758、9760、9762、9764、9766、9768、9770、9772、9774、9776、9778、9780、9782、9784、9786、9788、9790、9792、9794、9796、9798、9800、9802、9804、9806、9808、9810、9812、9814、9816、9818、9820、9822、9824、9826、9828、9830、9832、9834、9836、9838、9840、9842、9844、9846、9848、9850、9852、9854、9856、9858、9860、9862、9864、9866、9868、9870、9872、9874、9876、9878、9880、9882、9884、9886、9888、9890、9892、9894、9896、9898、9900、9902、9904、9906、9908、9910、9912、9914、9916、9918、9920、9922、9924、9926、9928、9930、9932、9934、9936、9938、9940、9942、9944、9946、9948、9950、9952、9954、9956、9958、9960、9962、9964、9966、9968、9970、9972、9974、9976、9978、9980、9982、9984、9986、9988和9990；(b)与氨基酸序列(a)的序列相同性至少为80％的氨基酸序列；(c)作为氨基酸序列(a)中至少10个连续氨基酸的片段的氨基酸序列；或(d)与氨基酸序列(a)的序列相同性至少为80％并包含氨基酸序列(a)中至少10个连续氨基酸的片段的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的多肽，其包含(a)选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO512、2454、2456、2678、2692、4596、4748、7004、7052、8168、4628和5700；(b)与氨基酸序列(a)的序列相同性至少为80％的氨基酸序列；(c)作为氨基酸序列(a)中至少10个连续氨基酸的片段的氨基酸序列；或(d)与氨基酸序列(a)的序列相同性至少为80％并包含氨基酸序列(a)中至少10个连续氨基酸的片段的氨基酸序列。
3.如权利要求1所述的多肽，其包含(a)选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO8564、2728、9872、4672、5680、534、3222、3226和7004；(b)与氨基酸序列(a)的序列相同性至少为80％的氨基酸序列；(c)作为氨基酸序列(a)中至少10个连续氨基酸的片段的氨基酸序列；或(d)与氨基酸序列(a)的序列相同性至少为80％并包含氨基酸序列(a)中至少10个连续氨基酸的片段的氨基酸序列。
4.如权利要求1-3中任一项所述的多肽，其特征在于，所述片段包含至少一个(a)的B细胞表位。
5.如权利要求1-4中任一项所述的多肽，所述多肽用于药物。
6.一种核酸，其包含(a)选自下组的核苷酸序列SEQ ID NO 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8223、8225、8227、8229、8231、8233、8235、8237、8239、8241、8243、8245、8247、8249、8251、8253、8255、8257、8259、8261、8263、8265、8267、8269、8271、8273、8275、8277、8279、8281、8283、8285、8287、8289、8291、8293、8295、8297、8299、8301、8303、8305、8307、8309、8311、8313、8315、8317、8319、8321、8323、8325、8327、8329、8331、8333、8335、8337、8339、8341、8343、8345、8347、8349、8351、8353、8355、8357、8359、8361、8363、8365、8367、8369、8371、8373、8375、8377、8379、8381、8383、8385、8387、8389、8391、8393、8395、8397、8399、8401、8403、8405、8407、8409、8411、8413、8415、8417、8419、8421、8423、8425、8427、8429、8431、8433、8435、8437、8439、8441、8443、8445、8447、8449、8451、8453、8455、8457、8459、8461、8463、8465、8467、8469、8471、8473、8475、8477、8479、8481、8483、8485、8487、8489、8491、8493、8495、8497、8499、8501、8503、8505、8507、8509、8511、8513、8515、8517、8519、8521、8523、8525、8527、8529、8531、8533、8535、8537、8539、8541、8543、8545、8547、8549、8551、8553、8555、8557、8559、8561、8563、8565、8567、8569、8571、8573、8575、8577、8579、8581、8583、8585、8587、8589、8591、8593、8595、8597、8599、8601、8603、8605、8607、8609、8611、8613、8615、8617、8619、8621、8623、8625、8627、8629、8631、8633、8635、8637、8639、8641、8643、8645、8647、8649、8651、8653、8655、8657、8659、8661、8663、8665、8667、8669、8671、8673、8675、8677、8679、8681、8683、8685、8687、8689、8691、8693、8695、8697、8699、8701、8703、8705、8707、8709、8711、8713、8715、8717、8719、8721、8723、8725、8727、8729、8731、8733、8735、8737、8739、8741、8743、8745、8747、8749、8751、8753、8755、8757、8759、8761、8763、8765、8767、8769、8771、8773、8775、8777、8779、8781、8783、8785、8787、8789、8791、8793、8795、8797、8799、8801、8803、8805、8807、8809、8811、8813、8815、8817、8819、8821、8823、8825、8827、8829、8831、8833、8835、8837、8839、8841、8843、8845、8847、8849、8851、8853、8855、8857、8859、8861、8863、8865、8867、8869、8871、8873、8875、8877、8879、8881、8883、8885、8887、8889、8891、8893、8895、8897、8899、8901、8903、8905、8907、8909、8911、8913、8915、8917、8919、8921、8923、8925、8927、8929、8931、8933、8935、8937、8939、8941、8943、8945、8947、8949、8951、8953、8955、8957、8959、8961、8963、8965、8967、8969、8971、8973、8975、8977、8979、8981、8983、8985、8987、8989、8991、8993、8995、8997、8999、9001、9003、9005、9007、9009、9011、9013、9015、9017、9019、9021、9023、9025、9027、9029、9031、9033、9035、9037、9039、9041、9043、9045、9047、9049、9051、9053、9055、9057、9059、9061、9063、9065、9067、9069、9071、9073、9075、9077、9079、9081、9083、9085、9087、9089、9091、9093、9095、9097、9099、9101、9103、9105、9107、9109、9111、9113、9115、9117、9119、9121、9123、9125、9127、9129、9131、9133、9135、9137、9139、9141、9143、9145、9147、9149、9151、9153、9155、9157、9159、9161、9163、9165、9167、9169、9171、9173、9175、9177、9179、9181、9183、9185、9187、9189、9191、9193、9195、9197、9199、9201、9203、9205、9207、9209、9211、9213、9215、9217、9219、9221、9223、9225、9227、9229、9231、9233、9235、9237、9239、9241、9243、9245、9247、9249、9251、9253、9255、9257、9259、9261、9263、9265、9267、9269、9271、9273、9275、9277、9279、9281、9283、9285、9287、9289、9291、9293、9295、9297、9299、9301、9303、9305、9307、9309、9311、9313、9315、9317、9319、9321、9323、9325、9327、9329、9331、9333、9335、9337、9339、9341、9343、9345、9347、9349、9351、9353、9355、9357、9359、9361、9363、9365、9367、9369、9371、9373、9375、9377、9379、9381、9383、9385、9387、9389、9391、9393、9395、9397、9399、9401、9403、9405、9407、9409、9411、9413、9415、9417、9419、9421、9423、9425、9427、9429、9431、9433、9435、9437、9439、9441、9443、9445、9447、9449、9451、9453、9455、9457、9459、9461、9463、9465、9467、9469、9471、9473、9475、9477、9479、9481、9483、9485、9487、9489、9491、9493、9495、9497、9499、9501、9503、9505、9507、9509、9511、9513、9515、9517、9519、9521、9523、9525、9527、9529、9531、9533、9535、9537、9539、9541、9543、9545、9547、9549、9551、9553、9555、9557、9559、9561、9563、9565、9567、9569、9571、9573、9575、9577、9579、9581、9583、9585、9587、9589、9591、9593、9595、9597、9599、9601、9603、9605、9607、9609、9611、9613、9615、9617、9619、9621、9623、9625、9627、9629、9631、9633、9635、9637、9639、9641、9643、9645、9647、9649、9651、9653、9655、9657、9659、9661、9663、9665、9667、9669、9671、9673、9675、9677、9679、9681、9683、9685、9687、9689、9691、9693、9695、9697、9699、9701、9703、9705、9707、9709、9711、9713、9715、9717、9719、9721、9723、9725、9727、9729、9731、9733、9735、9737、9739、9741、9743、9745、9747、9749、9751、9753、9755、9757、9759、9761、9763、9765、9767、9769、9771、9773、9775、9777、9779、9781、9783、9785、9787、9789、9791、9793、9795、9797、9799、9801、9803、9805、9807、9809、9811、9813、9815、9817、9819、9821、9823、9825、9827、9829、9831、9833、9835、9837、9839、9841、9843、9845、9847、9849、9851、9853、9855、9857、9859、9861、9863、9865、9867、9869、9871、9873、9875、9877、9879、9881、9883、9885、9887、9889、989 1、9893、9895、9897、9899、9901、9903、9905、9907、9909、9911、9913、9915、9917、9919、9921、9923、9925、9927、9929、9931、9933、9935、9937、9939、9941、9943、9945、9947、9949、9951、9953、9955、9957、9959、9961、9963、9965、9967、9969、9971、9973、9975、9977、9979、9981、9983、9985、9987和9989；(b)与氨基酸序列(a)的序列相同性至少为80％的核苷酸序列；(c)作为核苷酸序列(a)中至少10个连续核苷酸的片段的核苷酸序列；或(d)与核苷酸序列(a)的序列相同性至少为80％并包含核苷酸序列(a)中至少10个连续核苷酸的片段的核苷酸序列。
7.如权利要求6所述的核酸，其包含(a)选自下组的核苷酸序列SEQ ID NO511、2453、2455、2677、2691、4595、4747、7003、7051、8167、4627和5699；(b)与氨基酸序列(a)的序列相同性至少为80％的核苷酸序列；(c)作为核苷酸序列(a)中至少10个连续核苷酸的片段的核苷酸序列；或(d)与核苷酸序列(a)的序列相同性至少为80％并包含核苷酸序列(a)中至少10个连续核苷酸的片段的核苷酸序列。
8.如权利要求6所述的核酸，其包含(a)选自下组的核苷酸序列SEQ ID NO8563、2727、9871、4671、5679、533、3221、3225和7003；(b)与氨基酸序列(a)的序列相同性至少为80％的核苷酸序列；(c)作为核苷酸序列(a)中至少10个连续核苷酸的片段的核苷酸序列；或(d)与核苷酸序列(a)的序列相同性至少为80％并包含核苷酸序列(a)中至少10个连续核苷酸的片段的核苷酸序列。
9.如权利要求6-8中任一项所述的核酸，其编码权利要求1、2、3或4所述的多肽。
10.如权利要求1-4中任一项所述的多肽的特异性单克隆抗体。
11.一种药物组合物，其包含与药学上可接受的载体混合的权利要求1-4中任一项所述的多肽、权利要求1-9中任一项所述的核酸或权利要求10所述的抗体。
12.一种药物组合物，其包含与药学上可接受的载体混合的权利要求1-4中所述的两种或多种多肽。
13.如权利要求10或11所述的组合物，还包含疫苗佐剂。
14.一种免疫原性组合物，其包含表达或过度表达下组编码的一种或多种多肽的一种或多种外膜泡(OMV)(a)选自下组的核苷酸序列SEQ ID NO 511、2453、2455、2677、2691、4595、4747、7003、7051、8167、4627和5699；(b)与氨基酸序列(a)的序列相同性至少为80％的核苷酸序列；(c)作为核苷酸序列(a)中至少10个连续核苷酸的片段的核苷酸序列；或(d)与核苷酸序列(a)的序列相同性至少为80％并包含核苷酸序列(a)中至少10个连续核苷酸的片段的核苷酸序列。
15.一种免疫原性组合物，其包含表达或过度表达下组编码的一种或多种多肽的一种或多种外膜泡(OMV)(a)选自下组的核苷酸序列SEQ ID NO 8563、2727、9871、4671、5679、533、3221、3225和7003；(b)与氨基酸序列(a)的序列相同性至少为80％的核苷酸序列；(c)作为核苷酸序列(a)中至少10个连续核苷酸的片段的核苷酸序列；或(d)与核苷酸序列(a)的序列相同性至少为80％并包含核苷酸序列(a)中至少10个连续核苷酸的片段的核苷酸序列。
16.如权利要求14或15所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述片段包含至少一个(a)的B细胞表位。
17.如权利要求1-4中任一项所述的多肽，或如权利要求6-9中任一项所述的核酸，或如权利要求10所述的抗体，或如权利要求14-16中任一项所述的免疫原性组合物在制备用于在患者中产生免疫应答的药物中的应用。
18.一种在患者中产生免疫应答的方法，所述方法包括给予所述患者如权利要求10-12中任一项所述的药物组合物或者如权利要求14-16中任一项所述的免疫原性组合物的步骤。
19.如权利要求17所述的应用，或如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述免疫应答保护个体免受ExPEC感染，尤其免受MNEC感染。
全文摘要
本文公开了引起新生儿脑膜炎(MNEC)的大肠杆菌菌株的各种开放阅读框，以及在制备能引起对MNEC感染的免疫力的组合物中特别感兴趣的它们的子集。
文档编号C07K14/245GK101203529SQ200680012378
公开日2008年6月18日 申请日期2006年2月17日 优先权日2005年2月18日
发明者M·皮扎, L·塞里诺, V·马西格纳尼, H·特特林, 弗朗西斯科·贝尔兰达斯科扎 申请人:诺华疫苗和诊断公司, J.克莱格凡特研究所有限公司