一种鸡柔嫩艾美尔球虫微线蛋?2突变体EtMIC2?2119的制作方法
【专利摘要】本发明涉及基因工程和遗传工程领域，提供了一种鸡柔嫩艾美尔球虫微线蛋?2突变体EtMIC2?2119，该突变体是以野生型柔嫩艾美耳球虫SD?01的EtMIC2(GenBank:KC333870.1)为基础蛋白质进行体外定向进化，并建立基因突变库，使用酵母表面展示蛋白突变库，应用流式细胞仪分选以及动物免疫保护效果评价等手段，筛选免疫原性以及免疫保护力显著提高的变异蛋白质最终获得的，该突变体变异蛋白质有11个氨基酸突变位点；变异后的EtMIC2较天然EtMIC2免疫保护效果ACI提高约为25.06％，可作为疫苗在抵抗鸡柔嫩艾美尔球虫感染等领域中应用。
【专利说明】
一种鸡柔嫩艾美尔球虫微线蛋-2突变体EtM IC2-2119
技术领域
[0001] 本发明涉及基因工程和遗传工程领域，提供了一种鸡柔嫩艾美尔球虫微线蛋-2突 变体 EtMIC2-2119。
【背景技术】
[0002] 鸡球虫病是一类由专性细胞内寄生的艾美耳球虫引起的肠道原虫疾病。据估计每 年全世界用于预防和治疗球虫病成本会超过30亿美元，中国每年约有30多亿人民币。目前 球虫病的防控主要依靠药物与疫苗，随着耐药虫株的出现和针对抗球虫药物的立法限制， 人们更加重视免疫预防。市场上的疫苗主要为多种鸡艾美耳球虫活卵囊的混合，具有很好 的免疫保护效果，但是由于活疫苗存在安全问题以及较高的生产成本，研究者们将更多的 精力用于以亚单位为基础的新型分子疫苗的研制。
[0003] 新型分子疫苗研制依靠具有较好抗原性以及免疫原性的抗原，由于球虫复杂的抗 原结构以及生活史，抗原鉴定的难度以及抗原免疫原性筛选的限制阻碍了亚单位疫苗研制 的进展。研究者们也开展了大量的研究来改善抗原的免疫保护效果，包括新佐剂的研制，益 生菌诱导的非特异性免疫等，但是这些都不能从根本上改善抗原的免疫原性。因此，如何获 得一种高效的新疫苗成为亟待解决的问题之一。
【发明内容】
[0004] 针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种鸡柔嫩艾美尔球虫微线蛋-2突变 体EtMIC2-2119及其编码基因，该突变体是以野生型柔嫩艾美耳球虫SD-01的EtMIC2 (GenBank: KC333870.1)为基础蛋白质进行体外定向进化，并建立基因突变库，使用酵母表 面展示蛋白突变库，应用流式细胞仪分选以及动物免疫保护效果评价等手段，筛选免疫原 性以及免疫保护力显著提高的变异蛋白质最终获得的，该突变体变异蛋白质有11个氨基酸 突变位点。变异后的EtMIC2-2119较天然EtMIC2免疫保护效果ACI提高约为25.06%，可作为 疫苗在抵抗鸡柔嫩艾美尔球虫感染等领域中应用。
[0005] 发明人在本发明中应用的主要机理如下：
[0006] 定向进化被广泛用于蛋白质工程领域，其中重要的应用之一就是改善抗原的免疫 原性。关键氨基酸的改变对于抗原的免疫反应和免疫识别有很大影响，比如可逆抑制宿主 的免疫反应、影响T细胞的激活、改善蛋白质免疫原性等，使用随机突变构建基因突变库是 定向进化常用的方法之一。
[0007] 而EtMIC家族蛋白质在球虫移行、入侵宿主细胞以及胞内生存方面有重要的作用， EtMIC2蛋白质能够在柔嫩艾美耳球虫的整个生活周期内都表达，研究表明EtMIC2基因或者 蛋白质能够诱导部分免疫保护反应，是很好的疫苗候选抗原。
[0008] 因此本发明的发明人使用随机突变技术针对EtMIC2进行定向进化，建立基因突变 库，使用酵母表面展示技术结合FACS以及动物免疫保护试验筛选目的变异蛋白质，从而改 善EtMIC2蛋白质的免疫原性，为抵抗鸡柔嫩艾美尔球虫感染提供技术支持。
[0009] 本发明的具体技术方案如下：
[0010] 本发明首先根据GenBank公布的EtMIC2核苷酸序列（GenBank: KC333870 · 1)人工合 成天然EtMIC2序列，其核苷酸序列如Seq ID N0:3所示，将该EtMIC2核苷酸序列与pEASY-Tl 载体连接建模EtMIC2-Tl。
[0011] 发明人利用易错PCR扩增上述EtMIC2-Tl并获得突变体，之后建立基因突变库，使 用酵母表面展示蛋白突变库，而后应用流式细胞仪分选以及动物免疫保护效果评价等手 段，筛选免疫原性以及免疫保护力显著提高的变异蛋白质，最终获得了本发明所述的突变 体，命名为EtMIC2_2119，该突变体核苷酸序列如Seq ID No: 1所示，其编码的氨基酸序列如 Seq ID N〇:2所示，通过与未突变EtMIC2比较，该突变体变异蛋白质有11个氨基酸突变位 点，具体突变位置如下：
[0012] EtMIC2-2119与EtMIC2相比差异氨基酸及其位点
[0014] 发明人在获得上述突变体之后，对其进行了免疫保护效果验证，结果发现相比于 未突变的EtMIC2蛋白质，突变体EtMIC2-2119蛋白质免疫组体重增长显著；突变体EtMIC2-2119蛋白质免疫组的盲肠平均病变计分要显著低于未突变EtMIC2免疫组；突变体EtMIC2-2119蛋白质免疫组在克粪便卵囊数方面与天然蛋白EtMIC2相比，卵囊排出量虽有所减少， 但没有表现出明显差异；突变体EtMIC2-2119蛋白质免疫组的ACI为172.48，比未突变 EtMIC2蛋白免疫组高约25.06 %，具有良好的抗球虫效果，可见本发明所提供的突变体 EtMIC2-2119可作为疫苗在抵抗鸡柔嫩艾美尔球虫感染等领域中应用。
[0015] 综上所述，本发明获得了一种全新的鸡柔嫩艾美尔球虫微线蛋-2突变体EtMIC2-2119,该突变体较之为突变体免疫保护效果ACI提高约为25.06%，可作为疫苗在抵抗鸡柔 嫩艾美尔球虫感染等领域中应用。
【附图说明】
[0016] 图1为酵母表面展示蛋白质EtMIC2以及突变EtMIC2蛋白质SDS-PAGE检测结果灰度 图，
[0017] 图中Μ为Marker; 1为EBY100阴性对照；2为EtMIC2蛋白质；3为EtMIC2-2119变异蛋 白质；
[0018] 图2为酵母表面展示蛋白质EtMIC2以及突变EtMIC2蛋白质Western blot检测结果 灰度图，
[0019] 图中Μ为Marker;l为EtMIC2蛋白质；2为EtMIC2-2119变异蛋白质；
[0020]图3为流式细胞仪分选展示有EtMIC2蛋白的酵母细胞示意图。
【具体实施方式】
[0021]试验材料和试剂
[0022] 1、菌株、载体:本发明所涉及的各种菌株均为常规菌株，可从市场上直接够得;所 采用的克隆载体pEASY-ΤΙ购自全式金公司；表达载体pET-30a( + )，采用本领域常规技术获 得或购买。
[0023] 2、主要试剂与药品：rTaq酶、dNTPs、DNA Marker、Protein Marker、PCR产物纯化试 剂盒、DNA胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购于北京全式金生物技术有限公司；限制性内切 酶BamH I、Nhe I、Hindm和Sal I购自大连宝生物工程有限公司；T4DNA连接酶购自 Fermentas ;FITC标记羊抗鼠 IgG、HRP标记羊抗鼠 IgG和IgA购自北京博奥森生物科技有限公 司；Quick Start?Bradford lx Dye Reagent购自Bio-Rad公司；His·.Bind?Purificat ion Kit购自Merck公司；完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂等购自Sigma公司；二硫苏糖醇 (DTT)购自Sigma公司；酵母质粒快速提取试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，其它 常规试剂均为国产分析纯。
[0024] 3、培养基的配制：
[0025] (1)LB液体培养基:使用电子天平称取酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，氯化钠 10g，溶 解于1L去离子水中，121°C高压灭菌20min。
[0026] (2)固体LB培养基：按以上方法配制LB液体培养基100mL，加入1.5g琼脂粉，121°C 高压灭菌20min，冷却后倒入培养皿中。
[0027] (3)固体LB/AMP (Kan)培养基:按以上方法配制LB液体培养基100mL，待温度降至不 烫手时，加入l〇〇yL Amp(Kan)贮存液，混匀后，倒入培养皿中，冷却后4°C保存。
[0028] (4)YPD液体培养基:使用电子天平称取酵母提取物10g，胰蛋白胨20g，葡萄糖20g 溶解于1L去离子水中，121°C灭菌15min。
[0029] (5)固体YPD培养基:按以上方法配制Yro液体培养基100mL，加入1.5g琼脂粉，121 °C高压灭菌20min，冷却后倒入培养皿中。
[0030] (6)SD-CAA液体培养基:使用电子天平称取酵母氮源6.7g，酸水解酪素 5g，葡萄糖 2〇g溶解于1L去离子水中，使用磁力搅拌器充分溶解，121°C高压灭菌15min。
[0031] (7)固体SD-CAA培养基:将100ml SD-CAA液体培养基中加入1.5-2g琼脂粉，高压灭 菌后，倾入培养皿。
[0032] (8)SG-CAA液体培养基:使用电子天平称取无氨基酸无硫酸铵酵母氮源6.7g，酸水 解酪素5g溶解于1L去离子水中，使用磁力搅拌器充分溶解，121°C高压灭菌15min，之后加入 20g的过滤除菌的半乳糖4°C保存。
[0033] 4、本实施例中未做详细具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验 指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书 进行。
[0034] 实施例1突变体EtMIC2-2119的获得
[0035] 根本发明首先根据GenBank公布的EtMIC2核苷酸序列(GenBank:KC333870.1)人工 合成天然EtMIC2序列，所获得的EtMIC2核苷酸序列，其核苷酸序列如Seq ID N〇:3所示，之 后将其与pEASY-Tl载体连接建模EtMIC2-Tl;以EtMIC2-Tl为模板，使用EtMIC2-951-F和 EtMIC2_951_R为引物，利用Divers ify PCR Random Mutagenes is Kit(Clontech,USA)进 行易错PCR扩增EtMIC2突变体获得易错PCR产物;其中所用引物如表1所示：
[0036] 表1.所述突变体EtMIC2-2119特异性引物
[0038]实施例2所述突变体的制备
[0039]将实施例1中获得的易错PCR产物在未纯化的情况下，与pEASY-T 1载体连接后，转 入Top 10感受态细胞，涂布氨苄LB琼脂平板，于37°C温箱中培养直至单克隆菌落增至107为 止，构建EtMIC2基因突变库；
[0040] 上述包含有基因突变文库的重组质粒以及pCTC0N2质粒，使用Nhe I和Sal I进行 双酶切，将双酶切的基因突变库与PCTC0N2载体连接后转染酿酒酵母EBY100 (购自 Invitrogen)，得到重组菌株EBY100/EtMIC2，PCR鉴定阳性菌落(设计所用引物如表2所示）； 取含有重组质粒的菌株EBY100,涂布SD-CAA固体培养基上30°C温箱中，培养48h，直至酵母 菌菌落为1〇 8个为止，构建EtMIC2突变蛋白质库重组菌株EBY100/EtMIC2;
[0041] 表 2
[0043] 取含有重组质粒的EBY100菌株按体积比1:100的比例接种于100mL的SD-CAA中，30 °C，220rpm培养约8h，至0D600约1.0左右停止培养，将菌体在无菌的条件下4°C，3000r/min， 离心5min，弃掉上清，使用无菌蒸馏水洗涤三次以彻底除去葡萄糖，3000r/min，离心5min， 使用新鲜配制的SG-CAA培养基100mL重悬菌体，并转移至灭菌的三角瓶中，30°C，220rpm诱 导培养约12h;
[0044] 将诱导表达的酵母菌浓度调整为5xl07个/10yL，加入终浓度为100mM的DTT溶液，4 °(：作用过夜，期间不断震荡。将获得的蛋白质溶液加入到透析袋中，在4°C条件下使用PBS溶 液透析多次(每次2h)除去DTT，10,000rpm，离心lmin，吸取上清，使用SDS-PAGE及Western blot分析表达情况，结果显示在50kDa左右出现阳性条带(如图1和2所示）；
[0045] 取上述诱导表达的酵母菌细胞，使用pH为7.2的PBS-BSA(lmg/mL)洗2遍，10，000r/ min，离心lmin，将菌体重悬于40yLl:200稀释的兔源抗EtMIC2多抗(利用现有技术制备）中， 混勾，冰浴30min，使用pH为7.2的PBS_BSA( lmg/mL)洗2遍，10，000r/min，离心lmin，将菌体 重悬于50yLl: 75稀释的FITC标记鼠抗兔IgG单抗，混匀，冰浴30min，使用pH为7.2的PBS-BSA (lmg/mL)洗2遍，10,000r/min，离心lmin，BD FACSAria Cel l-Sort ing System进行无菌 筛选含有突变体菌株，以展示未突变EtMIC2蛋白质与兔源抗EtMIC2多抗血清亲和力的不同 为对照，圈定荧光信号较弱的门P2(占总细胞数的2.7 %，其荧光强度为：2757.18，代表与 EtMIC2多抗亲和力较弱）（如图3所示），经过三次连续筛选后，涂布SD-CAA固体琼脂平板，30 °C培养48h，收集酵母单菌落10株。
[0046]常规技术提取含有突变体基因的上述8株酵母菌pCTC0N2重组质粒，以该质粒为模 板，以表2所示的His-EtMIC2-F和His-EtMIC2-R为引物，使用PrimeSTAR DNA Polymerase (Takara)进行PCR扩增EtMIC2突变体基因，将上述PCR产物以及pET30a，使用BamH I和Hind ΙΠ 进行双酶切，连接后转化BL21菌株获得重组菌株BL21/EtMIC2-1130。阳性克隆按1:100的 比例接种于含有卡那霉素抗性的LB培养基中，在37°C，220rpm的恒温摇床中培养3h，至 0D600~0.6时，向各管中加入终浓度为ImM的IPTG溶液诱导表达4h，8，OOOrpm离心5min，收 集菌体，1 X结合缓冲液洗涤菌体2次，使用以每100mL培养基所得菌体加入4mL 1 X结合缓 冲液比例重悬菌体。经超声波破碎(功率300W，开3sec，停6sec)后，16，000g离心20min收集 上清及沉淀，沉淀按每100mL培养物加5mL缓冲液比例，加入终浓度为8M尿素的1 X结合缓冲 液，彻底溶解包涵体，16，000g离心30分钟再次收集上清，两次收集上清混合，调pH为8.0，使 用0.45um滤膜过滤，用于His · Bind蛋白质纯化(根据His · Bind?Purificat ion Kit说明 书进行），获得突变体蛋白，命名为EtMIC2_2119,其核苷酸序列如Seq ID N〇:l所示，其编码 的氨基酸序列如Seq ID N〇:2所示，通过与未突变EtMIC2比较，该突变体蛋白质有11个氨基 酸突变位点。
[0047] 根据Quick Start?Bradford lx Dye Reagent说明书，使用0 · 125、0 · 25、0 · 5、 0.75、1.0、1.5和2. Omg/mL的BSA标准品各5yL加入到含有250yL染料试剂的EP管中，充分混 匀，室温作用5min，每个梯度做三个重复;取待测蛋白质样品各5yL加入到含有250yL染料试 剂的EP管中，充分混匀，室温作用5min，每个梯度做三个重复，将混合液加入到酶标板的孔 中，使用酶标仪测定0D595;绘制标准曲线，根据得出的公式计算突变体蛋白浓度为1.36mg/ mL〇
[0048] 实施例3突变体EtMIC2-2119免疫保护效果判定
[0049] 1日龄雏鸡称重，剔除体重差别较大的鸡只。共将100只雏鸡分为4组，分别为PBS-I (不免疫不感染组），PBS-II(不免疫感染组），天然蛋白EtMIC2,突变体EtMIC2免疫组，每组 25只，在隔离罩中饲养。在7日龄时，各组鸡只分别进行皮下多点免疫弗氏完全佐剂乳化的 终浓度为〇. 5mg/mL的蛋白质或roS 100yL，在14日龄时进行加强免疫弗氏不完全佐剂乳化 的对应终浓度为0.5mg/mL的蛋白质或PBS lOOyLdI日龄雏鸡除roS-I组外均口服接种30， 000个孢子化卵囊。依据免疫鸡只体重增长情况、盲肠病变计分、克粪便卵囊数(0PG)、抗球 虫指数(ACI)等指标判定突变体蛋白免疫保护效果：
[0050] -、体重增长情况测定:具体方法如下：
[0051] 21日龄(攻虫前）以及31日龄(攻虫后）时进行逐羽称重，记录称重结果，并计算平 均增重(平均增重(g) =31日龄平均体重(g)-21日龄平均体重(g))与相对增重量(相对增重 率（％ )=(感染组的增重/不感染不免疫组的增重）X 100% )。结果表明：与PBS-II组相比， 免疫天然蛋白EtMIC2组与突变体EtMIC2-2119组体重增长显著，相比于未突变的EtMIC2蛋 白质组，突变体EtMIC2-2119组体重增长显著。
[0052]二、盲肠病变计分测定:具体方法如下：
[0053] 根据Johnson和Reid(1970)5分制原则，在感染球虫后5d，每组剖杀6只鸡，取盲肠 首先观察外观出血点，肿胀情况，然后纵向剖开盲肠，观察内容物状态，使用自来水清除掉 内容物观察盲肠内壁的出血情况，综合这些病变进行评定记分。结果表明：与PBS-II组相比 EtMIC2，EtMIC2-2119免疫组盲肠平均病变计分显著降低，且突变体EtMIC2-2119组的盲肠 平均病变计分要显著低于未突变EtMIC2免疫组。
[0054]三、克粪便卵囊数(0PG):具体方法如下：
[0055] 攻虫后第5d至第lOd开始每天分别收集各组粪便，混匀后4°C保存。每组各取lg，加 入10mL自来水进行10倍稀释，经充分搅拌均匀后，使用400目滤网研磨并过滤除去大的粪便 颗粒。取充分混匀的滤液l〇yL滴与载玻片上，在低倍镜下记数10yL稀释液中球虫卵囊总数， 根据公式(〇PG =球虫卵囊总数X104)计算0PG和保护率。结果表明：与PBS-II组相比，蛋白 质EtMIC2，EtMIC2-2119免疫组卵囊排出量均显著降低，但变异蛋白质EtMIC2-2119组在克 粪便卵囊数方面与天然蛋白EtMIC2组相比，卵囊数降低差异不显著。
[0056] 四、计算抗球虫指数(ACI):具体方法如下：
[0057] 按美国Merck公司公式:ACI = (存活率+相对增重率）X100 -（病变值+卵囊值）。根 据ACI来判定抗球虫的疗效;ACI兰120为无效，120〈ACI兰160为中等有效，160〈ACI兰180为 良好，ACI>I80为优秀。结果显示：未突变EtMIC2蛋白质免疫组的ACI为137.92，具有中等的 抗球虫保护效果，突变体EtMIC2-2119蛋白质免疫组的ACI为172.48，比未突变EtMIC2蛋白 免疫组高约25.06%，具有良好的抗球虫效果。
【主权项】
1. 一种鸡柔嫩艾美尔球虫微线蛋-2突变体，其特征在于，该突变体命名为EtMIC2-2119,其核苷酸序列如Seq ID No:l所示，其编码的氨基酸序列如Seq ID No:2所示。2. 权利要求1所述鸡柔嫩艾美尔球虫微线蛋-2突变体作为疫苗在抵抗鸡柔嫩艾美尔球 虫感染上的应用。
【文档编号】A61K39/012GK106046136SQ201610390480
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月3日
【发明人】赵孝民, 陈正涛, 韩林臻, 李宏梅, 王方昆
【申请人】山东农业大学