一种具有强热稳定性的甜味蛋白monellin突变体及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及蛋白突变技术领域，特别是涉及一种具有强热稳定性的甜味蛋白 monel Iin突变体及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 甜味蛋白111〇11611；[11是西非植物0；[08(30代0口1171111111(3111]1111；[118；[；[中提取的一种天然 甜味剂，具有强烈的甜味，甜度在相同条件下约为相同质量蔗糖的3000倍，天然的monellin 蛋白是由两条不同的肽链通过共价键结合在一起，由A链和B链组合而成，研究发现天然的 mone 11 in蛋白在高温下易失去活性，1989年Kim等人通过基因工程方法将两条肽链结合成 一条蛋白链，使其热稳定性得到大大提升，在宽范围PH下保持稳定，同时其甜度未发生太大 变化。由于本身不含糖分，可以作为糖尿病人和心血管病人的最好甜味替代食品，也可以有 效的预防儿童離齿的发生，具有非常大的市场潜力。单链monel Iin蛋白在65°C下处理就会 失去活性，使其在生产和运输过程中受到了限制。
[0003] 单链monellin蛋白采用基因工程手段也在其他生物中表达成功，如大肠杆菌表达 系统、植物表达系统、枯草芽孢杆菌表达系统、但是由于这些表达系统产量和有毒代谢物质 的问题使得monel I in蛋白无法大规模发酵生产。采用甲醇诱导毕赤酵母发酵使得monel I in 蛋白产量得到很大提升，但是由于有毒物质甲醇的加入，发酵产品安全问题成为隐患。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的就是针对上述存在的缺陷而提供一种具有强热稳定性的甜味蛋白 monel Iin突变体及其制备方法。针对现有的技术不足，对单链monel Iin进行了定点突变研 究，得到一种热稳定性和甜度均提升的突变体E23A，并在毕赤酵母中成功表达，解决了甜味 蛋白在生产运输中易降解的技术难题，降低了monellin蛋白在生产运输中的成本，同时保 持其甜味效果，为甜味蛋白大规模工业化市场化打下基础。采用PGAPZaA质粒可以将目的蛋 白直接分泌到胞外，节省了后期纯化成本，由于本身为GADPH自诱导型启动子，发酵过程中 不需要添加任何诱导剂，减少了发酵过程中的染菌概率，同时没有任何有毒代谢物质，保证 了该蛋白作为食品添加剂的安全。
[0005] 本发明的一种具有强热稳定性的甜味蛋白monellin突变体及其制备方法技术方 案为，一种具有强热稳定性的甜味蛋白monellin突变体，将野生型单链monellin基因第23 位氨基酸谷氨酸(Glu)定点突变为丙氨酸(Ala)。
[0006] 与野生型单链monellin蛋白相比，甜味未下降，热稳定性提高20°C。
[0007] 所述的一种具有强热稳定性的甜味蛋白mone 11 in突变体的制备方法，包括以下步 骤：
[0008] (1)构建野生型单链mone 11 in蛋白表达载体；
[0009] (2)将步骤(1)中进行定点突变得到突变基因，挑取阳性转化子测序验证；
[0010] (3)将步骤（2)中测序正确的质粒转化入毕赤酵母中，筛选出成功转化的毕赤酵 母；
[0011] (4)在Yro培养基中诱导表达蛋白，时间为3天；
[0012] (5)将步骤⑷中表达的蛋白纯化。
[0013] 步骤(1)为，构建含有野生型单链monellin蛋白基因的表达质粒PGAPZaA。
[0014] 步骤(2)突变位点特异性引物:上游Pl: [5，-CCCTCGAGMMGAGAGGCTGMGCTGGTGM-3 ' ];下游P2: [ 5 ' -CATACTGACCTATTTTGTTAGCCTCGTCAACAG-3 ' ]，上游P3: [ 5 ' -CTGTTGACGAGGCT AACAAAATAGGTCAGTATG-3 ' ];下游P4: [ 5 ' -TTGCGGCCGCTTAGGGAGGAGGCACAGGTCCGTTG-3 ' ] 〇 [0015] 步骤(2)中，设计好引物后，用Xho 1和No11两种限制性内切酶处理PGAPZaA-SCM，胶 回收目的基因和开环质粒，根据以下体系进行PCR反应：
[0018] 上述PCR反应按照如下程序进行：
[0019] 95°c 预变性 5min; 95°C 变性 30s，54°C 退火 30s，72°C 延伸 Imin，30 个循环；72°C 终延 伸lOmin。经琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物后再以Pl、P4为引物，该PCR产物为模板进行重叠 PCR反应，得到突变目的基因。
[0020] 步骤（2)中，用T4DNA连接酶连接PGAPZaA开环质粒和用Xhol和NotI处理后的突变 目的基因 PCR产物，37°C反应过夜，将连接后的体系物转化入大肠杆菌DH5a感受态细胞中， 涂布于含25μg/ml Zeocin的LLB固体培养基上，过夜培养挑取阳性单菌落并提取质粒，测序 验证突变结果，构建突变质粒PGAPZaA-E23A将正确的突变质粒保存备用。
[0021 ] 步骤(3)中所述的毕赤酵母为毕赤酵母GS115。
[0022]本发明的一种具有强热稳定性的甜味蛋白monellin突变体及其制备方法有益效 果为:本发明对单链monellin进行了定点突变研究，得到一种热稳定性和甜度均提升的突 变体E23A，并在毕赤酵母中成功表达，解决了甜味蛋白在生产运输中易降解的技术难题，降 低了monellin蛋白在生产运输中的成本，同时保持其甜味效果，为甜味蛋白大规模工业化 市场化打下基础。采用PGAPZaA质粒可以将目的蛋白直接分泌到胞外，节省了后期纯化成 本，由于本身为GADPH自诱导型启动子，发酵过程中不需要添加任何诱导剂，减少了发酵过 程中的染菌概率，同时没有任何有毒代谢物质，保证了该蛋白作为食品添加剂的安全。
【附图说明】
[0023]图1是80°C不同时间下热处理蛋白电泳图；
[0024]图2所示为85°C不同时间下热处理蛋白电泳图。
[0025] 图中，1:未热处理蛋白2:蛋白marker 3:80°C热处理2h 4:80°C热处理4h;5:80°C 热处理 6h; 6.80°C 热处理 8h; 7:80°C 热处理 IOh; 8:85°C 热处理 30min; 9:85°C 热处理 Ih; 10: 85°C热处理2h; 11:85°C热处理4h; 12:85°C热处理6h; 13:85°C热处理8h。
【具体实施方式】：
[0026]为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案，但是本 发明并不局限于此。
[0027] 实施例1
[0028] 单链monellin突变基因蛋白的制备
[0029] (1)野生型单链monellin蛋白载体的构建
[0030] 由中美泰和生物技术有限公司合成野生型单链monellin全基因并在两端分别引 物Xho I和No11两个限制性内切酶位点，经过酶切目的基因片段和PGAPZaA空质粒，用T4DNA 连接酶37°C连接过夜，转化入DH5a大肠杆菌感受态细胞中涂布于含25μg/ml Zeocin的LLB 固体培养基上，过夜培养挑取阳性转化子，用质粒提取试剂盒提取质粒测序验证，成功构建 野生型monel I in蛋白载体PGAPZaA-SCM。
[0031 ] (2)对野生型单链monellin蛋白定点突变
[0032] 针对突变位点设计一对特异性引物:上游Pl: [5，-CCCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGG TGAA-3 ' ];下游P2: [ 5 ' -CATACTGACCTATTTTGTTAGCCTCGTCAACAG-3 ' ]，上游P3: [ 5 ' -CTGTTGAC GAGGCTAACAAAATAGGTCAGTATG-3 ' ];下游P4: [5 ' -TTGCGGCCGCTTAGGGAGGAGGCACAGGTCCGTTG-3']，根据以下体系进行PCR反应：
[0034] 上述PCR反应按照如下程序进行：
[0035] 95°C 预变性 5min; 95°C 变性 30s，54°C 退火 30s，72°C 延伸 Imin，30 个循环;72°C 终延 伸lOmiruPCR结束后用1%琼脂糖凝胶电泳检测。再以P1、P4为引物，该PCR产物为模板进行 重叠 PCR反应，程