[0053]内源性免疫共沉淀的实验步骤已在(Zhang等人2014)中描述。在GST pull-down分 析中，通过E.coli(BL21)表达GST标签的c-Myc和His标签的ELL并进行纯化。使用GST-Bind Resin进行免疫共沉淀后，通过SDS-PAGE将蛋白质分离。将胶用考马斯蓝染色或转移到PVDF 膜，通过Western blot分析检测His-ELL。使用Fuji Film LAS4000mini luminescent image analyzer进行Western blot结果的拍摄，使用Multi Gauge V3.0根据Western blot 获得的条带密度定量分析蛋白水平。
[0054]下述实施例中体内泛素化实验如下：
[0055] 在HEK293T细胞中共转染质粒HA-c-Myc、质粒Myc-ELL、质粒Myc-ELL(C595A)，质粒 财8_11131111；[1:;[11或质粒财8-11131111；[1:;[11(1(4810 0通过祖2+-1^八 resin(Novagen)X\|'His-111^911；[1:;[11或把8-1113丨911；[1:;[11(1(4810进行纯化，最后使用撤抗体检测0-]%〇的泛素化。
[0056] 下述实施例中体外细胞生长实验：
[0057]通过慢病毒感染获得细胞接种于6孔板中，每孔细胞量为1 X 105,使用细胞计数仪 (TC10; B i O-Rad)连续计数4天。
[0058]下述实施例中细胞克隆形成实验：
[0059] 将过表达ELL的HCT116稳定细胞系接种于六孔板中，每孔2X104个细胞;敲降ELL 的HCT116稳定细胞系每孔接种1.5 X 104个细胞。接种六天后，使用甲醇固定细胞并用结晶 紫染色。使用显微镜拍摄并对克隆数进行计数。
[0060] 统计分析：
[0061] 体外生长实验和克隆形成实验的数据来自三次独立重复实验的平均值，表示为平 均值+SEM;体内实验数据表不为平均值+SEM。使用GraphPad Prism 5(GraphPad Software Inc.)进行数据分析。
[0062] 蛋白ELL的氨基酸序列为序列2,其编码基因的核苷酸序列为序列1。
[0063]实施例1、ELL(C595A)促进肿瘤细胞转移
[0064] 1、肿瘤转移表型
[0065] ELL(C595A)的氨基酸序列为将ELL氨基酸序列2第595位的半胱氨酸突变为丙氨酸 得到的蛋白，其编码基因的核苷酸序列为将ELL编码基因序列1第1783,1784,1785位TGC突 变为GCC。
[0066] 为了证明ELL，ELL(C595A)在肿瘤形成中的作用，使用慢病毒包装的三个HCT116细 胞系:对照，ELL和ELL(C595A)进行裸鼠肿瘤形成实验。
[0067] pHAGE-control 为 pHAGE-CMV-MCS-IZsGreen 载体；
[0068] pHAGE-ELL 为将 ELL 编码基因序列 1 插入 pHAGE-CMV-MCS-IZsGreen 载体（Addgene) 的Xbal和BamHI位点得到的载体；
[0069] pHAGE-ELL(C595A)为将 ELL(C595A)编码基因插入 pHAGE-CMV-MCS-IZsGreen 载体 的Xbal和BamHI位点得到的载体；
[0070] 将上述各载体分别和包装载体psPAX2(Addgene)，pMD2.G(Addgene)转染HEK293T 细胞，转染后8小时，将培养基更换为含有10%FBS的新鲜DMEM培养基。40小时后，从培养基 中收集病毒，得到表达对照慢病毒（转染pHAGE-control)、表达ELL的慢病毒(转染pHAGE-ELL)、表达ELL(C595A)的慢病毒(转染pHAGE-ELL(C595A))。过滤，并转染HCT116细胞，得到 转染 pHAGE-control 的 HT116 细胞、转染 pHAGE-ELL 的 HT116 细胞和转染 pHAGE-ELL(C595A)的 HT116细胞。
[0071]上述含有病毒的培养基中加入P〇lybrene(8yg/mL)以提高感染效率。
[0072] 将上述转染pHAGE-control的HT116细胞、转染pHAGE-ELL的HT116细胞和转染 pHAGE-ELL(C595A)的HT116细胞进行移植瘤生长实验:将15只雄性裸鼠随机分成3组，每组5 只，三组裸鼠分别皮下注射上述三种不同的细胞系，每只裸鼠注射的细胞量为2X106个。从 第三周起，每周测量肿瘤的长宽高并使用V = Ji.abC/6(FlatZ等人2010)计算肿瘤体积。6周 后，处死裸鼠，测量肿瘤的重量并对相应的基因表达进行分析。肺部组织经过HE染色后进行 组织学分析。
[0073] 在移植瘤生长实验中一只第四周死亡的ELL(C595A)表达的小鼠（导入转染pHAGE- ELL(C595A)的HT116细胞）中观察到了消廋现象。此外，在第六周收获肿瘤时，两只ELL (C595A)表达的小鼠中也呈现异常消廋现象（图1A，红色箭头），但没有在对照组发现有类似 的症状。由于消廋现象是晚期癌症患者(Fearon等人2012)的常见的症状之一，因此，又进一 步详细分析了这两只小鼠肿瘤的细节。通过组织学分析（图1C和1D)证明了这两只皮下注射 了转染pHAGE-ELL(C595A)的HT116细胞的小鼠，在肺部形成了肉眼可见的肿瘤（图1C)。
[0074]肿瘤转移率(先肉眼观察，鉴别是否有肉眼可见的肿瘤;再进行组织切片，显微镜 下观察，是否有肿瘤组织。肿瘤转移率为：（发生肿瘤转移小鼠个体数)/(接种肿瘤细胞小鼠 个体总数)X 100%)为50% (图1B)。
[0075] 对这一表型进行了进一步的实验验证。在重复试验中，两只皮下注射了 ELL (C595A)过表达HCT116细胞的两只小鼠变得非常消廋（图2A，红色箭头）。其中一只裸鼠（图 2A，黄色箭头）的整个胸腔都长满了肿瘤，并出现骨转移前奏(图2C，2D)。其他三只裸鼠的肺 部，可见肿瘤细胞的转移图2C。
[0076]肿瘤转移率(先肉眼观察，鉴别是否有肉眼可见的肿瘤;再进行组织切片，显微镜 下观察，是否有肿瘤组织;肿瘤转移率为：（发生肿瘤转移小鼠个体数)/(接种肿瘤细胞小鼠 个体总数)X 100%)为80% (图2F)。
[0077]图2B为肿瘤体积。
[0078] 这些数据表明，ELL(C595A)突变体不仅失去了野生型ELL的肿瘤抑制功能，并且具 有促进肿瘤转移的功能。
[0079] 2、细胞侵袭
[0080]为了进一步了解ELL(C595A)突变促进肿瘤转移的机制，进行了细胞侵袭实验：
[0081 ] 将Transwell平板购自Corning (Costar 3422)。细胞侵袭的实验方案来自制造商。 简言之，将转染pHAGE-control的HT116细胞和转染pHAGE-ELL(C595A)的HT116细胞悬浮于 无血清的McCoy ' s 5A培养基中，每孔细胞量为5 X 105;Transwell平板下室中加入含10% FBS的McCoy's 5A培养基。将平板置于含5%⑶2的培养箱中培养36小时，然后将上室取出， 甲醇固定后使用吉萨姆染色。使用显微镜拍摄并利用ImageJ软件计数。
[0082] 结果如图3中所示，A为显微镜图，B为统计图，与转染pHAGE-control的HT116细胞 相比转染pHAGE-ELL(C595A)的HT116细胞侵袭能力增强。
[0083]因此，ELL(C595A)突变使细胞的侵袭能力增强但不提高细胞增殖的速率，促进肿 瘤细胞迀移。
[0084] 3、ELL(C595A)突变体肿瘤的比较蛋白组学分析
[0085]为了进一步了解ELL(C595A)突变促进肿瘤转移的机制，进行了比较蛋白组学分 析：
[0086] 选取10只4-5周的裸鼠，随机分成两组（每5只/组）。一组皮下注射转染pHAGE-control的HT116细胞2 · 2百万；另一组皮下注射转染pHAGE-ELL(C595A)的HT116细胞2 · 2百 万。三周后，杀死裸鼠，剥离肿瘤，得到对照肿瘤（PHAGE)和ELL(C595A)肿瘤（pHAGE-ELL (C595A))〇
[0087] 分别选取三个对照肿瘤和三个ELL(C595A)肿瘤，提取蛋白，SDS-PAGE检测，结果如 图4A，送到杭州景杰生物科技有限公司，进行定量蛋白组学分析。经实验组(ELL(C595A)月中 瘤)与对照组(PHAGE肿瘤）的比对，筛选到11个蛋白，在ELL(C595A)肿瘤中高表达(图4B)。 [0088]半定量PCR对其中6个基因进行了验证（引物如下表1)，
[0089] 表1为6个基因引物
[0090]
LUUVZj S禾如团41尸/7不，KI以有m ALiALOyOA；従同0,「整囚tfj衣込，以b丄工调衣 达最为显著。
[0093] Western Blot对S100A4的上调表达进行了验证，结果如图4D所示。
[0094] S100A，MARCKSL1和BAG4是已报道的与肿瘤转移相关的基因，特别是S100A4与肿瘤 转移的关系，已有大量的报道。
[0095]因此，ELL(C595A)突变体可能通过上调这些肿瘤转移促进基因的表达，来促进肿 瘤转移。
【主权项】
1. ELL(C595A)蛋白在如下1)-6)至少一种中的应用； 1) 制备促进肿瘤转移产品； 2) 制备促进肿瘤细胞迀移产品； 3) 制备提尚肿瘤细胞侵袭能力广品； 4) 制备提尚与肿瘤转移相关的基因表达广品； 5) 制备用于筛选治疗肿瘤转移药物的模型； 6) 制备促进肿瘤转移的模型； 所述ELL(C595A)蛋白的氨基酸序列为将ELL蛋白的氨基酸序列第595位半胱氨酸突变 为丙氨酸得到的序列。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于： 所述ELL蛋白的氣基酸序列为序列2; 所述与肿瘤转移相关的基因为310(^、獻1?0(51^1、8041、8464、1?09和/或0?5?7。3. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于： 所述肿瘤为结肠癌;所述肿瘤细胞为结肠癌细胞； 所述产品为试剂盒或药物； 所述模型为动物模型，所述动物具体为小鼠。4. 如下1)-6)中任一种产品，其包括ELL(C595A)蛋白； 1) 制备促进肿瘤转移产品； 2) 制备促进肿瘤细胞迀移产品； 3) 制备提尚肿瘤细胞侵袭能力广品； 4) 制备提尚与肿瘤转移相关的基因表达广品； 5) 制备用于筛选治疗肿瘤转移药物的模型； 6) 制备促进肿瘤转移的模型； 所述ELL(C595A)蛋白的氨基酸序列为将ELL蛋白的氨基酸序列第595位半胱氨酸突变 为丙氨酸得到的序列。5. 根据权利要求4所述的产品，其特征在于： 所述ELL蛋白的氣基酸序列为序列2; 所述与肿瘤转移相关的基因为310(^、獻1?0(51^1、8041、8464、1?09和/或0?5?7。6. 根据权利要求4或5所述的产品，其特征在于:所述肿瘤为结肠癌;所述肿瘤细胞为结 肠癌细胞。7. 根据权利要求4-6中任一所述的产品，其特征在于:所述产品为试剂盒； 所述模型为动物模型，所述动物具体为小鼠。8. 一种蛋白质，其为如下1)或2): 1) 所示的蛋白的氨基酸序列为将序列表中序列2第595位半胱氨酸突变为丙氨酸得到 的序列； 2) 将1)所示的蛋白的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或 添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白质。
【专利摘要】本发明公开了ELL(C595A)在促进肿瘤细胞迁移中的应用，本发明提供了ELL(C595A)蛋白在如下1)-6)至少一种中的应用：1)制备促进肿瘤转移产品；2)制备促进肿瘤细胞迁移产品；3)制备提高肿瘤细胞侵袭能力产品；4)制备提高与肿瘤转移相关的基因表达产品；5)制备用于筛选治疗肿瘤转移的动物模型；6)制备用于研究肿瘤转移机制的动物模型；本发明发现ELL突变体ELL(C595A)蛋白，促进肿瘤转移，提高肿瘤细胞侵袭能力；可制备用于筛选治疗肿瘤转移药物的动物模型；可制备用于研究肿瘤转移机制的动物模型。
【IPC分类】C07K14/47
【公开号】CN105566487
【申请号】CN201610003562
【发明人】肖武汉, 陈瑜
【申请人】中国科学院水生生物研究所
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2016年1月5日