一种从茶叶末中提取分离5-o-没食子酰奎宁酸的方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及茶萃出物，具体涉及从茶叶中分离茶多酚的方法。
【背景技术】
[0002] 茶多酚是茶叶的主要活性成分，是一类具有抗衰老、预防癌症和降血糖血脂的功 效的酚类物质的总称。5-0-没食子酰奎宁酸（5-0-Galloylquinicacid)是茶多酚中的一 个具体化合物，其化学结构如下式I所示。5-0-没食子酰奎宁酸具有显著的抗氧化能力， 是一种潜在的食品或化妆品添加剂；在疾病治疗方面，研究表明5-0-没食子酰奎宁酸对 利什曼病（黑热病）具有很好的疗效（L.R.F.deSousa,S.D.Ramalho,J.B.Fernandes,M. F.D.F.daSilva,M.R.D.lemma,C.J.Correa,D.H.F.deSouza,Μ.I.S.Lima,P. C.Vieira,LeishmanicidalGalloylquinicAcidsareNoncompetitiveInhibitors ofArginase，JBrazilChemSoc, 25 (2014) 1832-1838.);此外，5-0-没食子酰奎宁酸与 3, 4, 5-三-0-没食子酰奎宁酸具有类似结构，后者具有一定的抗癌活性，因此，5-0-没食子 酰奎宁酸还可能具有预防和治疗癌症的功效。
[0003]
[0004] 目前，有多种提取分离茶叶中的茶多酚的方法，但除高效液相色谱法外，其制品均 为多种酚类物质的混合物，不能直接制得单体化合物5-0-没食子酰奎宁酸，且对5-0-没食 子酰奎宁酸的回收率极低。
[0005] 高效液相色谱法是目前唯一可以直接用于分离出高纯度5-0-没食子酰奎宁酸的 方法，但是该方法存在对仪器设备要求高、产品成本高和难以进行规模化生产的不足，因此 急需发展一种操作简便、可以进行规模化生产的分离方法。
【发明内容】
[0006] 针对现有技术中存在的不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种从茶叶末中 提取分离5-0-没食子酰奎宁酸的方法，该方法具有操作简便、对生产设备要求低的优点。
[0007] 本发明解决上述技术问题的方案是：
[0008] -种从茶叶末中提取分离5-0-没食子酰奎宁酸的方法，该方法由以下步骤组成：
[0009] (1)取茶叶末，按lg: 10~20ml的固液比加入体积浓度为50~90%的乙醇溶 液，超声提取，提取液经滤膜过滤，得到粗提液；
[0010] (2)按1ml粗提液加入0. 1~lg磷酸锆的比例往粗提液中加入磷酸错，摇床振荡 6~24h，离心分离出液体，磷酸锆用水洗涤；
[0011] (3)按0.lg: 1ml固液比往洗涤后的磷酸锆中加入重量浓度为0. 4%的磷酸去离 子水溶液，摇床振荡10~24h，离心分离得到脱附液，滤膜过滤，滤液冷冻干燥，即得5-0-没 食子酰奎宁酸；
[0012] 上述步骤（2)所述的磷酸锆制备方法如下：
[0013] A)取固体ZrOCl2 ·8Η20溶于去离子H20后，在搅拌下缓慢加入固体（NH4)2C03至溶 液澄清；再加入（ΝΗ4)2ΗΡ04，完全溶解后加入CTAB，得到澄清反应液；所述CTAB为十六烷基 三甲基溴化铵；
[0014] 其中，所用ZrOCl2 · 8H20、（NH4)2HP04、CTAB和H20 的摩尔比为 Zr0Cl2.8H20 : (NH4)2HP04:CTAB:H20 = 1 : 0.25 ~2.5 : 0.25 : 1000;
[0015] B)将该澄清反应液转移到不锈钢反应釜中，加热至80°C反应2天，90°C反应1天， 120°C反应1天；反应结束后，冷却至常温，离心得到磷酸锆固体，用去离子水洗涤至pH= 7,在80°C的条件下烘干，再于550°C的条件下煅烧6小时，即得白色磷酸锆。
[0016] 本发明所述的从茶叶末中提取分离5-0-没食子酰奎宁酸的方法中，所述的超声 提取的功率与物料体积比为2.5~5W:lml，超声提取的时间为40~80min。
[0017] 本发明所述的从茶叶末中提取分离5-0-没食子酰奎宁酸的方法中，步骤（2)和 (3)中所述的摇床震荡的工作温度37°C，转速为150rpm。
[0018] 本发明所述的从茶叶末中提取分离5-0-没食子酰奎宁酸的方法使用茶叶末为原 料，在乙醇溶液中超声提取后，选择磷酸锆为特异选择性吸附剂，经过吸附、洗涤、脱附和冻 干，不仅可制备纯度大于90%的5-0-没食子酰奎宁酸，且回收率较高。本发明所述的方法 除乙醇外，没有使用其他任何有机试剂，是一种环境友好型的分离方法。本发明方法操作简 单、无需投入昂贵的生产设施、产品成本低，适于工业化生产。
【附图说明】
[0019] 图1为本发明所述方法得到的5-0-没食子酰奎宁酸的ESI-MS图谱。
[0020] 图2为本发明所述方法得到的5-0-没食子酰奎宁酸的NMR图谱。
[0021] 图3为本发明所述方法得到的5-0-没食子酰奎宁酸的HPLC图谱。
【具体实施方式】 [0022] 实施例1
[0023] -、磷酸锆的制备：
[0024] 1、取3. 58g固体ZrOCl2 · 8H20溶于200ml的去离子水后，加入7. 56g固体 (NH4)2C03，连续搅拌至溶液澄清；再加入2. 94g的（ΝΗ4)2ΗΡ04，完全溶解后加入十六烷基三 甲基溴化铵（CTAB) 1.Olg，得到澄清反应液。其中，原料ZrOCl2 · 8H20、（NH4)2HP04、CTAB和 H2〇 的摩尔比为ZrOCl2 · 8H20 : (NH4) 2HP04 :CTAB:Η20 = 1 : 2 : 0· 25 : 1000。
[0025] 2、将该澄清反应液转移到不锈钢反应釜中，加热至80°C反应2天，90°C反应1天， 120°C反应1天；反应结束后，冷却反应釜至常温，5000rpm离心得到的磷酸锆固体用去离子 水洗涤至pH= 7,在烘箱中80°C烘干12h，于马弗炉中550°C煅烧6小时，即得白色磷酸锆。
[0026] 二、5-0-没食子酰奎宁酸的提取分离：
[0027] 1、取过40目筛的太平猴魁茶叶粉末lg，加入体积浓度为70%的乙醇溶液10mL，在 50W/45kHz下超声提取60min;提取液经0. 45μm滤膜过滤后，得到粗提液。
[0028] 2、按1ml粗提液加入0. 4g磷酸锆的比例往粗提液中加入步骤一得到的磷酸错，在 37°C/150rpm的条件下，于震荡摇床上振荡吸附24小时；4000rpm离心1分钟，分离出的磷 酸锆用l〇ml蒸馏水洗涤5次，得到洗涤后的磷酸锆。
[0029] 3、按0.lg洗涤后的磷酸锆中加入lml重量浓度为0. 4%的磷酸去离子水溶液的比 例往磷酸锆中加入磷酸去离子水溶液，在37°C/150rpm条件下，于震荡摇床上振荡脱附24 小时；4000rpm离心1分钟后，得到的脱附液用0. 22μm滤膜过滤，滤液经冷冻干燥后得到 白色粉末〇· 36mg。
[0030] 三、产物的鉴定：
[0031] 将制备的白色粉末溶于0. 1%的甲酸溶液后，电喷雾质谱（ESI-MS)，其ESI-MS 图谱如图1所示，测得粉末中主要成分的荷质比（m/Z)[M-H]为343. 00,结合已有文献 (C.Y.ffu,H.R.Xu,J.Heritier,ff.Andlauer,Determinationofcatechinsandflavonol glycosidesinChineseteavarieties,FoodChem，132 (2012) 144-149·)，初步确定其结 构为5-0-没食子酰奎宁酸。
[0032] 为进一步确定其结构，将制备的白色粉末溶于氘代甲醇（CD30D)后，对其进行 NMR分析，其NMR图谱如图 2 所示，结果如下"HNMR(600MHz,CD30D) :δ7. 04(s, 2H), 5. 39 (d,J= 4. 1Hz, 1H), 4· 18 (s, 1H), 3· 77 (dd,J= 8. 0Hz, 1H), 2· 26-2. 02 (m, 4H)，该图谱与文 献（K.W.Cheng,R.Y.Yang,S.C.S.Tsou，C.S.C.Lo,C.Τ·Ho,T.C.Lee,M.F.Wang,Analysis ofantioxidantactivityandantioxidantconstituentsofChinesetoon,JFunct Food, 1 (2009) 253-259.)对5-0-没食子酰奎宁酸的报道一致。结合文献中对5-0-没食子 酰奎宁酸的报道，及其MS和NMR结果，确定本实验分离得到的产物为5-0-没食子酰奎宁 酸。
[0033] 四、产物的纯度检测：
[0034] 以制备的白色粉末状5-0-没食子酰奎宁酸为样品、以武汉天植生物技术有限公 司生产的5-0-没食子酰奎宁酸为标准品，分别溶于0. 4%的磷酸水溶液后，使用高效液相 色谱对其纯度进行分析。上述分析的色谱条件为：流动相A为乙腈；流动相B为0. 4%的磷 酸/蒸馏水溶液；〇~14分钟，流动相A由5 %的梯度增加到15 %，14~25分钟，流动相A 保持15 %梯度不变，25~53分钟，流动相A由15 %的梯度增加到35 %，53~65分钟，流动 相A由35%梯度增加到85%;检测波长为270nm，流速为0. 7ml/min。结果测得白色粉末产 物中5-0-没食子酰奎宁酸的含量为91. 46%，即所得化合物5-0-没食子酰奎宁酸的纯度为 91. 46%〇
[0035] 上述纯度检测过程中，所得样品的HPLC图谱如图3所示。
[0036] 五、回收率的检测：
[0037]回收率按以下公式计算：
[0038]
[0039] 式中，m为产物的质量；P为产物中5-0-没食子酰奎宁酸的纯度；Μ为1ml上述 5-0-没食子酰奎宁酸的提取分离中步骤1所得到的茶叶末粗提液内5-0-没食子酰奎宁酸 的含量，该含量是将所述茶叶末粗提液进行高效液相色谱定量分析得到。所述高效液相色 谱定量分析的色谱条件与上述产物的纯度检测的色谱条件相同。定量检测结果，本例所述 方法5-0-没食子酰奎宁酸的回收率78. 39%。
[0040] 实施例2
[0041] -、磷酸锆的制备：
[0042] 本实施例中磷酸锆制备方法与实施例1的不同之处在于：原料ZrOCl2 · 8H20、 (NH4) 2HP0