一种便捷、快速的科博肽分离提取工艺的制作方法
【专利说明】
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技术领域： 本发明属于生物医药提取技术领域，特别是涉及一种便捷、快速的科博肽分离提取工 艺。
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【背景技术】： 蛇毒是毒蛇从毒腺中分泌出来的一种液体，主要成份是毒性蛋白质，约占干重的90% 至95%。酶类和毒素约含二十多种。此外，还含有一些小分子肽、氨基酸、碳水化合物、脂类、 核苷、生物胺类及金属离子等。蛇毒成分十分复杂，不同蛇毒的毒性、药理及毒理作用各具 特点。就眼镜蛇蛇毒而言，含有细胞毒素（Cytotoxin，CTX)、神经毒素（neurotoxin，NT)，神 经生长因子（Nerve growth factor, NGF)和多种酶类等。神经毒素（neurotoxin，NT)在蛇 毒中含量较高，一般在5%~10%之间，毒性极强，是该类毒蛇咬伤致死的主要成分之一。
[0003] 蛇毒神经毒素种类多、活性强、性质稳定、结构相对简单，因此一直备受人们的关 注。近年来随着生化技术的发展及分子生物学方法的应用，已经从不同的蛇毒中分离纯化 出许多的神经毒素。其中仅突触后神经毒素就有1〇〇多种。蛇毒神经毒素根据作用机制可 分为四类：突角虫前神经毒素 （presynaptically -acting neurotoxin 或 β a-neurotoxin )、突触后神经毒（postsy-naptically -acting neurotoxin 或 a-neurotoxin)、抗胆喊酯 酶类神经毒素 （anticholinesterase neurotoxin)和离子通道型神经毒素 （ion -channel neurotoxin)。目前发现的镇痛成分几乎都是突触后神经毒素。
[0004] 科学研究表明，突触后神经毒素是一条由60~80个氨基酸残基组成的多肽链，氨 基酸残基的组成及相对位置具有很大的同源性，分子量约为6000~8000道尔顿。突触后 神经毒索有长链和短链之分，短链含60~62个氨基酸，四个二硫键.长链含66~74个氨基 酸，五个二硫键。分子中的二硫键聚集在一起形成一个致密的内核，由此核心伸展出三个肽 链环就象三个手指，故其又被形象地称为三指蛋白（three-ringer protein)。突触后神 经毒素几乎全部是碱性蛋白，等电点在9~10之间。由于分子量很小但二硫键很多，这类 毒素的理化性质十分稳定，对热及化学试剂都有抗性。
[0005] 目前，获取眼镜蛇蛇毒中的神经毒素主要是通过捕蛇或养蛇取毒，对粗毒进一 步纯化提取而得到，主要利用离子交换层析和凝胶层析。现有技术中，中国专利申请 CN101845089A (公开日期2010年9月29日）公开了"一种适合规模化生产眼镜蛇蛇毒神 经毒素并降低神经毒性的方法"，该方法将蛇毒层析洗脱后再过分子量为3K的超滤膜最后 采用过氧化氢修饰神经毒素，步骤较繁琐，容易引入杂质，在实际生产中，蛇毒神经毒素在 层析洗脱后仍存在一部分分子量大于神经毒素的至敏物质，且采用过氧化氢修饰神经毒素 后对眼镜蛇神经毒素的长期稳定性并未作考察，规模化生产出的成品距离产品实际运用中 仍然需要一定的考察时间。李范珠等在文献"浙江眼镜蛇蛇毒中神经毒素的分离纯化及其 镇痛作用研究"（中国药师，2004年09期，P659~661)中公开的浙江眼镜蛇蛇毒中神经毒 素的分离纯化方法为将蛇毒直接进行三次柱层析，耗时长，提取成本高，神经毒素的收率较 低。专利申请CN101381408A (公开日期2009年3月11日）公开了"科博肽的提取方法、由 该方法提取得到的科博肽以及包含该科博肽的制剂"，该方法先将硫酸铵预处理眼镜蛇蛇 毒原液，以除去蛇毒中的部分其它成分；通过超滤、透析或凝胶层析除盐浓缩，浓缩后用阳 离子柱进行进行梯度洗脱纯化，该方法操作繁琐，并且引入了盐，易对目标产物的质量造成 影响，脱盐会导致有效成分损失，生产过程质量较难控制。
[0006] 以上几种工艺获得NT的成本高，生产周期长，质量难以控制，收率较低，获得纯品 技术难度较大，并且由于天然蛇毒含有理化性质与神经毒素较为接近的其他大分子毒素如 磷脂酶A2等，会干扰神经毒素的生物活性，应用于临床会出现多种不良反应，在使用过程 中容易产生安全隐患。
[0007] 因此，对眼镜蛇蛇毒神经毒素的提取方法作进一步的深入研究，摸索出一种便捷、 快速的科博肽分离提纯工艺，从而缩短生产周期，降低成本，又能得到含量高、纯度高、性质 稳定且药效良好的科博肽产品，这将在经济效益和临床运用方面具有重要意义。
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【发明内容】
： 本发明所要解决的技术问题是克服现有眼镜蛇蛇毒神经毒素的提取方法中存在的生 产周期长，操作较为繁琐，质量难以控制等缺点，提供一种更为便捷、快速、安全的科博肽分 离提取工艺。
[0009] 为了解决上述问题，本发明采用的技术方案是：眼镜蛇毒其他组分的相对质荷比 和神经毒素及细胞毒素相对质荷比差异比较大，利用Sephadex G-50,可以清晰地将眼镜蛇 毒的各种组分按不同相对质荷比的分子由大至小 分开分开，清晰分出A、B、C、D、E等 峰，其中E峰是相对质荷比是7000左右的组分，即E峰包括两个组分：神经毒素和细胞毒 素，收集E峰，去除E峰以外的组分。而细胞毒素离子强度大于神经毒素的离子强度，细胞 毒素与CM-32的结合能力强于神经毒素与CM-32结合能力。因此我们用CM-32柱分离神经 毒素和细胞毒素。用较低离子强度的洗脱液把神经毒素从CM-32柱洗脱下来，得到神经毒 素，达到分离神经毒素和细胞毒素的目的。
[0010] 具体的，本发明采用如下的技术方案： (1)、S印hadex G-50用注射用水膨胀，装柱后用pH7. 9-8. 1的0· 01M磷酸缓冲液平衡。
[0011] (2)、CM-32用注射用水溶胀后用0. 5Μ氢氧化钠反应30 min后，冲洗至中性；再 用0. 5M盐酸反应30min后，冲洗至中性，装柱，用pH7. 9-8. 1的0. 01M磷酸缓冲液平衡。
[0012] (3)、眼镜蛇粗毒加3-5倍量？!17.9-8.1的0.0说磷酸缓冲液溶解，3000印111离心 lOmin，待用。
[0013] (4)、经离心后的蛇毒溶液上平衡后的S印hadex G-50柱，pH7. 9-8. 1的0· 01M磷 酸缓冲液洗脱，流速30-50ml/h，自动部分收集器收集滤液。
[0014] (5)、24小时后，紫外分光光度计检测收集，收集E峰。
[0015] (6)、收集的E峰上平衡后的CM-32柱，0. 01M磷酸缓冲液洗脱16h后，换含0. 10M 氯化钠的磷酸缓冲液洗脱，流速50-70ml/h，24小时后开始检测收集液，收集目的峰。收集 的目的峰，冷冻干燥，即得科博肽。
[0016] 优选地，本发明提供的具体技术方案为： (1 )、S印hadex G-50用注射用水膨胀，装柱后用pH8. 0的0. 01M磷酸缓冲液平衡。
[0017] (2)、CM-32用注射用水溶胀后用0. 5M氢氧化钠反应30 min后，冲洗至中性；再 用0. 5M盐酸反应30min后，冲洗至中性，装柱，用pH8. 0的0. 01M磷酸缓冲液平衡。
[0018] (3)、眼镜蛇粗毒加4倍量pH8. 0的0. 01M磷酸缓冲液溶解，3000rpm离心10min， 待用。
[0019] (4)、经离心后的蛇毒溶液上平衡后的S印hadex G-50柱，ρΗ8· 0的(λ 01M磷酸缓 冲液洗脱，流速40ml/h，自动部分收集器收集滤液。
[0020] (5)、24小时后，紫外分光光度计检测收集，收集E峰。
[0021] (6)、收集的E峰上平衡后的CM-32柱，0. 01M磷酸缓冲液洗脱16h后，换含0. 10M 氯化钠的磷酸缓冲液洗脱，流速60ml/h，24小时后开始检测收集液，收集目的峰。收集的目 的峰，冷冻干燥，即得科博肽。
[0022] 根据本发明提供的技术方案，其有益效果是：1、先用S印hadex G-50筛分眼镜蛇 毒各组分后，收集E峰，得到的神经毒素的纯度有了极大提高，从原来93%左右提高近100%。 2、由于CM-32柱只用来分离神经毒素和细胞毒素，没有其它阳离子介入，因此可增加上样 量，提高产能；3、本发明提取工艺简单、操作方便，增大洗脱流速，缩短了近60%的洗脱时 间、进而缩短了生产周期，降低了生产成本，更适应工业化生产需要。4、本发明工艺均采用 直接分离目标组分，紫外分光光度计检测收集目标峰，制得的科博肽纯度高、收率理想、质 量稳定等，使得临床用药效果更为显著，且用药安全得到了更好的保障。
[0023] 本发明还提供了以由上述提取工艺提取出的眼镜蛇毒神经毒素加入辅料，按常规 制剂工艺制成药物学意义上的各种制剂，包括注射制剂、口服液制剂，如：小容量注射剂、冻 干粉针剂、普通片、口腔崩解片及分散片剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、微囊剂、舌下片剂等。优选 小容量注射剂和冻干粉针剂。
[0024] 本发明所称的常规制剂工艺以及辅料等是指在教科书、国家标准、地方标准上已 经公开的方法、技术及辅料。
[0025] 其中小容量注射剂和冻干粉针剂的制备方法如下： 取70mg科博肽原料，加入配制药液总量10%氯化钠注射液，使其溶解，0. 45 μ m过滤器 滤过，检测含量，再加氯化钠注射液至全量2000ml，调节pH值至5-7,灌封，60°C保温30min， 间隔24h，保温三次。制备成小容量注射制剂1000支，每支规格：2ml :70 μ g。
[0026] 取70mg科博肽原料，加入配制药液总量80%的注射用水溶解，再加入甘露醇，搅拌 均匀，加注射用水至全量2000ml，搅匀，调节pH