Ell(c595a)突变体在促进肿瘤转移中的应用
【技术领域】
[00011本发明涉及生物技术领域，尤其涉及ELL(C595A)在促进肿瘤细胞迀移中的应用。
【背景技术】
[0002] ELL的基因产物首先被定义为MLL基因在急性髓性白血病（AML)(Thirman等人 1994)的易位部分。进一步的生化研究鉴定出ELL作为转录延伸因子，可以在体外实验中增 加 RNA聚合酶II的转录延伸活性，后来的体内研究揭示出其相关联地转录活性基因座 化1886油6坪等人2002,511；[131:丨€31(1等人1996)<^1^是两个不同的延伸复合体的一部分，即 超级延伸复合体（SEC)和小延伸复合体（LEC) (Hu等人2013, Luo等人2012, Smith和 Shilatifard 2013)。作为正转录延伸因子(P-TEFb)中最活跃的形式之一，超级延伸复合体 (SEC)执行几项重要功能，例如HSP70诱导热休克，发育基因响应环境胁迫(Lin等人2010， Lin等人2011)，MLL-AFFl-transformed细胞中的Η0Χ基因失调(Lin等人2010)，以及HIV的转 录激活(He等人2010，Sobhian等人2010)。小延伸复合体(LEC)在snRNA基因转录的启始和延 伸阶段调节小核RNA(small nuclear RNA)的转录及功能(Hu等人2013，Smith等人2011) 0
[0003] ELL在哺乳动物的胚胎发育中是必需的，因为ELL靶向敲除的小鼠出现胚胎致死 (Mitani等人2000)。此外，ELL作为类固醇受体，低氧诱导因子l-a(HIF-la)，E2Fl和TFIIH复 合体的伴侣，以一种或正或负的方式来调节它们结合伴侣的活性(Pascual-Le Tallec等人 2005) (Liu等人2010a) (Mourgues等人2013，Zhang等人2014)。综上，ELL有着非常多样化的 功能;然而，其在生理条件下确切的作用机制仍然未知。
[0004] 原癌基因 c-Myc，最初通过在宿主细胞基因组中识别可比v_Myc(comparable V-Myc oncogene)被首次确认(Vennstrom等人1982)。随后的研究表明，人类c-Myc在多发性骨 髓瘤中频繁易位(Shou等人2000)，并在许多不同的人类癌症中高表达或突变(Beroukhim等 人2010)，从而证实它是一个人类癌基因 （Dang 2012) κ-Myc基因编码一种在调苄基因表达 方面有重要作用的多功能转录因子，其功能牵涉到诸多生物过程，这些过程有助于肿瘤发 生，肿瘤发展，以及肿瘤转移(Dang 2012)。
[0005] c-Myc是一个可以调节多个生理过程的不稳定蛋白。泛素-蛋白酶体途径(UPS)是 c-Myc在细胞中降解的最突出的机制之一(Farrell and Sears 2014)。鉴于浩如烟海的底 物需要相应的特异性靶向E3泛素连接酶，因此人类E3连接酶的估计数目大于600(Bernd Sen 和Wolberger 2014) J3连接酶可分为三大家族:最新发现的（RING)-FINGER家族，HECT家族 和RING-between-RING(RBR)家族（Berndsen和Wolberger2014) jlNG-FINGER E3连接酶可 以直接催化泛素从E2转移到底物。与此相反，HECT和RBR E3连接酶催化的是两步反应，其中 泛素首先从E2转移到E3的一个活性的半胱氨酸位点，然后再从从E3到底物。作为RING-FINGER结构泛素连接复合体的组分之一(Farrell和Sears 2014)，FBW7(通过介导c-Myc降 解来抑制其活性)是研究得最充分的E3泛素连接酶;它识别第c-Myc第58位苏氨酸(T58)的 磷酸化，该磷酸化通过通过糖原合酶激酶3(GSK3)介导(Welcker等人2004，Yada等人2004)。 另一个RING-FINGER E3连接酶Skp2,能够识别在c-Myc氨基末端的一段保守序列元件 (MBII)和HLH-LZ基序(第367-439氨基酸），促进它的多泛素化和降解，并导致c-Myc转录活 性的增强（Kim等人2003，von der Lehr等人2003)。第三个RING-FINGER E3连接酶β-TRCP， 结合在c-Myc的氨基末端，并使用UbcH5泛素结合酶(E2)以形成c-Myc上的异型泛素链;从而 增强c-Myc的稳定性(Popov等人2010)。唯一被报道过的c-Myc的HECT E3连接酶HectH9,泛 素化c-Myc形成一个63位赖氨酸的多聚泛素链(Adhikary等人2005)，其并不引起的c-Myc降 解，但却是c-Myc反式激活多个革E1基因所必需的(Adhikary等人2005)。因此，c-Myc的稳定性 和泛素化之间存在着复杂的关联性，正如同c-Myc的转录活性和稳定性之间的关系一样。
[0006] 作为经典原癌基因之一，c-Myc在约70%的人类肿瘤中存在过量表达;然而，这些 肿瘤中只有20%表现出的c-Myc基因扩增或易位，这足以解释c-Myc在蛋白水平的高表达 (Farrell和Sears 2014)。因此，在人类肿瘤中观察到的c-Myc蛋白的过表达可能与相应的 E3泛素连接酶的下调有关。事实上，肿瘤中已经报道了 c-Myc的一些E3连接酶的异常表达 和/或突变。值得注意的是，在人类癌症中FBW7的点突变可以导致其失活，并且可能不表达 (Farrell和ears 2014)。最近有研究表明，FBW7通过调节c-Myc的稳定性来影响白血病起始 细胞活性，FBW7对c-Myc的泛素化的调节会控制慢性髓细胞性白血病发生和发展(King等热 2013，Reavie等人2013)。与此相反，c-Myc的转录活性的正调控基因 Skp2和HectH9显示出致 癌性，他们的过表达在许多人类肿瘤中所验证(Farre 11和Sears 2014)。
【发明内容】
[0007] 本发明一个目的是提供ELL(C595A)蛋白的新用途。
[0008] 本发明提供了 ELL(C595A)蛋白在如下1)-6)至少一种中的应用。
[0009] 1)制备促进肿瘤转移产品；
[0010] 2)制备促进肿瘤细胞迀移产品；
[0011] 3)制备提尚肿瘤细胞侵袭能力广品；
[0012] 4)制备提尚与肿瘤转移相关的基因表达广品；
[0013] 5)制备用于筛选治疗肿瘤转移药物的模型；
[0014] 6)制备促进肿瘤转移的模型；
[0015]所述ELL(C595A)蛋白的氨基酸序列为将ELL蛋白的氨基酸序列第595位半胱氨酸 突变为丙氨酸得到的序列。
[0016] 所述ELL蛋白氨基酸序列为序列表中序列2。
[0017] 上述应用中，所述与肿瘤转移相关的基因为S100A、MARCKSL1、BCAM、BAG4、IP0^P/ 或CPSF7。
[0018] 上述应用中，所述肿瘤为结肠癌;所述肿瘤细胞为结肠癌细胞;所述结肠癌细胞具 体为HCT116细胞；
[0019]所述产品为试剂盒或药物。
[0020] 所述模型为动物模型，所述动物具体为小鼠。
[0021] 本发明另一个目的是提供如下1)-6)中任一种产品。
[0022]本发明提供了 1)_6)中任一种产品，其包括ELL(C595A)蛋白；
[0023] 1)制备促进肿瘤转移产品；
[0024] 2)制备促进肿瘤细胞迀移产品；
[0025] 3)制备提尚肿瘤细胞侵袭能力广品；
[0026] 4)制备提尚与肿瘤转移相关的基因表达广品；
[0027] 5)制备用于筛选治疗肿瘤转移药物的模型；
[0028] 6)制备促进肿瘤转移的模型；
[0029]所述ELL(C595A)蛋白的氨基酸序列为将ELL蛋白的氨基酸序列第595位半胱氨酸 突变为丙氨酸得到的序列。
[0030] 所述ELL蛋白氨基酸序列为序列表中序列2。
[0031] 上述产品中，所述与肿瘤转移相关的基因为S100A、MARCKSL1、BCAM、BAG4、IP0^P/ 或CPSF7。
[0032] 上述产品中，所述肿瘤为结肠癌;所述肿瘤细胞为结肠癌细胞;所述结肠癌细胞具 体为HCT116细胞。
[0033] 上述产品中，所述产品为试剂盒；
[0034] 所述模型为动物模型，所述动物具体为小鼠。
[0035]本发明第三个目的是提供一种蛋白质。
[0036] 本发明提供的蛋白质，其为如下1)或2):
[0037] 1)所示的蛋白的氨基酸序列为将序列表中序列2第595位半胱氨酸突变为丙氨酸 得到的序列；
[0038] 2)将1)所示的蛋白的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失 和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白质。
[0039]本发明的实验证明，本发明发现ELL突变体ELL(C595A)，失去E3泛素连接酶功能， 不能有效降解c-Myc蛋白，该突变体也不能抑制肿瘤细胞增殖和肿瘤形成。但是它可以诱导 肿瘤转移相关基因，包括S100A4、MARCKSK1和BAG4等的上调表达，提高肿瘤细胞侵袭能力， 促进肿瘤细胞在小鼠体内的迀徙和转移。将该突变体转染低恶性肿瘤细胞后，再将该转染 后细胞，皮下注射裸鼠后，可制备肿瘤转移的小鼠模型。该模型可应用于筛选治疗肿瘤转移 药物，以及用于研究原位肿瘤发展为转移肿瘤机制的工具。
【附图说明】
[0040] 图1为ELL(C595A)突变体促进肿瘤转移。
[00411图2为ELL(C595A)突变体促进肿瘤转移重复实验。
[0042]图3为ELL(C595A)过表达增强HCT116肿瘤细胞的迀移能力。
[0043] 图4为ELL(C595A)过表达提高肿瘤转移相关基因（S100A4，MARCKSL1，BAG4)的表 达。
【具体实施方式】
[0044] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0045] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0046] 下述实施例中细胞及培养：
[0047] HEK293，HEK293T，HCT116 和 C0S7 细胞来自 ATCC。
[0048] HEK293，HEK293T和C0S7细胞使用添加 10%胎牛血清（？85;取(：1〇116公司）的 Dulbecco's modified Eagle's medium培养基（DMEM;HyClone公司）培养;HCT116细胞使用 添加10%胎牛血清(FBS;Hyclone公司)McCoy的5A培养基(HyClone公司）培养。培养条件为 37°C j^CC^VigoFeci^Vigorous Biotech)用于细胞转染。
[0049] 下述实施例中抗体和试剂：
[0050] 使用的抗体如下：anti-ELL antibody(A0668，ABclonal ;51044-1_AP， Proteintech;HPA046076，Sigma-Aldrich)，anti-c-Myc antibody(9E10，Santa Cruz； A0309，ABclonal;D84C12，Cell Signal ing)，anti_Flag antibody(F1804，Sigma);anti_ HA antibody(Covance)，anti_His antibody(HI5,Santa Cruz)，anti_GAPDH antibody (SC_47724，Santa Cruz)，anti-a-tubulin antibody(EPR1333，Epitomics);使用的试剂如 下：chloroquine diphosphate(BioVison)，AICAR(Cayman)，MG132(Calbiochem)， cycloheximide(Sigma-Aldrich)〇
[0051 ] 下述实施例中免疫共沉淀和Western blot分析：
[0052] Anti-c-Myc antibody，anti_HA antibody和anti-Flag antibody-conjugated agarose beads贝勾自 Sigma-Aldrich〇Protein A/G Sepharose beads贝勾自GE Company。 Glutathione S_transferase(GST)-Bind Resir^[l|Novogen0