专利名称：：用于检测抗药egfr突变体的方法和组合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种用于检验表皮生长因子受体(EGFR)基因或EGFR蛋白中突变的方法，这种突变是抗某些定向抑制EGFR癌疗法的潜在原因。本发明进一步涉及用于开发抑制所述突变EGFR的新疗法的方法。
背景技术：
：表皮生长因子受体(EGFR)已被确定为治疗实体瘤的相关靶，因为其参与调节在癌细胞增殖和存活中重要的细胞功能。EGFR常常被表达于多种肺瘤中，而且高表达经常涉及差的预后。目前已出现一类新型的定向抑制EGFR靶向疗法，酪氨酸激酶抑制剂。两个已知的实例为吉非替尼(易瑞沙)(geitinib(Iressa))或厄洛替尼(特罗凯)(erlotinib(Tarceva))。尽管有些患者对这些疗法初始响应，但是患者最终发展未知机制的"获得性"抗性。EGFR已被认为在肺癌中发挥了重要的作用。但是，仅有小部分的非小细胞肺癌(NSCLC)对易瑞沙或特罗凯有响应(参见图1的结构)。源自对酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼或厄洛替尼响应患者的肺腺癌，通常在编码EGFR酪氨酸激酶区域的外显子中隐藏着体细胞功能获得性突变。在大约10%来自美国的NSCLC中发现了这种突变[1,2,3]，在东亚观察到更高的发生率[2,4,5,6]。约90%的NSCLC相关突变发生为外显子19中多核苷酸符合读框的缺失，包括消除四种氨基酸，Leu-Arg-Glu-Ala,或者发生为外显子21中核苷酸2573处单个核香酸替换(T—G)，导致在858(L859R)位精氨酸替换亮氨酸。这些突变都与对小分子激酶抑制剂吉非替尼或厄洛替尼的敏感性相关[1,2,3]。不幸的是，几乎所有经历了这些药物显著改善的患者最终发展了疾病的进程。尽管KRAS(v-Ki-ras2,Kirsten鼠肉瘤病毒癌基因同系物，RAS家族成员)突变已与某些原发性抗吉非替尼或厄洛替尼的案例相关[7],但是潜在的"获得性"或"继发性"抗性的机理尚未知晓。因此，在现有技术中存在确定这种抗性潜在原因的需要，以便于可以开发一种诊断性检验并且提供一种更有效的治疗。而且，在现有技术中存在新化合物的需要，该新化合物能够治疗虽然对目前EGFR抑制剂初始响应但是表现为癌进展或复发的患者。发明概述本发明提供了定向检测EGFR突变体C"VT(在EGFRcDNA的碱基2369相应位置上)的聚合酶链式反应引物。这种突变编码了EGFR蛋白中790位的变化，从野生型中的苏氨酸成为突变体中的曱硫氨酸。在用吉非替尼或厄洛替尼治疗前或早期，在患者中稀少表现为这种突变。但是由于该突变消除了对这些药物敏感性，隐藏着突变的癌细胞被阳性地选择，导致患者对进一步治疗产生顽固性。本发明进一步提供了检测患者中突变的方法，其最终目的是早期鉴定顽固性病例以便于能够启动替代性治疗。一方面，本发明提供了PCR引物，其在适宜PCR条件下杂交至突变的EGFR基因的各个链中多核苷酸序列5'的有义链或反义链，所述突变的基因编码EGFR多肽的790位上由曱硫氨酸替换苏氨酸，其中该PCR引物在所述突变的200个核苷酸内结合。本发明提供了基于SEQIDNO:4-5和12-15的通用引物结构，其可以是大于或者小于这些特定的序列，还提供了如下引物其序列为在SEQIDNO:4-5和12-15给出序列中具有一定数目的被其它碱基所替换的碱基。另一方面，本发明提供了PCR引物，其在适宜的PCR条件下杂交至编码野生型EGFR多肽的第一多核苦酸，或者它的多核苷酸片^a,其中该引物杂交至在对应于EGFRcDNA石咸基2369的位置上包括野生型C的有义链序列或者反义链序列，并且该引物在所述PCR条件下很弱地或者根本不杂交至在2369位上含有突变T的第二EGFR多核苷酸。在进一步的实施方案中，本发明提供了PCR引物，其在适宜的PCR条件下杂交至编码突变EGFR多肽的第一多核苷酸，或者它的多核苷酸片断，其中该引物杂交至在对应于EGFRcDNA碱基2369的位置上包括突变T的有义链序列或者反义链序列，而且该引物在所述PCR条件下很弱地或者根本不杂交至在2369位上含有野生型C的第二EGFR多核苷酸。本发明提供了基于SEQIDNO:12和13的通用引物结构，其可以是大于或者小于这些特定的序列，还提供了如下引物其序列为在SEQIDNO:12和13给出序列中具有一定数目的被其它碱基所替换的碱基。另一方面，本发明提供了在样品中检测突变表皮生长因子受体(EGFR)基因的方法，其包括使用选4奪性检测在相应于EGFRcDNA碱基2369的位置上含有突变T的核苷酸序列的工具来探测样品，而且鉴定在所述位置上的碱基为T。在显著性实施方案中，所述工具辨别检测在所述位置上的突变T和野生型C。在一般的实施方案中，样品包括是或者疑是癌的或恶性的组织或细胞。这种样品源自具有或疑似具有癌或者恶性肿瘤的个体，并且经活体解剖或相似手术方法可以获得。在这种方法的某些普通实施方案中，该探测包括步骤a)需要时，处理样品以释放其中所含核酸；b)将所述自样品中获得的核酸与包括第一PCR引物的组合物相接触，该引物杂交至在对应于EGFRcDNA碱基2369的位置上包括突变T的有义链序列或者反义链序列，而且其中该引物在PCR条件下很弱地或者根本不杂交至在2369位上含有野生型C的第二EGFR多核苷酸；和c)在第二PCT引物存在下进行PCR反应以提供在相应于碱基2369位置上含有突变T的PCR扩增子。该PCR反应可有利地将标记物引入PCR扩增子；这允许鉴定步骤包4舌才全测该标记物。在本方法的可选择经常性实施方案中，该纟笨测步骤包括步骤a)需要时，处理样品以释放其中所含核酸；b)将自所述样品中获得的核酸与包括一对聚合酶链式反应(PCR)引物的组合物相接触，该引物在适宜的PCR条件下杂交至编码EGFR多肽的多核苷酸，其中该对引物附于相应于EGFRcDNA石威基2369的位置两侧(brackettheposition)以^是供PCR混合物；c)对所述混合物进行PCR反应，以提供包含相应于碱基2369位置的PCR扩增子；和d)将所述扩增子与切割工具相接触，所述切割工具以下述方式之一切割所述扩增子i)在所述位置的6个碱基内切割在相应于碱基2369位置上具有突变T的扩增子，但不如此切割在该位置上具有野生型C的扩增子，或者ii)在所述位置的6个碱基内切割在相应于碱基2369位置上具有野生型C的扩增子，但不如此切割在该位置上具有突变T的扩增子。该PCR反应可有利地将标记物引入PCR扩增子，因此允许所述鉴定包括检测被切割的标记的多核脊酸的长度多态性。在本方法的进一步一般实施方案中，该探测步骤包括步骤a)需要时，处理样品以释放其中所含核酸；b)将至少一部分的自所述样品中获得的核酸固定在固体载体上；和c)用探针寡核苷酸与被固定核酸相接触，该探针寡核香酸杂交至编码EGFR多肽的多核苷酸，其中所述探针的序列包括与在相应于EGFRcDNA碱基2369的位置上突变T互补的碱基，并且其中所述探针在适宜的杂交在与上述相反方法的通常实施方案中，探测步骤包括步骤a)需要时，处理样品以释放其中所含核酸；b)固定探针寡核苷酸，该探针寡核苷酸杂支至编码EGFR多肽的多核苷酸，其中所述探针的序列包括与相应于EGFRcDNA碱基2369的位置上突变T互补的碱基，且其中所述探针在固体载体上很弱地或者根本不杂交至在2369位上含有野生型C的多核苦酸；c)用至少一部分自所述样品中获得的核酸在适宜的杂交条件下接触被固定的探针。在这些涉及固体载体的实施方案中，结合至被固定部分的组分包括标记物，并且所述鉴定包括;险测所述标记物。另一方面，本发明提供了预测在患有或怀疑患有癌的个体中对吉非替尼或厄洛替尼治疗效果抗性的方法。这种方法利用了以上段落所述的、检测样品中突变表皮生长因子受体(EGFR)基因方法中所述的步骤，并且认为根据在2369位上突变体阳性的发现，预测个体对吉非替尼或厄洛替尼的治疗是抗性的。另一方面，本发明提供了试剂盒，其包括至少一个容器和包含其中的包括至少一种段落中所述PCR引物的组合物。在某些实施方案中，该试剂盒进一步包括切割EGFR多核苦酸的切割工具，该切割工具以下述方式之一切割EGFR多核苷酸a)在所述位置的6个碱基内切割在相应于EGFRcDNA碱基2369位置上具有突变T的多核苷酸，但不如此切割在该位置上具有野生型C的多核苷酸，或者b)在所述位置的6个碱基内切割在相应于EGFRcDNA碱基2369位置上具有野生型C的多核苷酸，但不切割在该位置上具有突变T的多核苷酸。图l.吉非替尼和厄洛替尼的化学结构。图2.示意性图示本发明各种实施方案的多核苦酸。长度为200个核苷酸以下且ll个核苷酸以上。在c)中较深色垂直线条图示被替换的核苷酸。图3.—种新型PCR-RFLP^r—验独立地确定在EGFR激酶区域的外显子20中存在T790M突变。(A)检验的设计(详见文本)。"F"指定为荧光标记物，例如FAM。在该图板的底部，检验用97-bpMalII切割产物证实了在H1975细胞系中存在T790M突变；这种产物在H2030DNA中不存在。106-bpNlaIII切割产物是野生型EGFR消化而产生的。(B)PCR-RELP检验证实了自三例患者的药前(pre-drug)肿瘤样品缺少可检测水平的突变97-bp产物，而在疾病进展后获得的试样含有T790M突变。Pt:患者。图4.自患者l,2和3的成像研究(A)患者l.从吉非替尼治疗前(0天)和期间(14天和9个月)的连续胸部射线照片证实了初始的响应以及随后的进展。(B)患者2.从厄洛替尼治疗前(0天)和期间(4个月和25个月)的连续CT研究，证实了初始的响应以及随后的进展。(C)患者3.从辅助吉非替尼治疗前(0天)和期间(3个月)，随后完全切除全部可见疾病的连续胸部射线照片。在3个月可看到的左边胸腔积液在4个月后复发，此时收集液体用于分子分析。图5.再次活组织检查研究。白色箭头指示活组织检查针头。(A)患者1.吉非替尼治疗10个月后的CT引导的活组织;f企查肺损伤进程(左图)。两个月后，收集来自右侧胸腔积液的液体(右图)用于分子分析。(B)患者2.CT引导的活组织检查胸推损伤进程(左图)和荧光透视引导的活组织检查肺损伤进程(右图)。图6.在患者1和2中鉴定的用EGFR外显子19和21突变的排序色谱图。(A)自患者的肿瘤试样中EGFR外显子21的状况。自生长型肺损伤和胸腔积液的DNA证实了在2573位上杂合的T—G突变，导致常见的L858R氨基酸替换。(B)来自患者2的所有三个试样表现了相同的杂合外显子19缺失，除掉了残基747-749并且将750位上的丙氨酸改变为脯氨酸。最初的四色排序示踪已被转变为黑色和白色。图7.在各种临床试样和NLCLC细胞系H1975中用T790MEGFR外显子20突变排序的色谱图。最初的四色排序示踪已被转变为黑色和白色。(A-C)在所有的三例患者一患者l(A)、患者2(B)和患者3(C)中，仅在应用吉非替尼或厄洛替尼进展之后而获得的损伤中观察到继发型T790M突变。(D)细胞系H1975包含外显子21L858R突变(上部图板)和外显子20T790M突变(下部图板)。星号表示在核苷酸2361上常见的SNP(A或G);箭头表示在核苦酸2369上突变(C—T)，导致在790位上甲硫氨酸(ATG)替换苏氨酸(ACG)。在向前方向，突变T峰为蓝色。在反方向，突变峰为绿色，然而在下面的蓝色峰代表来自相邻核苷酸的"回波(echo)，，。图8.含有T7卯M突变的EGFR突变体是对吉非替尼或厄洛替尼抑制抗性的。用编码野生型(WT)EGFR或EGFR突变体的质粒瞬时转染293T细胞，所述EGFR突变体具有如下变化T790M,L858R,L858R+T790M,delL747-E749;A750P,或者delL747-E749;A750P+T790M。在36小时后，细胞被血清饥饿24小时，用吉非替尼或厄洛替尼处理1小时，然后收集，应用抗-p-EGFR(Y1092)、抗-t-EGFR、抗-磷酸化酪氨酸(p-Tyr)以及抗-肌动蛋白抗体进行免疫印迹分析。EGFRT790M突变，联合野生型EGFR或药物敏感的58REGFR突变体，预防吉非替尼抑制酪氨酸磷酸化(A)或p-EGFR(B)。类似地，T790M突变，耳关合药物响应的delL747-E749;A750PEGFR突变体，预防厄洛替尼抑制p-EGFR(C)。图9.含有在EGFR或KRAS中不同突变的NSCLC细胞系对吉非替尼敏感性不同将表示NSCLC细胞系的三种(H3255:L858R突变；H1975:T7卯M和L858R突变；和H2030:野生型EGFR,突变KRAS(参见表7))培养于于增加浓度的吉非替尼中，在处理48小时后，应用钙黄绿素乙酰曱酯(CalceinAM)荧光检验测定活细胞的密度。将溶媒处理细胞中焚光表示为100%。结果为三个独立实验的平均值士SE，其中每个条件有四至八个重复实验。用厄洛替尼获得相似的结果。图10.含有在EGFR或KRAS中不同突变的NSCLC细胞系对厄洛替尼敏感性不同。参见图9的图例。发明的详细描述这里所明示的所有专利、专利申请公开以及专利申请被全部地，犹如这里逐字呈现，引入作为参考。这里所明示的所有技术公开也被引入作为参考。缩写词CML,慢性骨髓性白血病；CT,计算断层摄影术；del,缺失；EGFR，表皮生长因子受体；GIST，胃肠道间质瘤；HES,高嗜酸性粒细胞综合征；NSCLC,非小细胞肺癌；p-EGFR,磷酸化-EGFR;PCR-RFLP,PCR限制片断长度多态性；SNP，单核苷酸多态性；t-EGFR，总EGFR。登录号参照EGFR序列获得自LocusLink登录号1956和Genbank登录号NT_033968。两种编号系统用于EGFR。第一种表示初始曱硫氨酸在信号序列中为氨基酸-24。这里所用的第二种表示该曱硫氨酸为氨基酸+1。抗体如Y1068-特异性抗-磷酸化-EGFR的商业供应商，使用第一种命名。为了保持一致性，我们将Y1068视为Y1092。同样地，这里报道的T790M突变也已被称作T766M。在本说明书中，冠词"一个"、"一种"和"该"等同地是指单数或复如这里所用的术语"瘤"是指所有的瘤细胞生长和增殖，无论是恶性还是良性的，以及所有的癌前期的与癌的细胞和组织。如这里所用的术语"癌"是指拥有如下特征的细胞和组织未受控制的增殖，丧失特定功能，永生性，显著的转移潜能，在抗凋亡活性的显著提高，快的生长和增殖速度，和某种特征性形态学的与细胞的标志。在有些情况下，癌细胞是瘤的形式；这种细胞可局部地存在于动物内，而在其它情况下，它们以独立细胞如白细胞而循环于血流中。为了确定获得对吉非替尼或厄洛替尼临床抗性的癌是否在EGFR激酶区域内表现另外的突变，我们检查了EGFR外显子18至24在十三例应用这些药物初始响应但是随后进展的患者肿瘤中的状态。还在来自十四例患者的肿瘤细胞中评价了这些外显子，这些患者的疾病在完全全部肺瘤切除后进行吉非替尼治疗时快速复发。由于KRAS突变与对吉非替尼和厄洛替尼的原发抗性相关[7],我们还检查了KRAS在来自这六例患者的肿瘤细胞中的状态。为了解释具有新鉴定的"抗性"突变(T790M氨基酸替换(亦称作T766M)、在五GF/基因组序列中2369C—T)的细胞的选择性优势，我们进一步表征了推定抗性EGFR突变体与野生型或药物敏感性EGFR突变体的药物壽l感性，应用了偶然发现含有T790M突变的NSCLC细胞系以及来自用野生型和突变EGFRcDNA瞬时转染的细胞的溶菌产物。SEQIDNO:1(表示在表1)显示了突变人EGFR基因的cDNA序列。用于扩增EGFR片断的引物对以下划线和斜体表示，该片断用于测序以才企测EGFRT790M突变存在与否。突变t2369核香酸是以放大的粗体表示。野生型EGFR序列是已知的，其来自Genbank登录号X00588，以及Ullrich，A.等"HumanepidermalgrowthfactorreceptorcDNAsequenceandaberrantexpressionoftheamplifiedgeneinA431epidermoidcarcinomacells(人类表皮生长因子受体cDNA序列和扩增的基因在A431表皮样癌细胞中的异常表达)"，Nature309(5967),418-425(1984).被翻译的突变蛋白质序列表示于SEQIDNO:2(表2)。突变M790是以放大的粗体表示。表1.2369C—T突变EGFRcDNAatgcgaccctccgggacggccggggcagcgctcctggcgctgctggctgcgctcrtgcccggcgagtcg3tc:atttictc3gcctcc3gsgga/tgt:tCEiat33ctgtgaLggtggtcct;tgggaatttgg站3tt3cctatgtgcagaggaattatgatctttccttcttaaagaccstccaggaggtggctggttatgtcctcattgc;cctc3acacsgtggagcga3ttcc:tttggaasiac;ctgc3gatcatc3gagga3at3七gt:act3cgaaaattcctatgccttagcagtcttatctaactatgatgcaaatsasaccggactgasggagctgcccatgagaastttacaggaaatcctgcatggcgccgtgcggttcagcaacaaccctgccctgtgcaacgtggagagcatccagtggcgggacatagtcagcagtgactttctcagcaacatgtcgatggacttccagagagaactgccagaaactgaccaaa:atca1:ctgtgcccagcagtgctccgggcgctgccgtggc5iagtcccccagtgsctgctgccscsaccagtgtgctgcaggctgcacaggcccccgggagagcgactgcctggtctgccgcaaalrtccgsgacgasgccacgtgcaaggacacctgGcccccactcatgctctacaaccccaccacgtaccagatggatgtgasccccgagggcaaatacagctttggtgccacctgcgtgaagaagtgtccccgtaattatgtggtgacagatcacggctcgtgcgtccgagcctgtggggccgacsgctatgsgsttggaggaagacggcgtccgcaagtgtaagaagtgcgaagggccttgccgc站agtgtgtaacggaatactcc3tc3gtggcgatctcc3C3tcctgccggtggc3ttt3ggggtg3ctcc七tc3C3C3t3Ctc:ctcCtctgg3tcc3c3gga3ctggatsttctgaa33ccgtsaagg333tcacaggg七ttttgctg3ttc3ggcttggcctgas^scaggacggacctccatgcctttgagaacctagsastcata^cgcggcaggaccaaaggagataagtgatggagatgtgataatttcaggaaacaaaaatttgtgctatgcaaatacaataaaccaaggccacaggccaggtctgccatgccttgtgctcccccgagggctgctggggcccggsgcccagggactgcgtctcttgccggaatgtcsgccgaggcagggsatgcgtggacasgtgcaaccttctggsgggtgagccaagggagtttgtggagaactctgagtgcatacagtgccacccagagtgcctgcctcaggccstg33C3七C3CCtgc3cagg3cggggaccag3C3actgt3tccagtg七gccc3ct:ac3t:tg3c:ggccccc:actgcgtcaagacctgcccggcaggagtcatgggagaaaacaacaccctggtctggaagtacgcagacctgtcc33cg3atgggcct33gstcccgtcc3tcgccactgggatggtgggggccctcct:cttgctgctggtggtggccctggggstcggcctcttcstgcga^ggcgccacstcgttcggsagcgcacgctgcgg^^g^ggatcttgaaggaaactgaattcaaaaagatcaaagtgctgggctccggtgcgttcggcscggtgtataagggactctggatcccagaaggtgagaaagttasaattcccgtcgctatcaaggaattasgagaagcaacatctccg3aagccaacaiaggaa3tcc:tcg3tga3gcctacgt:g3七ggccagcgtggscaacccccacgtgtgccgcctgctgggcatctgcctcacctccaccgtgcagctcattacgcagctcatgcccttcggctgGctcctggactatgtccgggaacacaaagscsatattggctcccagtscctgctcaactggtgtgtgcaga±cgcaaagggcatgaactact±ggaggaccgtcgcttgg±gcaccgcgacctggctgggtgcggaagagaaagaataccatgcagaaggaggcaLaagtgcctatcaagtggatggGsttggsatcwttttacacagsatctatacccaccagagtgatgtctggagctstcggggtgaccgtttgggsgttgatg3cctti:gg3tcc33gccatstg3cgg3atcccigccsgc:gag3tctcctcciat:cctgg3g3貼ggagsacgcctccctcagccacccatstgtaccatcgatgtctacatgatcatggtcsagtgctggatgaccgtgccctgatggatgaagaagacatggacgacgtggtgg3tgccg3cg3g七acctcatcccac3gcagggcttcttcagcsgcccctccacgtcscggactcccctcctgsgctctctgagtgcsaccsgcascaattccaccgtggcttgcattgatagaaatgggctgcaaagctgtcccatcaaggaagacagcttctgtgcctgaatacstsaaccagtccgttccGsasaggcccgctggctctgtgcagwtcctgtctatcatgggcccagsssggcagccaccaaattagcctggacaaccctgactaccsgcsggacttctttcccascacaaagcagtgastttattggagcatga^SE^IDU)卯99孑表2.T790M突变EGFRMRPSOTAGftALiLfiLIjflALCPASRALEEKKVCQGTSWKLTQIiGTFEDHFLSLQRMFNNCEVVLGNLEITYVQRNYD:LS舰TIQEV姊YVLIALNTVERIFLEliLQ工工RGNMyYENSYALAVLSOTD;aNKfG:LKEIiPKIRNLQEILHGAVRFSNNPaLCNVESIQlimEJIVSSDFLSNMSMDFQNHIjGSCQKCDPSCPNGSCWGAGEmQMDVNPEGKYSFGATCVKKClRNYVVTDHGSCVRACGADSMMEEDGVRKCKKCEGPCRKVCNG工GIGEFKDSIjSIMATNIKHFKNCTSISGDIiHILPVAFRGDSFTlrrPELDPQELDIJLKTVKEITGFMilQATOENRTDLHAFE孤EI工RGRTKQHGQFSLAWSLN工TSLGLRSLKB工SDGDV工ISGNKN3XY朋TINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCJKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCmNVSRGRECVDKCKLLEG.EPREFVENSECIQCHPECIiPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADWAQKGSHQISLDNPDYQQDFFPKEAKPNGIFKGSTAENAEYLRVAPQS(SEQIDNO:2》如这里所用的，"核酸"或者"多核苷酸"以及相似的术语和短语是指天然存在的核苷酸组成的聚合物以及由合成的或修饰的核苷酸组成的聚合物。因此，如这里所用的，为RNA的多核苦酸，或者为DNA的多核苷酸，或者同时含有脱氧核糖核酸和核糖核酸的多核苷酸，可以包括天然存在的残基如天然存在的碱基和核糖或脱氧核糖环，或者它们可由合成的或修饰的残基(如下面所描述的那些)组成。本发明所用的多核苷酸可以是单链的或者它可以是碱基配对的双链结构，或者甚至三股链碱基配对结构。核酸和多核苷酸长度可以是20个以上的核苷酸，或者50个以上的核苦酸，或者100个以上，或者1000个以上，或者1万个以上，或者10万个以上。如这里所用的，"寡核苷酸"以及基于此的相似术语是指由天然存在核苦酸组成的短聚合物以及由如上述段落所描述的合成或修饰核苦酸组成的聚合物。寡核苦酸长度可以是10个以上的核苦酸，或者20个以上的核苷酸，或者30个以上的核苷酸，或者40个以上，可达约50个核苷酸。寡核苷酸可以是化学合成的而且可以用作PCR引物或探针，或者其它用途。应当理解的是，由于以上段落中所提供的大小范围上重叠，术语"多核苷酸"和"寡核苷酸，，可以在这里同义使用以指示本发明的引物或探针。如这里所用的"核苷酸序列"、"寡核苷酸序列"或者"多核苷酸序列"以及相似术语可互换地指寡核苷酸或多核香酸所具有的i威基序列，也指具有所述序列的寡核苷酸或多核苷酸结构。核普酸序列或者多核苷酸序列进一步是指任意的天然的或合成的多核苷酸或者寡核苷酸，其中碱基的序列是由如本领域常用的、字母指定碱基的特定序列所描述或引述而定义的。"核苷"通常由本领域如生物化学、分子生物学、基因组以及涉及本发明领域的相似领域的工作人员理解为，包括以糖苷键连接至噪呤或嘧啶碱基的单糖；而"核苷酸"包括带有至少一个磷酸基团附加于主要是在糖的3'或5'位(如五糖)，也可以是糖的其它位置上的核苦。核苦酸残基在寡核苷酸或多核苦酸中占据顺次的位置。核苷酸的修饰物或衍生物可存在于寡核苷酸或多核苷酸中的任意顺次位置上。所有的修饰或衍生的寡核苷酸和多核苷酸都被包括在本发明内并且落入权利要求的保护范围。修饰或衍生可发生于磷酸基团、单糖或者碱基。以非限定实例的方式，下列描述提供了一些修饰的或衍生的核苷酸，它们都在本发明的多核苦酸范围内。单糖可以是以例如五糖或六糖而非核糖或脱氧核糖来修饰。单糖也可以进行如下修饰用氬或氨基取代羟基(hydryoxyl)，烷基化或酯化另外的羟基，等。在2'位的取代基例如2'-0-曱基、2'-0-乙基、2'-0-丙基、2'-0-烯丙基、2'-0-氨基烷基或者2'-脱氧-2'-氟代基团对寡核苷酸提供增强的杂交性质。寡核苷酸和多核苷酸中的碱基可以是"未被修饰的"和天然的碱基，包括噤呤石成基腺嘌呤(A)和鸟。票呤(G),以及嘧咬碱基胸腺嘧咬(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。此外，它们可以是带有修饰或取代的碱基。被修饰碱基的非限定性实例包括其它的合成和天然的碱基，例如次黄。票呤，黄嘌呤，4-乙酰胞嘧啶，5-(羧基羟基曱基)尿嘧啶，5-羧基曱基氨基曱基-2-硫代尿苷，5-羧基曱基氨基曱基尿嘧啶，二氢尿嘧啶，P-D-半乳糖苷Q核苷，肌苷，N6-异戊烯基腺嘌呤，1-甲基鸟噤呤，l-曱基肌苷，2,2-二曱基鸟噤呤，2-曱基腺噤呤，2-曱基鸟噤呤，3-曱基胞嘧啶，5-曱基胞嘧啶，N6-腺噤呤，7-曱基鸟。票呤，5-曱基氨基曱基尿嘧啶，5-甲氧基氨基曱基-2-硫代尿嘧啶，P-D-甘露糖苷Q核苷，5'-曱氧基羧基曱基尿嘧咬，5-曱氧基尿嘧啶，2-曱基硫代-N6-异戊烯基腺噤呤，尿嘧啶-5-氧基乙酸(v),wybutoxosine,假尿嘧咬，Q核香，2-碌b代胞嘧咬，5-曱基-2-石克代尿嘧啶，硫代尿嘧啶，2-硫代尿嘧啶，4-硫代尿嘧啶，5-曱基尿嘧啶，尿嘧啶-5-氧基乙酸曱酯，尿嘧咬-5-氧基乙酸(v),5-曱基_2_硫代尿嘧啶，3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶，(acp3)w,以及2,6-二氨基。票呤，5-羟基曱基胞嘧啶，黄噤呤，次黄噤呤，2-氨基腺嘌呤，6-曱基以及其它烷基衍生物的腺噤呤和鸟嘌呤，2-丙基以及其它烷基衍生物的腺。票呤和鸟噪呤，2-硫代尿嘧啶，2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧咬，5-卣代尿嘧啶，5-卣代-胞嘧啶，5-丙基-尿嘧啶，5-丙炔基-胞嘧啶以及其它烷炔基衍生物的嘧咬碱基，6-偶氮-尿嘧啶，6-偶氮-胞嘧啶，6-偶氮-胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫代尿嘧啶，8-卣代、8-氨基-、8-巯基-、8-巯基烷基-、8-羟基-以及其它的8-取代腺嘌呤和鸟。票呤，5-卣代特别是5-溴代、5-三氟曱基和其它5-取代尿嘧啶和胞嘧啶，7-曱基鸟噪呤和7-曱基腺噤呤，2-氟代-腺。票呤，2-氨基-腺。票呤，8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤，7-去氮杂鸟嘌呤和7-去氮杂腺嘌呤和3-去氮杂鸟。票呤以及3-去氮杂腺。票呤。进一步修饰的碱基包括三环嘧啶例如吩噁溱胞苷(lH-嘧啶并[5,4-b][l,4]苯并噁溱-2(3H)-酮)，吩噻。秦胞苷(l-嘧啶并[5，4-b][l,4]苯并噻。秦-2(3印-酮)，G字夹诸如取代的吩噁溱胞苷(例如9-(2_氨基乙氧基)-H-嘧啶并[5，4-b][l,4]苯并噁嗪J(3H)-酮)，咔唑胞苷(2&嘧啶并[4,5-b]吲哚-2-酮)，吡咬并吲咮胞苷(H-吡啶并[3',2':4,5]吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-酮)。被修饰的碱基还包括那些其中噤呤或嘧啶碱基用其它杂环代替，例如7-去氮杂腺噪呤，7-去氮杂鸟苷、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。更多的碱基包括在美国专利号3,687,808中所公开的那些，《聚合物科学与工程简明百科全书》(TheConciseEncyclopediaOfPolymerScienceAndEngineering,第858-859,Kroschwitz,J.I.,主编JohnWiley&Sons,1990年)戶斤公开6々刃，些,Englisch等在AngewandteChemie,InternationalEdition(1991)30,613，公开的那些以及Sanghvi,Y.S.在第15章"反义研究与应用"(AntisenseResearchandApplications),第289-302页,Crooke,S.T.和Lebleu,B.,主编，CRC出版社，1993年，所公开的那些。这些石咸基的一部分特别适用于增加本发明寡聚化合物的结合亲合力。这些包括5-取代的嘧啶，6-氮杂嘧啶以及N-2、N-6和0-6取代的噤呤，包括2-氨基丙基腺噤呤，5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-曱基胞嘧啶已被证实可增加0.6-1.2摄氏度双链体稳定性(Sanghvi,Y.S.,Crooke,S.T.和Lebleu，B.,编辑，AntisenseResearchandApplications,CRCPress,BocaRaton,1993，pp.276-278),并且是目前优选的碱基取代，尤其是当与2'-0-曱氧基乙基糖修饰联合时。参见美国专利6,503,754和6,506,735及其所引用的文献，引入这里作为参考。修饰物进一步包括在美国专利号5,138,045和5,218,105中所公开的那些，关注多胺缀合的寡核苷酸；美国专利号5,212,295,5,521,302,5,587,361和5,599,797,关注寡核苦酸结合手性磷键合包括硫代磷酸酯；美国专利号5,378,825,5,541,307和5,386,023,关注具有修饰骨架的寡核苷酸；美国专利号5,457,191和5，459，255,关注被修饰的核碱基(nucleobases);美国专利号5,539,082,关注肽核酸；美国专利号5,554,746,关注带有|3-内酰胺骨架的寡核苷酸；美国专利号5,571,902,公开了寡核苷酸的合成；美国专利号5,578,718，公开了烷基硫基核芬；美国专利号5,506,351，关注2'-0-烷基鸟苷，2，6-二氨基嘌呤以及相关的化合物；美国专利号5,587,469,关注带有N-2取代噤呤的寡核苷酸；美国专利号5,587,470,关注带有3-去氮杂嘌呤的寡核苷酸；美国专利号5,223,168和美国专利号5,608,046，关注缀合的4'-去曱基核苷类似物;美国专利号5,602,240和5,610,289，关注骨架《奮饰的寡核苷酸类似物；美国专利号6,262,241和5,459,255,关注其中合成2'-氟代-寡核苷酸的方法。核苷酸间的键合通常是3'-5'磷酸酯键合，它可以使天然的磷酸二酯键合、硫代磷酸酯键合以及其它的合成的键合。包含硫代磷酸酯骨架的寡核苷酸增强核酸酶的稳定性。修饰骨架的实例包括，硫代磷酸酯，手性硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，磷酸三酯，氨基烷基磷酸三酯，曱基和其它烷基磷酸酯包括3'-亚烃基磷酸酯、5'-亚烃基磷酸酯以及手性磷酸酯，亚膦酸酯，氨基磷酸酯包括3'-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯，亚砜基氨基磷酸酯，亚砜基烷基磷酸酯，亚砜基烷基磷酸三酯，硒基磷酸酯和硼烷基磷酸酯(boranophosphates)。另外的键合包括磷酸三酯，硅氧烷，碳酸酯，羧曱基酯(carboxymethylester),乙酰胺化物(acetamidate)、氨基甲酸面旨，硫醚，桥连的氨基磷酸酯，桥连的亚曱基磷酸酯，桥连的硫代磷酸酯以及砜核苦酸间键合。其它的聚合键合包括这些的2'-5'连接类似物。参见美国专利6,503,754和6,506,735及其所引的文献，引入这里作为参考。包括在以上描述中示例那些的任何修饰物都容易地被引入，并且组成本发明的多核苷酸范围。任意修饰的应用等同于具有相同碱基配对性质的天然存在的核苷酸，这是本领域普通技术人员所理解的。任何等同修饰的核苷酸都落入本发明的范围，如这里所公开的和权利要求的。如这里所用的以及在权利要求书所要求的，术语"互补体"、"互补的"、"互补性"以及类似的词语，是指两个序列，它们的碱基形成互补的碱基对，石成基对石威基，如同本领域例如生物化学、分子生物学、基因组以及与本发明相关的类似领域的普通技术人员通常所理解的。具有互补序列的两个单链(ss)多核苷酸在适宜的緩冲剂和温度条件下可彼此杂交以形成双链(ds)多核苷酸。以非限定实例的方式，如果考虑到天然存在地碱基，A与(T或U)彼此作用，而G与C彼此作用。除特别说明，"互补的"是表示"完全互补的，，，即，当两个多核苦酸链相互排列时，至少有一部分的链，其中一股链中一序列连续碱基的每一个都互补于相对链上相同长度的一序列连续碱基中交互作用的碱基。如这里所用的，"释放"以及类似词语，当用于涉及核酸时，是指一个过程，籍此将细胞或组织充分处理以使其中所含核酸有效地与试剂(包括PCR引物)相互作用，应用于本发明的方法中。如这里所用的，"使杂交""杂交，，以及类似词语是指这样一个过程，通过引起带有互补序列的链彼此相互作用而形成核酸或寡核苷酸双链体。这种相互作用根据每股链上互补碱基特异性相互作用以形成对而发生。链彼此杂交的能力取决于各种条件，如下所述。当每个链中充足数量的相应位置被能彼此相互作用的核苷酸所占据时，核酸链彼此杂交。彼此杂交的多核苷酸链可以是完全互补的。或者，两个杂交的多核苷酸可以是彼此"基本上互补的"，说明它们有少量不匹配的碱基。无论天然存在地碱基还是如这里所述的那些修饰的碱基都参与形成互补的碱基对。本发明所属领域的普通技术人员包括非限定实例的生物化学家和分子生物学家应当理解，形成双链体的链序列不必100%彼此互补以可特异性杂交。如这里所用的，"片断，，及类似词语是指比参照物的完全序列短的部分核酸、多核香酸或寡核芬酸。片断中的石咸基序列是相同于参照物相应部分的序列；与参照物的相应部分比较，在片断中没有插入或缺失。如这里所用的"切割工具，，以及类似词语是指一种以序列特异性方式切割多核苷酸的物质。该切割工具仅在其中存在容许的石咸基序列处与多核苷酸相互作用，并将多核苦酸切割成两个较小的段。切割工具的非限定性实例包括限制性核酸酶、序列特异性核酶、具有切割活性的适配子以及具有切割活性的、序列特异性有机分子。本发明所属领域普通技术人员已知的、任何等同的切割工具都属于本发明的范围。"互补DNA，，(cDNA)是经逆转录酶从mRNA模板复制的单链DNA分子，结果是序列互补于mRNA的。本领域的普通技术人员也用术语"cDNA"来表示包含这种单链DNA分子及其互补DNA链的双链DNA分子。本发明提供了用于检测在样品(癌组织活检、通过激光组织捕捉从活检获得的癌细胞或者从血清中分离的癌细胞)中存在包括EGFRT790M突变的各种方法。这种方法可包括将DNA样品与EGFRT790M区域上游和下游的两个引物相接触，根据标准方法扩增EGFRT790M区域，并4企测扩增的序列是否存在于核酸样品中。因此，能够识别并结合至EGFRT790M都是优选地支持这种方法的工具。例如，整个EGFR外显子20能够用PCR扩增，应用基因组DNA为模板并且应用能够分别地识别和结合至外显子20的5'和3'内含子侧翼序列(这种外显子20侧翼序列用大写字母表示在SEDIDNO:3中(表3，参见GenBank登录号NT—033968)的引物对。这种包括EGFRcDNA序列核苷酸2369的引物对能够扩增片断，然后它可用于测序、限制长度多态性分析或者用于确定是否存在2369T突变的任何其它技术。表3.1611011&U611612211612811613411614011614611615211615811,41161701161761161821161881161941162001162061162121162181162241162301162361162421162481162541162601162661162721162781162841162901162961163021163081163141163201"tttagcttcc，caaaggaactcrgtgcactctttagaa，ccatttcAGGTGCTGTGGCCAAGCCT:GTGCCTTCTCCcagtcmtactaaaacacagCCAAACTCAfictgttgcctgccactgcatcCACAGCTTTTcctggaagggTCTCCCTCCCtgoctcctggtggtgtgtgcgccaggatccGTGTGTGCGTTCTTCTGCACCTTTGAAGAACTCTGGAATTCATTCAGGACAGTGGTGGAGAGAGGGCGCAAC3GCTC(3CTCGGTGCTGGAGAAGACCTCTGTGCACTCAACACTTTAAAGGctccgacagcCCCACCCGGCCAGTCCTGCCCTACAAGAAGTCAGCCCAAGaggcccctgcgcatggatttMGGOTCCCGAAAACCTGGGGGCAGGGTCCgcctgtggggATCGCTTGTCccagggtgttCATCCTCAACAGATCAGGTGTOTCACTTCACCTCCATGAG(3TCCATGTGCTCCA6gaagctc七gcctcacactatgrtccgagatx:gcaaaTCACATGCGGGCATGCAGCAaaatcagtgcTTTTCTCTTTctttgtgaatTTGATAACAATGGAGCAGGTGCTGCTGCTGCAGAGCCAGGACAGGCACAGCTTTTGCCCCttgctaagtcatttgcaggcAGGGCAGGGGctgggcaggtacaaacaaaaAATAGCAGAACTTGGCAGCCcccatagggaGGCAGCCAGGACTGCTCTATccagcccaaaAAGGGAGGCCctctgcagcaCCGGACCCCActtgaggcggactccgactcTCATGGGGAACAGCCCTGCGTACGTATTTTCCCTCCTTCTctacgtga七gctccaccgtgggaaoaeaaagGTAATCAGGTCTGCGCTCCCACACACATTCTGTCCCATCATTGAGTGCTACTGTGCTGAggtaagcaagGCCTTGCA(3GCTATCTGGCTGCt3GGGCTGAaacaacaagcaaacccctccCTATTTTTTTAGGCCCTGTCGTCCAGAGATCCTCCTCATTTGAGGCGCTCACATCTGGAG'gggttaaaatAGCCGGAATTgcctgggggcCAGCCTTTAGtgaaagagcttgcccacccatttctccctgcccacagccacacagattccaggtcttcatctcctttatctccccagatgtaaacctcccgaaactcaagggccaccatgtgggatagcacctttmttttgcatgtggacagtgtgctctttgtagtggccaggccaagaggcccactgggggcC:ttgggagagcagagcaggtatttccatctccatcctaacaatggtctgagaatactgccagggagcttgcatccacccaactcccgctcttatgaaagtctgtaAGCAGGGCAGacagcacagatcactgtagatatccagctaTTTCCCAGAGCTGGCTCGGTGCGTTCCTGATACAGGCCCTaacaaagatacaatgtcctcGACCCAtSGAGtgtgctaggtATCGCATTCACGAAGCCACAacaacccccaogcagctcatACGGGGAGGGAGAGTTTGCCggattcaatcAACTCTCATCTGMGTCTCTAGAAGGAATAGCCAGGAGGAAGGAGGTGCActaactotcctggtcaggtaACAGCTGGTGCCACTCTTGCgtatacatttCGCCGTTGCCCCASAGGGAGGCCTGGTTAGaggcagatgtCCAGCATCTGCAGATGCCTG(5AGACCACTTTTGAATGCTCctctttgcagCACAGTCAGGGCTCCCCGGAtgtgcagggtCATGATATTTCTATCAGTTCCTCATGGCCAGGGCCCTCTCCTTTTGCAGGTGCGTCTTCACTGACGTGCCcgtgtgccgocc七gc七caacATGGGGATATAAGTTGATCTAATCAGCTACGTTCTTATTTTTGCTTCCCCCCCAGGTGATAGGAGCTGACCCCTTTCCACGCCCTGCCTGCGGACCCAGAATCAGTTATTCATCCCATTGCGTCATCTCTggagcagacaCAGTGGCAGTCCCTTGACAC(SEQEDNO:3)不限于这些诊断方法，本发明提供了用于检测EGFRT790M突变的方法，籍此将限制性酶用于识别在等位密码子上缺少或存在限制性位点。当一种或其它的野生型或多态等位基因存在时，则出现导致多核苷酸有效切割的限制性位点，所述切割应用适宜的选"t奪性限制性核酸酶。在本发明中还设计了诊断试剂盒，用于检测与在人类中恶性肿瘤相关的突变EGFRT790M。这种试剂盒优选地包括多个容器，其中包括一组用于EGFRT7卯M突变PCR检测的引物，以及任选地包括突变EGFR序列的阳性对照品和包括非突变EGFR序列的阴性对照品。图2提供了示意性表示某些实施方案的本发明引物。本发明公开了用作引物的序列，以扩增包含了相应于EGFRcDNA2369位碱基的基因组片断或EGFRcDNA序列。所公开的引物序列如SEQIDNO:4-7和12-15用淡淡的阴影块在图2中示意性表示。图2,a)图示了一种具体实施方法，其中所公开的、表示为"SEQ"的引物任选地包括在总长度范围可达200个核苷酸的较大多核苦酸中。本发明进一步提供了引物序列，它是任意上述引物序列SEQIDNO:4-7和12-15的一个片断，其长度为至少11个核苷酸(而且最多比参照的SEQIDNO:少一个碱基；示于图2,b)),以及其中可达5个核苷酸可以不同于在序列SEQIDNO:4-7和12-15中给出序列的引物序列(示于图2,c),表明了在这个实例中以三条较深色竖条代表的三个变异碱基)。本发明还进一步提供了互补于任意上述序列的序列(示于图2,d),并指定为"COMPL")。任意的这些序列都包括在本发明的寡核苷酸或多核苷酸中。应当注意的是，任意的本发明的引物多核苷酸任选地可以包括达200个核苷酸限度的额外碱基。本发明的引物被设计为"基本上"互补于待扩增的基因座或cDNA的每个链。这意味着引物必须充分互补，以在允许聚合酶链式反应进行的条件下与它们相应的链杂交。换言之，引物应当具有充分的、与5'和3'序列侧翼突变的互补性以便与其杂交并允许基因座扩增。因此，这里应当设想到引物序列不必完全地互补于其靶序列。"基本上相同"及表示寡核苷酸序列的类似短语因此描述了具有充分特异性的杂交或退火功能性，以区别存在或缺少突变，诸如这里明示的SNP。这是可测定的，根据熔化温度不同足以允许易于鉴定寡核苷酸是否结合至正常的或突变的EGFRT790M基因序列。本发明的寡核苷酸探针用于扩增过程，该过程是酶的链式反应，产生相对于所涉及反应步骤数量的指数数量多态基因座。一般地，一个引物互补于多态基因组的负(-)链而另一个互补于正(+)链。退火引物以变性核酸，然后用酶、DNA聚合酶和核苦酸延伸，得到含有靶多态基因座序列的新合成的+和-链。由于这些新合成的序列还是模板，变性、引物退火和延伸的重复循环导致引物限定区域的(即靶多态基因组序列)的指数生成。链式反应的产物是末端对应于所用特定引物端的、离散的(discreet)核酸双《连体。多核苦酸的合成。本发明的寡核苷酸引物可应用任何适宜的方法而制备，例如常规的磷酸三酯和磷酸二酯方法或其自动化实施方案。在一个此类自动化实施方案中，氨基磷酸二乙酯用作起始材料并且可根据Beaucage等，TetrahedronLetters,22:1859-1862,(1981).所描述的而合成。在美国专利号4,458,066中描述了一种用于在修饰的固体载体上合成寡核苷酸的方法。寡核苦酸和多核苦酸可由标准的合成技术而制备，例如应用自动化DNA合成器。用于合成寡核苷酸的方法包括熟知的化学工艺，包括但不限于核苷酸氨基亚磷酸酯顺次加至表面衍生的粒子，如T.Brown和DorcasJ.S.Brown在《寡核苷酸及其类似物实用方法》(inOligonucleotidesandAnaloguesAPracticalApproach)F.Eckstein主编，牛津大学出版社，牛津，第1-24页(簡),并引入这里作为参考。一个合成方法的实例应用了ExpediteRNA氨基亚磷酸酯和胸苷氨基亚磷酸酯(Proligo,德国)。将合成的寡核苷酸脱保护并凝胶纯化(Elbashir等.(2001)Genes&Dev.15,188-200),然后经Sep-PakC18柱(Waters,Milford,马萨诸塞州,美国)纯化(Tuschl等(1993)Biochemistry,32:11658-11668)。寡核苷酸合成的其它方法包括但不限于根据磷酸三酯和磷酸二酯方法的固相寡核苷酸合成(Narang,等，(1979)Meth.Enzymol.68:90)，和H-磷酸酯方法(Garegg，P.J.等，(1985)"Formationofintemucleotidicbondsviaphosphonateintermediates(经由磷酸酉旨中间体的内部核苷酸键的生成)"，Chem.Scripta25,280-282;和Froehler，B.C等，(1986a)"SynthesisofDNAviadeoxynucleosideH-phosphonateintermediates(经由脱氧核苦H-磷酸酯中间体的DNA的合成)"，NucleicAcidRes.,14,53"-5407,等等)以及在载体上的合成(Beaucage,等(1兆1)TetrahedronLetters22:1859-1862)以及氨基磷酸酯技术(Caruthers,M.H.等，"MethodsinEnzymology,"Vol.154，pp.287-314(1988)，美国专利5,153,319,5,132,418,4,500,707,4,458,066，4,973,679,4,668,777，和4,415,732,以及其它的在"SynthesisandApplicationsofDNAandRNA(DNA和RNA的合成与应用)"S.A.Narang主编，AcademicPress,纽约，1987,及其所包括的文献,和非氨基亚磷酸酯技术。固相合成有助于从杂质及过量的试剂中分离寡核苷酸。一旦从固体载体切割，可用已知的技术进一步分离寡核苷酸。任意的核酸试样，以纯化的或非纯化的形式，可用作起始核酸，假i殳它含有、或者可能含有包含多态基因座的特定核酸序列。因此，该工艺可扩增例如DNA或RNA,包括信使RNDA,其中DNA或RNA可以是单4连或双链的。一旦RNA被用作模板，需要利用酶和/或将模板逆转录为cDNA的优化条件。此外，可利用含有各一条链的DNA-RNA杂种。还可以使用核酸混合物，或者还可利用这里早期扩增反应中所产生的核酸，应用相同的或不同的引物。待扩增的特定核S臾序列即多态基因座可以是较大分子的一部分或者可以初始以离散分子存在，以便于特定序列组成全部的核酸。待扩增的序列初始不必以纯的形式而存在；它可以是复合混合物的一小部分，例如包括在全部的人DNA中。这里所用的DNA可以提取自身体样品、组织材料等等，以各种技术诸如Maniatis等在分子克隆《4全验手册》(ALaboratoryManual),ColdSpringHarbor,N.Y.,p280-281,1982)。如果提取的样品是不纯的，在扩增前可用足以开放样品细胞或动物细胞膜和露出并/或分开核酸链的一定数量试剂。为了露出并分开链的这种细胞溶解和核酸变性步骤使扩增发生得更容易。用于DNA聚合的试剂可以任意的化合物或系统(包括酶)，其发挥作用以实现引物延伸产物的合成。适于这种目的地酶包括，例如，聚合酶突变蛋白、逆转录酶，其它的酶包括热稳定的酶(即，在经历升高足以引起变性的温度之后仍完成引物延伸那些的酶)，诸如Taq聚合酶。适宜的酶有利于核苷酸以正确的方式组合，以形成互补于每个多态基因座核酸链的引物延伸产物。通常，合成始于每个引物的3'端并沿着模板链向5'方向进行，直至合成终止，产生了不同长度的分子。以Southern印迹法而不用放射性探针对其分析，可以纟企测扩增产物。在这种方法中，例如，借助Southern印迹技术或者类似地，应用斑点印迹分析，扩增含有非常低水平多态基因座核酸序列的DNA小样。高水平放大信号有助于应用非放射性探针或标记。或者，将用于检测扩增产物的探针直接地或间接地可4企测地标记，例如，用》文射同位素、焚光化合物、生物荧光化合物、化学焚光化合物、金属螯合剂或者酶。本领域的普通技术人员会知晓用于结合至探针的其它适宜标记物，或者能够应用常规的实验而确定这样。在优选的实施方案中，经在含有使DNA有荧光的溴乙非啶的琼脂糖凝胶上分离混合物，扩增产物是可测定的。经本发明的方法扩增的序列可以被进一步地评价、检测、克隆、测序等等，在溶液中或者在结合到固体载体之后，以任何的、用于检测特定DNA序列的方法，例如PCR、寡聚物限制(Saiki等，Bio/Technology,3:1008-1012,(1985))，等位基因特异性寡核苦酸(ASO)探针分析法(Conner等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,80:278,(1983)),寡核苷酸连4妻分析法(OLAs)((Landgren等，Science,241:1007,(1988)),等等。本发明已考虑了用于DNA分析的分子技术(Landgren等，Science,242:229-237,(1988))。优选地，扩增的方法是用PCR，如这里所述的和本领域普通技术人员常用的。替代的扩增方法已有描述，并且也可应用，只要应用本发明引物、经PCR扩增的EGFR基因座类似地用该替换工具扩增。这种替换的扩增系统包括但不限于自动维持序列扩增，其始于较短序列的兴趣RNA和T7启动子。逆转录酶将RNA拷贝至cDNA,随后降解被转录的RNA。另一种核酸扩增技术是基于核酸序列的扩增(NASBA),其应用了逆转录和T7RNA聚合酶并且合并两个引物以乾向它的周期性模式。NASBA可始于DNA或RNA并以其中一个完成，而且在60至90分钟内扩增至108拷贝数。或者，核酸可用连接活化转录(LAT)来扩增。LAT始于带有单个引物的单链模板，该引物是部分单链和部分双链的。通过将cDNA连接至启动子寡核苷酸而启动扩增，而且在数小时内扩增为108和109倍。通过将一种称为MDV-I的RNA序列附着到互补于兴趣DNA序列的RNA,可利用QB复制酶系统。经与样品混合，杂种RNA在试样mRNA中找到它的互补体并结合，活化复制酶以拷贝紧随的兴趣序列。另一种核酸扩增技术，连接酶《连式反应(LCR),工作原理为应用两种不同标记的、一半的兴趣序列，在样品中存在连续序列的条件下通过连接酶而共价地成键，形成新的靶。修补链式反应(RCR)核酸扩增技术使用两个互补的且靶特异性的寡核苷酸探针对、热稳定的多聚酶和连接酶以及DNA核苷酸以几何级数地扩增耙序列。一个2-碱基间隔分开了寡核苷酸探针对，然后RCR填入并连接该间隔，模拟正常的DNA修补。经链置换活化(SDA)的核酸扩增利用了含有HincII识别位点的较短引物，它在5'端上带有短突出端，结合至靶DNA。DNA聚合酶填入带有含硫腺噤呤类似物的、相对于突出端的部分引物中。添加HincII但是仅切割未被修饰的DNA链。缺少5'核酸外切酶活性的DNA聚合酶进入到缺口位点处并开始聚合，置换初始的引物链下游而且建造一个新的用作另一个引物。SDA在37摄氏度、2小时内产生大于107倍的扩增。不同于PCR和LCR，SDA不需要仪表化温度循环。另一种用于本发明方法的扩增系统是QB复制酶系统。尽管PCR是在本发明中优选的扩增方法，但是其它的那些方法也可用于扩增基因座，如在本发明的方法中所述的。各种现有技术中熟知的方法通过等位基因特异性杂交可用于检测预定序列变异。优选地，检验基因用等位基因特异性寡核菩酸(ASOs)进行探测；而且每个ASO含有已知突变序列。通过检验特异性寡核苷酸探针杂交至靶多核苷酸片断的能力，ASO分析检测在靶多核苷酸片断中的特异性序列变异。优选地寡核苷酸含有突变序列(或其互补体)。在含有正常序列寡核苷酸探针不杂交至靶片断的条件下，由寡核苷酸与靶片断之间的杂交指示耙序列中序列变异的存在。在序列变异的(例如突变)寡核苷酸4笨变异(例如突变)。在优选的实施方案中，以标准斑点印迹格式探测检验样品。将含有对应于ASO的序列的、检验基因内每个区域各个独立地应用于固体表面，例如，作为膜上一个单独的斑点。应用现有技术中熟知的方法(参见，例如，Mullis,K.B，1987,在美国专利号4,683,202中提出的实验性实施方案)，可产生每个单独的区域，例如，作为一个分开的PCR扩增产物。用于实现ASO分析、可用作替代斑点印迹格式、基于模的格式包括，但不限于，逆向斑点印迹，(多重扩增检验)，和多重等位基因特异性诊断检验(MASDA)。在逆向斑点印迹格式中，将具有已知序列的寡核苷酸或多核苷酸探针固定在固体表面，并顺次地与标记的检验多核苷酸样品进行杂交。在这种情况下，扩增前可将引物标记或者可将NTPS标记，以制备标记检验多核苦酸样品。或者，在分离和/或合成之后，可将检验多核苦酸样品标记。在多重格式中，单独的样品在检验基因中含有多个耙序列，代替仅单一个靶序列。例如，将每个含有至少一个ASO靶序列的多种PCR产物应用于相同的样品斑点。在单个扩增反应中应用Caskey等美国专利号5,582,989的方法，可同时产生多种PCR产物。因此，可用每个ASO探测相同的斑点，其相应的序列在相同斑点中代表。通过使用多重ASO以^:测每个斑点(包括带有多倍靶序列的斑点)，MASDA格式扩展了多重格式的复杂性水平。这种方法被详细地描述于A.P.Shuber的美国专利号5,589,330，禾口Michalowsky等,AmericanJournalofHumanGenetics,59(4):A272,poster1573(October1996),其中的每一个都被全部地引入这里作为参考。首先，检测在多重ASO探针与被固定样品之间的杂交。这种方法基于如下预测在给定斑点里多个靶序列之中突变存在非常稀少，任何阳性杂交信号都源自探针混合物内与相应的突变靶杂交的单个ASO。然后通过从杂交位点分离并测定其核苷酸序列来鉴定杂交的ASO。设计等位基因特异性寡核苷酸(ASO)探针等位基因特异性寡核苷S吏探针是短的、单链的多核苷酸，其被工程化以在给定的一系列条件下精确地杂交至靶序列。通常，ASO探针被设计成分别含有等同于正常等位基因的序列以及序列变异。探针杂交至靶允许变异样品的辨别。在严格的条件下，带有如单个碱基对那样简单变异的探针不会杂交至正常的序列，因为正常突变双链体的去稳定效应(Ikuta,S.等,NucleicAcidsResearch,15:797-811(1987)。ASO杂交探针的设计必须满足两个基本的要求。(在人类遗传学中的现行议定书(CurrentProtocolsinHumanGenetics,9.4节，(1995))。首先，在相同池中一起使用的探针应当为大约相同的长度。尽管探针的标准长度最佳地是17个碱基对，但是范围可以是如大约14那么短或如大约27那么长。如果突变包含较长的插入物，那么更长的探针才是理想的。第二，不应当将错配区域安排在17个碱基对探针的末端，但是可以近似地在序列的中部，近似地从探针5'端计5-7个碱基。此外，错配的放置，一旦是较长的探针，不应当在末端，但可以在允许强的杂交和多核苦S吏链稳定化的位置。为了在探针的碱基组合物中最小化变异效应，在ASO杂种緩冲液中应用氯化四曱基铵(Shuber,T.，美国专利号5,633,134)。按照惯例，在DNA合成器上合成ASO探针。应用本领域中技术人员熟知的工具，可用同位素或非同位素检测试剂标记它们。在这种应用中简述的、用于制备和应用〗笨针的方法可适用于其它的基因序列。在现有技术中，可用在斑点印迹、逆向斑点印迹、多重以及MASDA格式中的适宜材料是熟知的，而且包括但不限于尼龙和硝酸纤维膜。当用PCR扩增生产靶序列时，起始材料可以是染色体DNA,此种情况下，DNA被直接扩增。或者，起始材料可以是mRNA,在此情况下，该mRNA首先被逆向转录成cDNA,然后根据熟知的RT-PCR技术扩增(参见，例如，Gelfand等的美国专利号5,561,058)。上述方法适用于有限数量序列变异的中等筛选。尽管如此，随着分子诊断中对快速、成本有效的大规模筛选的需求，已经开发了这样的技术其整合了ASO的基本概念，但是远远地超出了用于突变检测的能力和样品数量。这些替代上述那些的方法包括，但不限于，大规模的芯片阵列基于序列技术。大规冲莫阵列的应用允许快速分析许多序列变异体。关于芯片阵列开发和不同应用的综述报道于Southern,E.M.,"遗传学中的趋势"(TrendsInGenetics)，12:110-115(1996年3月)和Cheng等，"分子诊断"(MolecularDiagnosis),1:183-200(1996年9月)。已有几种关于制造芯片阵列的方法。不同包括，但不限于，附着被固定寡核苷酸的固体载体类型，用于鉴定变异体的标记技术以及在靶多核苷酸至探针、基于序列的技术中的变化。用于大规p漠分析、关于"DNA芯片"有希望的方法学^^皮详细地描述于Hacia等，NatureGenetics,14:441-447(1996),据此将其全部地引入作为参考。如Hacia等所述，超过96,000个寡核香酸的高密度阵列，每个长度为20个核苷酸，应用光导化学合成而被固定至单片玻璃或硅芯片上。寡核苷酸探针数量和设计的偶然性、序列中潜在的每个碱基可被询问以改变。因此，被应用于芯片的寡核香酸可包括尚未知晓发生于群体的序列变异，或者它们可被限于已知发生于群体的突变。在用寡核苷酸探针在芯片上杂交之前，应用本领域技术人员所熟知的工具，将检验样品分离、扩增和标记(例如，荧光标志)。然后，将检验多核苷酸样品杂交至被固定的寡核苦酸。将靶多核苷酸对被固定探针的基于序列技术的强度定量化并与参照序列对比。得到的遗传信息可用于分子诊断。在本发明的另一实施方案中，本发明提供了用于诊断患有癌症复发或者肺癌复发个体的潜在原因的方法，包括扩增来自个体的样品靶核酸后进行测序。可将EGFR或者其片断克隆，然后测序以便确定是否存在突变。在这种情况下，仅需将得到的序列与天然存在地(野生型)EGFR基因或者其一部相对比。可以应用DNA测序的其它方法诸如那些——Sanger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74:5463(1977)或者Maxam等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74:560(1977)或者现有技术中已知的其它方法。在本发明的另一实施方案中，本发明提供了用于诊断患有癌症复发个体的潜在原因的方法，包括将来自个体的样品靶核酸与检测本发明突变存在和检测突变的试剂接触。另一种方法包括将来自个体的样品靶核酸与检测突变存在和检测突变的试剂接触。对于本领域的技术人员而言，许多杂交方法都是熟知的。许多在完成本发明方面是有用的。用于本发明方法中的材料非常适合用于制备诊断试剂盒。这种试剂盒可包括被分隔的载体工具以便于在严格密封中接受一个以上的容器工具如小药瓶、试管等，每个容器工具包括一个以上的、用于本方法的分开单元。例如其中一种容器工具可包括用于扩增EGFRDNA或者其片断的工具，所述的工具包括必要的酶和寡核苷酸引物，用于扩增来自个体的所述靶DNA。另一个容器可包括寡核普酸探针，用于检测突变的存在或者不存在。或者，另一个容器可包括识别突变序列而非野生型或者反过来的限制性酶。其它的方法可包括将来自癌症患者的癌组织样品与特异性检测EGFR蛋白的EGFRT790M形式而非不含这种突变的EFGR蛋白的抗体相接触。或者，用western印迹法、ELISA或者其它蛋白质检测技术可以获得并才企测来自癌症患者的、癌组织样品的蛋白提耳又物中EGFRT790M突变体存在或不存在，应用特异性检测这种突变而非不含这种突变的EGFR蛋白的抗体。用于检测EGFRT790M突变体的抗体可以是获得自杂交瘤的抗体。用于制造杂交瘤的典型方法如下(a)用某种免疫原免疫小鼠；(b)自被免疫的小鼠摘除脾脏并在适当培养基中制备脾脏悬浮液；(c)将悬浮的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合；(d)在不支持未融合骨髓瘤细胞或脾脏细胞的选择性培养基中，稀释并培养未融合的脾脏细胞、未融合的骨髓瘤细胞以及融合的细胞；(e)在每个含有存在免疫原抗体的杂交瘤容器中评价上清液；和(f)选择并克隆产生想要抗体的杂交瘤。一旦已选定并克隆想要的杂交瘤，通过在适宜的培养基中体外培养想要的杂交瘤，制备合成的抗体。作为替代的方法，可将想要的杂交瘤注射至小鼠以产生高浓度的抗体[Kennett，等，(簡)编辑,MonoclonalAntibodies(单克隆抗体).Hybridomas:Anewdimensioninbiologicalanalyses(杂交瘤生物分析新方向)，PlenumPress,NewYork]。通过将鼠脾脏细胞与鼠骨髓瘤细胞融合制备的杂交瘤已被记载于文献Kohler等，Eur.J.Immunol.6,511-519(1976);Milstem等.Nature,266,550(1977);和Walsh,Nature,266，550(1977);和Walsh,Nature,266,495(1977)。这种技术还被很详细地描述于Herzenberg和Milstem,《实验免疫学手册》(HandbookonExperimentalImmunology)，主编，Weir(BlackwellScientific,London),1979,第25.1至25.7页，以及Kennett等，同上。关于用杂交瘤技术制备抗人肺瘤的单克隆抗体的专利包括美国专利号4,182,124和4,196,265。涉及对癌细胞上抗原具有特异性的单克隆抗体的代表性文献是美国专利号4,350,683。在EGFR酪氨酸激酶功能区中的特异性突变是与吉非替尼或厄洛替尼的敏感性相关的，但是获得性抗性的机理尚未见报道。基于用另一种激酶抑制剂一一伊马替尼在其它疾病中类似的研究，可以预计单个氨基酸在野生型EGFR激酶功能区的790位上取代，由苏氨酸换成曱硫氨酸，从而导致药物抗性，甚至早期有人^t艮道，在NSCLC中，EGFR的外显子19和21突变与药物的响应性相关。用曱硫氨酸置换Thr-766(ACG到ATG)的C至T转换突变体外表现于野生型EGFR的背景中，从而赋予对吉非替尼[21]和相关的喹唑啉抑制剂，PD153035[22]的抗性。实施例材料和方法组织的:f又得肿瘤试样，包括石蜡块、细针活组织检查以及胸腔积液，都是经纪念Sloan隱Kettering癌症中心学院审查委员会(InstitutionalReviewBoardofMemorialSloan-KetteringCancerCenter)批准的协议书(协i义书92-055[7]和协议书04-103[协议书Sl])而获得的。所有的患者都提供了告知同意书。在肺肿瘤中EGFR和KRAS的突变分析从肿瘤试验中提取基因组DNA,以及用于EGFR(外显子18-24)和KRAS2(外显子2)分析的引物已被公开[3,7]。所有的测序反应是以正向和反向而实现的，而且所有突变都至少从独立的PCR分离物确认两次。在毛细管电泳设备上(ABI3100Avant,AppliedBiosystems,福斯特市，显子20突变(T790M),依据T790M突变(2369C—T)产生的、新的Nlalll限制性位点。使用了如下的引物EGFREx20F,5'隱FAM-CTCCCTCCAGGAAGCCTACGTGAT-3'(SEQIDNO:4)和EGFREx20R5'-TTTGCGATCTGCACACACCA-3'(SEQIDNO:5)。为了标定，应用依次混合来自NSCLC细胞系(H1975,L858R-和T790M-阳性；H-2030,EGFR野生型)的DNA稀释物，这种检验4全测了T790M突变的存在，当H1975DNA占被检总DNA的3%以上时，而直接测序(未显示数据)的敏感度为6%,条件是含有T790M突变的等位基因在H1975细胞中被扩增了2倍左右。RT國PCR应用下列的引物以产生包含外显子20的cDNA片段EGFR2095F5'-CCCAACCAAGCTCTCTTGAG-3'(SEQIDNO:6)和EGFR2943R5'-ATGACAAGGTAGCGCTGGGGG-3'(SEQIDNO:7)。EGFR2095F和EGFR2943R靶向的序列加下划线示于表1中。应用TOPOTA-克隆试剂盒(Invitrogen,卡尔斯巴德市，加利福尼亚州，美国)，按照制造商的指示，将PCR产物连接至质粒中。应用克隆载体的T7启动位点，将来自每个克隆的小量DNA进行测序。突变EGFR的功能分析应用QuikChange定点诱变试剂盒(Stratagene,LaJolla,加利福尼亚州，美国)，将突变引入全长的野生型和突变的EGFRcDNA,并且克隆至表达载体，如[3]所述。用以下的引物产生缺失(del)L747-E749;A750P突变体正向5'隱TAAAATTCCCGTCGCTATCAAGGAGCCAACATCTCCGAAAGCCAACAAGG-3'(SEQIDNO:8)和反向5'-CCTTGTTGGCTTTCGGAGATGTTGGCTCCTTGATAGCGACGGGAATTTTA-3'(SEQIDNO,9)。应用下列的引物以引入T790M突变正向5'-AGCTCATCATGCAGCTCAT-3'(SEQIDNO:10)和反向5'-ATGAGCTGCATGATGAGCT-3'(SEQIDNO:11)。早期已产生了L858R突变cDNA[3]。所有的突变克隆都一皮全部地、双向地再测序以确保没有额外的突变被引入。各种EGFR被瞬时表达在293人胚胎肾细胞中，如所报道的[3]。用不同浓度的吉非替尼或厄洛替尼处理细胞。免疫印迹更详细的，参见在[3]中关于细胞溶解、免疫印迹和抗体试剂的方法和补充方法。所有的分析至少进行了三次独立的实验。细胞培养自美国典型培养物保藏中心(马纳萨斯，弗吉尼亚州，美国)购得NSCLC细胞系H1650,H1975,H2030,H2347,H2444,H358,和H1734。H3255是B.Johnson和P.Janne赠送的。将细胞培养于补充了10%小牛血清、10单位/ml青霉素以及10吗/ml链霉素)的完全生长培养基(RPMI-1640;美国典型培养物保藏中心，保藏号30-2001)，37。C和5。/。C02。为了进行生存力研究，将细胞接种于在黑色96-孔清晰底视板(ViewPlates)(PerkinElmer,Wellesley,马塞诸塞州，美国)中的完全生长培养基里，密度为每孔5,000个细胞(H1975和H2030)或7,500个细胞(H3255)。培养过夜后，将细胞培养于补充了0.1。/。血清的RPMI-1640培养基中24小时。然后，在持续存在吉非替尼或厄洛替尼下，培养细胞48小时(在补充了0.1%血清的RPMI-1640培养基中)。生存力检验应用钙黄绿素AM(钙黄绿素的乙酰氧甲酉旨,MolecularProbes,Eugene,俄勒冈州，美国)检验细胞生存力。然后用吉非替尼或厄洛替尼孵化，用PBS(含有钙和镁)沖洗单层两次，而且用在补充RPMI-1640(无血清)的7.5pmol4丐黄绿素AM中培养30分钟。除去标记培养基，并且用PBS沖洗细胞三次。立刻应用载体V多标记读板器(PerkinElmer)检测钙黄绿素荧光(Ex，485nm;Em,535nM)。每个细胞系进行三个独立的实验；每个实验包括每个条件重复四至八次。制备抗突变EGFR的单克隆和多克隆抗体^寻三个一组Balb/c站,性小鼠(CharlesRiverBreedingLaboratories,威灵顿市，马塞诸塞州)在第0,3,7，10和14天进行腹膜内注射5lag/剂在lOOplDetox佐剂(RIBIImmunoChemResInc,汉密尔顿市，密苏里州)中、含有T790M突变的、被纯化截短的EGFR蛋白或其片段。在第17天，将动物杀死，取出它们的脾脏，而且应用50%聚乙二醇4000、根据已确立的方法(参见美国专利号5,939,269和5,658,791，引入这里作为参考)，将淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞系653融合。将被融合的细胞铺板于96孔微量滴定板内，密度为2xl0"田胞/孔，随后在融合后第1天HAT选择。然后将固定化杂交瘤培养物上清液与生物素化EGFRT790M突变体反应。将抗EGFR抗体阳性的孔进行扩增用于进一步研究。当被扩增时，这些培养物保持稳定，并且冰冻保存细胞系。将双亲培养物同种化，然后4企验它们捕捉以及特异性识别EGFRT7卯M突变体的能力。或者，生成抗纯化突变蛋白质肽的多克隆家兔抗血清。抗EGFRT790M突变体的多克隆抗体可这样获得，将这种肽偶合至具有0.05%戊二醛的钥孑L嘁血蓝蛋白(KeyholeLimpetHemocyanin)，在弗氏(Freund，s)完全佐剂中乳化并且在几个部位皮内注射。四至七星期后，将动物用乳化于弗氏不完全佐剂中被偶合的肽刺激，在最后一次注射后的十天取血。然后，根据上述方法制备的抗体用于鉴别和/或诊断肿瘤细胞(即在癌组织的超薄切片中)中EGFRT790M突变的表达和/或用于治疗方法，才艮据现有技术中已知的标准方法，例如，美国专利号5,601,989,5,563,247,5,610,276和5,405,941，引入这里作为参考。这些相同的抗体用于监测EGFRT790M突变体的表达。实施例1为了确定EGFRT790M突变的存在，通过应用一种含有一个3'端和3-硝基吡咯残基的碱基错配PCR引物而扩增突变等位基因，实现基于等位基因特异性寡核苷酸PCR的检验(Guo,Z.,Liu，Q.&Smith,L.M.Enhanceddiscriminationofsinglenucleotidepolymorphismsbyartificialmismatchhybridization(通过人工错配杂交而提高的单核苷酸多态性识别).Nat.Biotechnol.15,331-335(1997))。生成PCR产物，带有3'突变等位基因特异性引物(5'CACCGTGCAGCTCATCAT3'(SEQIDNO:12)或5'CGAAGGGCATGAGCTGCG3'(SEQIDNO:13))该引物包括在3'端和3'端上游的3-硝基吡咯残基处突变碱基的互补体。突变等位基因特异性引物能够扩增取自冷冻或石蜡包埋肿瘤的突变DNA,但是不能产生源自正常DNA的产物。同时，野生型(WT)3'引物(5'CACCGTGCAGCTCATCAC3'(SEQIDNO:14)或者5'CGAAGGGCATGAGCTGCA3'(SEQIDNO:15》仅能够扩增正常的野生型DNA,而不能扩增突变DNA。这些实验表明，突变等位基因在肿瘤样品中被扩增，但是它在正常相邻组织中不被扩增。实施例2.EGFRT790M突变的克隆起源当试图增加任何给定样品中肿瘤细胞相对百分比而实行小心的肿瘤显微解剖时，T:C等位基因的比率按比例地增加。用实施例l里所述的其中一个引物以及以相反义扩增的另一个引物实施PCR,这样可以获得一个用于EGFR序列、易于检测的片断，无论是突变的还是野生型，其存在正方法的结果证实了EGFRT790M突变是以起源形式克隆的。实施例3.在基因组DNA中EGFRT790M突变的才企验本发明提供了用于检测EGFRT790M突变的方法，籍此使用限制性酶NlaIII来识别在突变密码子上缺少或存在限制性位点。在本实施例中，提供了一种检验，应用了包含外显子20的内含子-夕卜显子边界的引物。基于荧光的检测利用了经特异性错义突变而产生的PCR限制性片断长度多态性(PCR-RFLP)。用包含核苷酸2369的外显子20特异性引物EGFREx20F(SEQIDNO:4)和EGFREx20R(SEQIDNO:5)(在表4中划有下划线)，实施PCR扩增。表4包括表3(SEQIDNO:3)中给出的、一部分较大内含子-外显子20-内含子基因组序列，从161904位至162970位。外显子20上游的内含子的3'末端以粗体表示。表4,gtattttgaaactea甚gategcattca购ogtcttea效t:ggaag^gteeatgt^ee偶fceette，gj一他"附""^g^^"^^^^^加^tccebceto域啦aag些^^^卯ecage9.t雜aGaaccoceacgtgtgccgcctgctgggcatctgccteacetGG教CGgtgeagcteate^^gra2野生型序列包含特异性NlaIII位点，经消化产生106-bp产物(参见方法；图3A)。突变2369T核苦酸的存在制造了一个新的NlaIII限制性消化位点，产生稍短的产物(97bp;图3A),它是易于用荧光毛细管电泳检测的。这种检验是比直接测序更灵敏2倍左右。预期任何切割2369等位基因(野生型或突变的)的一种而不切割另外一种的等同工具用于这种标记片断长度检验。这种检验需要应用任何已知的、将标记结合至PCR扩增子的方法，以便于得到的片断是可检测的。实施例4.病例报告我们在经吉非替尼或厄洛替尼其疾病进展的六例个体的三例中鉴定了继发性EGFR突变(表5)。三例患者的简略病例史介绍如下。患者1某63岁女性"从未吸烟者"(在她一生中吸少于IOO支香烟)初始表现双侧弥散性胸部不透明而且右侧胸膜积液。经支气管活组织检验揭示为腺癌。经两个周期的系统性化疗疾病进展，之后开始吉非替尼，每日250mg。比较开始吉非替尼之前(图4A，左图板)和2周之后的胸部放射片(图4A,中部图板)表明显著改善。9个月后，胸部放射片揭示疾病进展(图4A,右图板)。随后，患者经历了在右肺底部区域的计算断层摄影术(CT)引导的活检(图5A,左图板)。尽管继续用吉非替尼治疗，无论用化疗或每日500mg,在开始吉非替尼之后12个月，胸膜积液仍复发(图5A,右图板)。获得胸膜流体用于分子研究。总之，该患者有三个肿瘤试样可供分析最初肺肿瘤活检，进行性肺损伤的活检以及胸膜流体。尽管如此，复查最初经支气管的活检表明，它有不足的肺瘤细胞(表5)。患者2某55岁妇女，有9包每年的吸烟史，因带有局灶侵润的细支气管肺泡癌，在两年内经历了两次外科切除术(右下叶和左上叶)。两年后，她的疾病复发，带有双侧肺结节，经系统性化疗进一步进展。此后，患者开始厄洛替尼，每日150mg。胸部基线CT扫描证实了数不清的双侧结节(图4B,左图板)在4个月治疗之后在数量和大小上都显著地减少(图4B,中部图板)。14个月治疗后，因疲劳患者的厄洛替尼用量降至100mg每日。在用厄洛替尼治疗23个月时，CT扫描证实了在胸推中硬性损伤扩大。该患者经历了CT-引导的、这种损伤活检(图5B，左图板)，而且将厄洛替尼用量降至每日150mg。在25个月的治疗后，疾病在肺内进展(图4B,右图板)。厄洛替尼被终止，而且在肺中进行性疾病的部位上实施了荧光透视引导的核心针活检(图5B,右图板)。总之，该患者有三个肿瘤试样可供分析最初切除的肺肺瘤，扩大的脊推损伤的活;险，以及进行性肺损伤的活检(表5)。患者3某55岁女性"从未吸烟者"因伴有细支气管肺泡癌特征的腺瘤，涉及她的左下叶、胸膜以及纵隔淋巴结，每周用紫杉醇和曲妥珠单抗[17]治疗近4.5年。因疲劳而终止治疗。随后，该患者经历了外科切除术。因为转移涉及多重的纵隔淋巴结且当时所知的临床特征预计是对吉非替尼的响应(女性，从未吸烟者，细支气管肺泡变异组织学)，l个月后，她被安置到"辅助"吉非替尼(图4C,左图板)。三个月后这种药被终止，此时她发展了新的左侧恶性胸膜积液(图4C，中部图板)。尽管排水和系统性化疗，但是4个月后胸膜积液复发(图4C，右图板)，此时收集胸膜用于分析。总之，该患者有两个临床试样供分析来自外科切除术的肿瘤和胸膜流体(表5)。表5.本研究中分析在EGFR酪氨酸激酶功能区(外显子18至24)和KRAS(外显子2)中突变的试样<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>在患者1中经支气管活检具有不足的肿瘤细胞；测序分析揭示仅野生型序列(参见正文)。在三个其它病例中，既没有鉴别到另外的EGFR也没有KRAS突变(数据未标出)。胂瘤细胞百分数通过评估相应的组织病理学切片而确定，del:缺失；n/a-不适用。实施例5.患者肿瘤含有对EGFR酪氨酸激酶抑制剂敏感性相关的EGFR酪氨酸激酶功能区域突变通过外显子19和21的直接DNA测序[3]，我们筛选了所有可用的、来自实施例4中所述的三例患者的肿瘤样品的之前描述的药物-敏感性EGFR突变。来自患者1的肺瘤样品显示在核苷酸2573上的T—G变化，导致了在药物-响应肿瘤中通常观察到的、外显子21L858R氨基酸替换。这种突变存在于来自进行性肺损伤(图6A,上部图板；表5)和来自胸膜积液细胞(图6A,下部图板；表5)的活检材料中，这两种在细胞病理学检查上的来源占据了多数的肿瘤细胞(表5)。有趣的是，示踪的对比说明了在突变等位基因拷贝数方面的增加已经存在。特别地，当在肺活检试样中(图6A,上部图板)2573位上野生型(核苦酸T)对突变体(核苷酸G)峰比率约为1:1或1:2时，胸膜流体细胞证实了主要的突变G峰(图6A,下部图板)。与此一致，在核香酸2361处记录的单个核苷酸多态性(SNP)证明了相应的A:G比率变化，在经支气管的活检中为1:1比率，而在胸膜流体中为5:1比率(图7A)。值得注意的是，我们并没有在最初的经支气管活检试样中检测到2573T—G突变(表5;数据未标出)。如上所述，这种晚些的试样含有不足的肺瘤细胞，最大的可能是少于经直接测序而检测EGFR突变所需的(参见[7]。)来自患者2的所有三个试样，包括最初的肺肺瘤以及两个来自骨和肺的转移样品，表明外显子19缺失，涉及11个核苷酸(2238-2248)的消除以及两个核苷酸G和C的插入(图6B,所有的图板；表5)。这些核苷酸变化缺失了氨基酸L747-E749而且将氨基酸750从丙氨酸变成了脯氨酸(A750P)。有人早期报道了带有不同核苷酸变化的缺失L747-E749;A750P突变[2]。在来自患者2的所有样品中，野生型序列主流于突变序列，比率为3:1左右。来自患者3的两个可用肿瘤样品在外显子19中包括了15个核苷酸的缺失(2236-2250)(表5;数据未标出)，导致五个氨基酸的消除(delE746-A750)。这种特异性缺失早期已有报道[3]。在两个试样中突变体对野生型峰比率为大约1:1(数据未标出)。总起来说，这些结果证实了来自所有三例患者的肺瘤含有对酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼和厄洛替尼敏感性相关的EGFR突变。此外，这些数据表明在单个患者中对脊推、肺和胸膜流体的转移或者复发损伤都包括相同的突变。这些后期的观察支持这个观点，即个体中复发和转移的肿瘤细胞都来源自最初的祖克隆。实施例6.在经吉非替尼或厄洛替尼治疗后进展的损伤中检测的EGFR激酶功能区域中的继发性错义突变为了确定EGFR激酶功能区域中的额外突变是否与这些患者中疾病的进展有关，我们在可用的肺瘤试样中进行了所有编码EGFR催化区域的外显子(18至24)直接测序。患者1吉非替尼前试样的分析，其包含了不足的肿瘤细胞(表5;参见上面)，未令人惊奇地仅显示野生型EGFR序列(表5;数据未标出)。但是，仔细分析来自经吉非替尼疾病进展之后获得的患者肺活检试样、正向和反向的外显子20序列色谱图，证实在核香酸2369上额外的小峰，暗示C—T突变(图7A,上部图板；表5)。这种核苦酸变化导致曱硫氨酸在7卯位替换了苏氨酸(T7卯M)。来自患者胸膜流体的细胞中，2369C~>T突变峰甚至是更突出，所述的流体是在经吉非替尼疾病进一步进展之后而获得的(图7A,下部的图板；表5)。从分析肺试样和胸膜流体而获得的突变体对野生型峰比率的增加，并行于在核苷酸2573处突变G峰(导致L858R突变)对野生型T峰比率的增加(参见上面；图6A)以及在2361位上A:GSNP比率的增加(图7A)。总之，这些发现意味着，外显子20T790M突变存在于相同的等位基因上如同外显子21L858R突变，并且隐藏了这些突变的细胞亚克隆在药物治疗期间显现。在患者2中，在用厄洛替尼治疗前获得、富含肺瘤的样品在编码EGFR酪氨酸激酶功能的外显子中不含有任何的额外突变(图7B,上部图板；表5)。相对照地，她的进展的骨和肺损伤在核苦酸2369处含有额外的小峰，暗示了存在在患者1中观察到的、带有相同C—T突变的肿瘤细胞亚克隆(图7B，中部和下部图一反；表5)。在这些晚期两个样品中所见到的、2369T突变峰的相对大小，似乎相关于外显子19缺失的相应峰的相对大小(图6B)。有趣的是，在核苷酸2361处(A或G)的SNP在患者2用厄洛替尼治疗之前的试样中被检测到，但在治疗之后的未被检测到，表明在治疗过程中一个EGFR等位基因经历了扩增或缺失(图6B)。患者3表现类似于患者2的那些结果。除了delE746-A750外显子19缺失，富含肿瘤、治疗前的试样未证明EGFR突变；特别地，在外显子20中，未检测到继发性变化(图7C,上部图板；表5)。但是，分析来自用吉非替尼治疗后发展了的胸膜积液中细胞的DNA，表明在外显子中核苷酸2369处C—T突变(图7C，下部图板；表5),对应于上述的T7卯M突变。在两个样品间，在2361位上A:GSNP的比率没有变化。突变2369T峰是小的，可能是因为当收集胸膜流体肺瘤细胞时吉非替尼已在该患者中终止了4个月；因此，并未赋予带有T790M突变的细胞有选择性优势。为了确定2369C—T突变是否是早期被忽视的、在NSCLC中发现过的EGFR突变，我们再次核查了衍生自分析所有那些在用EGFR酪氨酸激酶抑制剂治疗前从患者取出的、96个新鲜冷冻的、被切除的肿瘤[3]和59个石蜡包埋肿瘤[7]的外显子20序列示踪。在这些155个肿瘤中我们未检测到任何的T790M突变迹象(数据未标出)。总之，我们的结果表明，T7卯M突变是与当经吉非替尼或厄洛替尼而进展的损伤相关。另外，至少在患者1和2中，带有这种突变的肿瘤细胞亚克隆显现于开始用酪氨酸激酶抑制剂治疗的与出现药物抗性的时间之间。此外，在用如上详述的T790M突变进行初始表征三例患者之后，在总计13例经治疗初始响应然后复发的患者中，发现另外的四例患者在发展了对易瑞沙或特罗凯抗性之后具有T790M突变。表6概述了该结果(该现有T790M的患者数据)表6<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>在七例患有肺腺瘤、经过用吉非替尼或厄洛替尼治疗改善但是随后进展的患者(这里未描述病例史)中，我们检查了源自疾病进行期间获得的肿瘤试样的DNA。在所有的七例患者中，我们发现了与药物敏感性相关的EGFR突变(所有的外显子19缺失)。但是，我们在EGFR的外显子18至24中未发现任何额外的突变，包括在2369位上C—T变化(数据未标出)。这些结果意味着存在获得性药物抗性的另外机理。实施例7.患者的进行性肿瘤缺少KRAS突变在KRAS2的外显子2中的突变发生在约四分之一的NSCLC中。这种突变，如果有过的话，很少伴有EGFR突变而且与原发性对吉非替尼或厄洛替尼抗性相关[7]。为了评价继发性KRAS突变赋予对这些药物获得性抗性的可能性，我们实施了来自患者1至3以及缺少T790M突变迹象的、另外三名患者的肿瘤试样的KRAS2外显子的突变布图(mutationalprofiling)。在KRAS中所有的试样都不包括任何变化(表5,数据未标出)，表明KRAS突变不是这六例患者中药物抗性以及肺瘤进展的成因。实施例8.确立的NSCLC细胞系也包括T790M和L858R突变我们描绘了在八个确立的NSCLC细胞系中EGFR酪氨酸激酶功能区(外显子18至24)和KRAS外显子2(表7)。令人惊奇地，一个细胞系一H1975—在2369位上包含相同的、如上述的C—T突变(图7D,下部的图板)。其它人早期已证明这种细胞系在外显子21中包含2573T—G突变(L858R)[18]，这正是我们确认的(图7,上部图板)；此外，据报道，H1975比带有野生型EGFR的其它肺癌细胞系对吉非替尼抑制更敏感[18]。在本发明公开的研究中，仅对外显子19和21进行了表面上检查。表7.被分析EGFR酪氨酸激酶功能区(外显子18至24)和KRAS(外显子2)突变的NSCLC细胞系的状况<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>del:缺失。更详细内容参见方法。在我们自己分析H1975(外显子18至24)中，产生T790M氨基酸置换的突变2369T峰是突出的，说明与野生型等位基因相比突变等位基因拷贝数增加。突变体与野生型的峰比率相似于突变2573G(对应于L858R氨基酸置换)与野生型T峰的比率(图7D,所有的图板)，意味着T790M和L858R突变是在相同的被扩增等位基因中。为了进一步调查这种可能性，我们实施了RT-PCR以产生包含EGFR外显子20而且包含从外显子19到21片段的cDNAs。然后，克隆PCR产物，并分析各个集落的EGFR突变。来自四个克隆四个DNA的测序色:^普图显示了2369C—T和2573T—G突变，确定了两个突变是在相同的等位基因中(数据未标出)。其它的NSCLC细胞系载有EGFR或者KRAS突变，但是没有一个同时含有两者(表7)。如报道的，H3255含有L858R突变[19]而且H1650含有一个外显子19缺失[18]。被分析的其它细胞系在编码EGFR酪氨酸激酶功能区中没有包含额外的突变。实施例9.一种新的PCR限制性片断长度多态性分析独立地确定T790M突变的不存在或存在如上所述，提示在外显子中T790M突变的突变体峰在一些序列色谱图中是小的。为了消除这些峰归于背景"噪音，，的可能性，我们打算确认2369C—T突变存在于特定的样品中，通过开发独立的检验，基于利用由特异性错义突变产生的、PCR限制性片断长度多态性(PCR-RFLP)的荧光检测检验。在用包含核苷酸2369的外显子20特异性引物PCR扩增之后，野生型序列包含特异性NlaIII位点，经消化得到106-bp的产物(参见方法；图3A)。突变2369T的存在产生了新的NlalII限制性消化位点，得到一个易于用荧光毛细管电泳4企测的、稍短的产物(97bp)。这种检验比直接测序更敏感2倍左右(参见方法；数据未标出)。我们首次使用了来自H1975细胞系(包含T790M和L858R突变)的DNA,以确定PCR-RFLP检验的特异性。正如所料，分析这些细胞产生了97-和106-bp片断。相反地，分析来自H2030(包含野生型EGFR;表7)的DNA仅显示106-bp片断。这些数据证明了这种检验可容易地指示在DNA样品中不存在或存在突变等位基因。但是，这种检验只是半定量的，因为突变体97-bp产物与野生型106-bp产物的比率在独立实验中从约1:1至2:1变化。我们再次应用这种PCR-RELP检验，以评估各种患者样品对应于T790M氨基酸置换的特异性2369CT突变的存在。来自患者1中进行性骨和肺损伤的DNA产生了97-和106-bp片断，但是来自最初肺肺瘤的DNA未产生(图3B)。突变体对野生型产物的比率在来自胸膜流体的细胞中更高，与在来自直接测序外显子20的色谱图中所看到的、更高的峰相一致(参见图7A)。同样地，来自患者2和3的晚期损伤的DNA在PCR-RFLP4企验中产生了97-和106-bp片断(图3B),然而处理前的试样没有产生97-bp产物。总之，这些来自独立检验的数据确定了T790M突变存在于来自所有的三例患者的进行性损伤中。我们尚不能检测在来自另外三例获得性抗性患者的任何试样中的T790M突变，通过直接测序不能证实在EGFR外显子18至24中继发性突变(数据未标出)。实施例10.EGFR突变体的生化性质为了确定T790M突变如何影响已包含关联EGFR酪氨酸激酶抑制剂敏感性的突变的EGFR蛋白，我们将特异性突变分别地引入在患者1和2中发现的、编码外显子21和19突变的EGFRcDNA。然后，以具有非常低水平内源性EGFR的、293T细胞中的表达载体瞬时转染来生成对应的蛋白质([i]L858R与L858R+T790M,[ii]缺失L747-E749;A750P与缺失L747-E749;A750P+T790M,和[iii]野生型EGFR与野生型EGFR+T790M)[3]。用免疫印迹法分析来自血清々几饿和用吉非替尼或厄洛替尼处理前的细胞的各种溶解物。应用抗-EGFR单克隆抗体和用作每个样品相对水平蛋白质指示剂的肌动蛋白，测定总EGFR(t-EGFR)的量。为了评价各种EGFR激酶在替代检验中的药物敏感性，我们使用了Y1092-磷酸酯-特异性抗体(即，磷酸-EGFR[p-EGFR])以检测在EGFR上相对于t-EGFR蛋白水平的、"自磷酸化"Tyr-1092的水平。通过应用普遍的抗-磷酸酪氨酸试剂(RC-20)，我们还评价了细胞蛋白质的被诱导酪氨酸磷酸化的整体模式和水平。逐渐地增加药物浓度，吉非替尼渐进抑制野生型和L858REGFR活性，如同减少酪氨酸-磷酸化蛋白质(图8A)和p-EGFR:t-EGFR比率降低(图8B)所表现出的。相反地，包含T790M突变的野生型和突变EGFR在磷酸酪氨酸诱导或者p-EGFR:t-EGFR比率方面没有显示出显著的变化(图8A和8B)。应用厄洛替尼对抗野生型和缺失E747-L747;A750PEGFR与含有T790M突变的对应突变体相比较，获得相似的结果(图8C)。这些结果说明，T790M突变可能削弱了吉非替尼或厄洛替尼抑制EGFR酪氨酸激酶活性的能力，甚至在临床上与药物敏感性相关的EGFR突变体(即L858R或外显子19缺失)中。实施例ll.隐藏了T790M和L858R突变的NSCLC细胞系对吉非替尼或厄洛替尼的抗性。为了进一步探究T7卯M突变的功能性结果，我们确定了在存在吉非替尼或厄洛替尼的条件下生长各种NSCLC细胞系的壽文感性，应用了基于钙黄绿素AM的#企验。这种荧光酯酶底物的吸收和保留经载体与药物处理的活细胞允许在细胞系之间比较相对的细胞生存力[20]。隐藏着L858R突变而无其它EGFRTK功能区突变(表7)的H3255细胞系，敏感于用IC50约为O.Olpmol、用吉非替尼的治疗(图9)。相反地，含有L858R和T790M突变的H1975细胞系对用IQo约为l)imol(图9)药物的壽丈感性少大约100倍。事实上，H1975细胞的敏感性更近似于含有野生型EGFR(外显子18至24)和突变KRAS(图9)的H2030。用厄洛替尼获得了非常相似的结果(图10)。尽管本发明已公开并且以示例性实施方式在这里予以说明，但是所有等同的实施方式，包括变更、增加和省略，都包括在如说明书和权利要求书中所公开的、本发明的精神和范围内。参考文献1.LynchTJ,BellDW,SordellaR，GumbhagavatulaS,OkimotoRA,etal.(2004)Activatingmutationsintheepidermalgrowthfactorreceptorunderlyingresponsivenessofnon-small-celllungcancertogefitinib.NEnglJMed350:2129-2139.2.PaezJQJannePA,LeeJC,TracyS,GreulichH,etal.(2004)EGFRmutationsinlungcancer:Correlationwithclinicalresponsetogefitinibtherapy.Science304:1497-1500.3.PaoW，MillerV,ZakowskiM，DohertyJ,PolitiK,etal.(2004)EGFreceptorgenemutationsarecommoninlungcancersfrom"neversmokers"andareassociatedwithsensitivityoftumorstogefitinibanderlotinib.ProcNatlAcadSciUSA101:13306-13311.4.HuangSF,LiuHP,LiLH,KuYC,FuYN,etal.(2004)Highfrequencyofepidermalgrowthfactorreceptormutationswithcomplexpatternsinnon-smallcelllungcancersrelatedtogefitinibresponsivenessinTaiwan.ClinCancerRes10:8195-8203.5.KosakaT，YatabeY,Endoh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a)给出序列的序列；或d)在a)-c)给出序列的互补体。7.—种在样品中检测突变表皮生长因子受体(EGFR)基因的方法，其包括借助选择性检测在相应于EGFRcDNA碱基2369的位置上含有突变T的核苷酸序列的工具探测样品，而且鉴定在所述位置上的碱基为T。8.如权利要求7中所述的方法，其中所述的工具辨别检测在所述位置上的突变T和野生型C。9.如权利要求7中所述的方法，其中所述样品包括是或者疑是癌的或恶性的组织或细^^。10.如权利要求7中所述的方法，其中所述样品或其一部分在所述探测步骤前被扩增。11.如权利要求7中所述的方法，其中在所述样品或其一部分中的核酸在所述探测步骤前被扩增。12.权利要求7中所述的方法，其中所述探测步骤包括a)需要时，处理所述样品以释放其中所含的核酸；b)将自所述样品中获得的核酸与包括第一聚合酶链式反应(PCR)引物的组合物相接触，该引物杂交至在对应于EGFRcDNA碱基2369的位置上包括突变T的有义链序列或反义链序列，而且其中该引物在PCR条件下^f艮弱地或者根本不杂交至在2369位上含有野生型C的第二EGFR多核苦酸；和c)在第二PCT引物存在下进行PCR反应以提供在相应于碱基2369位置上含有突变T的PCR扩增子。13.如权利要求12中所述的方法，其中该PCR反应将标记物引入PCR扩增子并且所述鉴定步骤包括;险测所述标记物。14.如权利要求7中所述的方法，其中所述探测步骤包括a)需要时，处理所述样品以释放其中所含的核酸；b)将自所述样品中获得的核酸与包括一对聚合酶链式反应(PCR)引物的组合物相接触，该对引物在适宜的PCR条件下杂交至编码EGFR多肽的多核苷酸，其中该对引物附于相应于EGFRcDNA碱基2369的位置两侧以提供PCR混合物；c)对所述混合物进行PCR反应，以提供包含相应于碱基2369位置的PCR扩增子；和d)将所述扩增子与切割工具相接触，所述切割工具以下述方式之一切割所述扩增子i)在所述位置的6个碱基内切割在相应于碱基2369位置上具有突变T的扩增子，但不如此切割在该位置上具有野生型C的扩增子，或者ii)在所述位置的6个碱基内切割在相应于碱基2369位置上具有野生型C的扩增子，但不如此切割在该位置上具有突变T的扩增子。15.如权利要求14中所述的方法，其中所述PCR反应将标记物引入所述PCR扩增子而且所述鉴别步骤包括;险测所切割的标记的多核苷酸的长度多态性。16.如权利要求7中所述的方法，其中所述探测步骤包括a)需要时，处理所述样品以释放其中所含的核酸；b)将至少一部分的自所述样品中获得的核酸固定在固体载体上；和c)用探针寡核苷酸与所固定的核酸相接触，该探针寡核苷酸杂交至编码EGFR多肽的多核苦酸，其中所述探针的序列包括与在相应于EGFRcDNA碱基2369的位置上突变T互补的碱基，并且其中所述探针在适宜的杂交条件下很弱地或者根本不杂交至在2369位上含有野生型C的多核苷酸。17.如权利要求16中所述的方法，其中所述探针寡核苷酸包括标记物而且所述鉴定步骤包括检测该标记物。18.如权利要求7中所述的方法，其中所述探测步骤包括a)需要时，处理所述样品以释放其中所含核酸；b)固定探针寡核苷酸，该4果针寡核苦酸杂交至编码EGFR多肽的多核苷酸，其中所述探针的序列包括与在相应于EGFRcDNA碱基2369的位置上突变T互补的碱基，且其中所述探针很弱地或者根本不杂交至在固体载体上在2369位上含有野生型C的多核苷酸；c)用至少一部分自所述样品中获得的核酸在适宜的杂交条件下接触所固定的探针。19.如权利要求18中所述的方法，其中所述核酸包括标记物而且所述鉴定步骤包括检测该标记物。20.—种在患有或怀疑患有癌的个体中预测对吉非替尼或厄洛替尼治疗效果抗性的方法，该方法包括a)从该个体获得样品；b)借助选择性检测在相应于EGFRcDNA碱基2369的位置上含有突变T的核苷酸序列的工具探测所述样品；c)鉴定在所述位置上的石成基为T;由此该个体净皮予贞观'J出对吉非替尼或21.如权利要求20中所述的方法，其中所述的工具辨别检测在所述位置上的突变T和野生型C。22.如权利要求20中所述的方法，其中所述样品包括是或者疑是癌的或恶性的组织或细胞。23.如权利要求20中所述的方法，其中所述样品或其一部分在所述才笨测步骤前被扩增。24.如权利要求20中所述的方法，其中在所述样品或其一部分中的核酸在所述探测步骤前被扩增。25.如权利要求20中所述的方法，其中所述探测步骤包括a)需要时，处理所述样品以释放其中所含核酸；b)将自所述样品中获得的核酸与包括第一聚合酶链式反应(PCR)引物的组合物相接触，该引物杂交至在对应于EGFRcDNA碱基2369的位置上包括突变T的有义链序列或反义链序列，而且其中该引物在PCR条件苷酸；和c)在第二PCT引物存在下进行PCR反应以提供在相应于碱基2369位置上含有突变T的PCR扩增子。26.如权利要求25中所述的方法，其中该PCR反应将标记物引入所述PCR扩增子并且所述鉴定步骤包括^r测该标记物。27.如权利要求20中所述的方法，其中所述探测步骤包括a)需要时，处理所述样品以释放其中所含核酸；b)将自所述样品中获得的核酸与包括一对聚合酶链式反应(PCR)引物的组合物相接触，该引物在适宜的PCR条件下杂交至编码EGFR多肽的多核苷酸，其中该对引物附于相应于EGFRcDNA碱基2369的位置两侧以提供PCR混合物；c)对所述混合物进行PCR反应，以提供包含相应于碱基2369位置的PCR扩增子；和d)将所述扩增子与切割工具相接触，所述切割工具以下述方式之一切割所述扩增子i)在所述位置的6个碱基内切割在相应于碱基2369位置上具有突变T的扩增子,但不如此切割在该位置上具有野生型C的扩增子，或者ii)在所述位置的6个碱基内切割在相应于碱基2369位置上具有野生型C的扩增子，但不如此切割在该位置上具有突变T的扩增子。28.如权利要求27中所述的方法，其中所述PCR反应将标记物引入所述PCR扩增子而且所述鉴别步骤包括检测所切割的标记的多核苷酸的长度多态性。29.如权利要求20中所述的方法，其中所述探测步骤包括a)需要时，处理所述样品以释放其中所含核酸；b)将至少一部分的自所述样品中获得的核酸固定在固体载体上；和c)用探针寡核苷酸与所固定的核酸相接触，该探针寡核苷酸杂交至编码EGFR多肽的多核苷酸，其中所述探针的序列包括与在相应于EGFRcDNA碱基2369的位置上突变T互补的碱基，并且其中所述探针在适宜的杂交条件下很弱地或者根本不杂交至在2369位上含有野生型C的多核苷酸。30.如权利要求28中所述的方法，其中所述探针寡核香酸包括标记物而且所述鉴定步骤包括一企测该标记物。31.如权利要求20中所述的方法，其中所述探测步骤包括a)需要时，处理所述样品以释放其中所含核酸；b)固定探针寡核苷酸，该探针寡核苷酸杂交至编码EGFR多肽的多核苷酸，其中所述探针的序列包括与在相应于EGFRcDNA碱基2369的位置上突变T互补的碱基，且其中所述探针很弱地或者根本不杂交至在固体载体上在2369位上含有野生型C的多核香酸；和c)用至少一部分自所述样品中获得的核酸在适宜的杂交条件下接触所固定的探针。32.如权利要求31中所述的方法，其中所述核酸包括标记物而且所述鉴定步骤包括检测该标记物。33.选择性检测在相应于EGFRcDNA碱基2369的位置上含有突变T的核苷酸序列的工具在制造在患有或怀疑患有癌的个体中预测对吉非替尼或厄洛替尼治疗效果抗性的试剂盒中的用途。34.—种试剂盒，该试剂盒包括至少一个容器和包含其中的包括至少一种聚合酶链式反应(PCR)引物的组合物，该引物在适宜PCR条件下杂交至突变的表皮生长因子受体(EGFR)基因的多核苷酸序列5'的有义链或反义链，所述的基因编码在EGFR的790位上由曱硫氨酸替换苏氨酸，其中该PCR引物在所述突变的200个核苷酸内结合。35.如权利要求34中所述的试剂盒，其进一步包括以下述方式之一切割EGFR多核苷酸的切割工具a)在所述位置的6个碱基内切割在相应于EGFRcDNA碱基2369位置上具有突变T的多核苷酸，但不如此切割在该位置上具有野生型C的多核苷酸，或者b)在所述位置的6个碱基内切割在相应于EGFRcDNA碱基2369位置上具有野生型C的多核苷酸，但不如此切割在该位置上具有突变T的多核苷酸。36.—种试剂盒，该试剂盒包括至少一个容器和包含其中的包括PCR受体(EGFR)多肽的第一多核苷酸或其多核苷酸片断，其中该引物杂交至在对应于EGFRcDNA碱基2369的位置上包括突变T的有义链序列或2369位上含有野生型C的第二EGFR多核苦酸。全文摘要导向检测EGFR突变体C→T(在对应于EGFRcDNA的2369碱基位置上)的聚合酶链式反应引物和方法。本发明提供了一种PCR引物，其在适宜PCR条件下杂交至突变的EGFR基因的各个链上的多核苷酸序列5’，所述突变的基因编码在EGFR多肽的790位上由甲硫氨酸替换苏氨酸。本发明还提供了一种PCR引物，其杂交至在对应于EGFRcDNA碱基2369的位置上包括突变T的序列而不杂交至包含野生型C的第二EGFR多核苷酸。本发明提供了几种方法和试剂盒用于检测样品中突变表皮生长因子受体(EGFR)基因，其包括借助选择性检测在对应于EGFRcDNA碱基2369的位置上包括突变T的核苷酸序列的工具而探测样品，并且鉴定在所述位置上的碱基为T。这些方法和试剂盒还用于在患有或怀疑患有癌的个体中预测对吉非替尼或厄洛替尼治疗效果的抗性。文档编号C07H21/04GK101193905SQ200680011674公开日2008年6月4日申请日期2006年2月13日优先权日2005年2月11日发明者卡特利纳·波利提,哈奥德·法莫斯,威廉姆·包,文森特·米勒申请人:纪念斯隆-凯特林癌症中心