一种芝麻粕阳离子多肽的制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物来源的功能多肽制备和应用，具体属于一种芝麻柏阳离子多肽的制备方法，以及制备的芝麻柏阳离子多肽在制备抗衰老功能性食品中的应用。
技术背景
[0002]芝麻是胡麻科(Pedecliecease)胡麻属(Sesamum.1ndicum.L)植物，是我国四大油料作物之一。中国古代，芝麻历来被视为延年益寿食品。《抱朴子》记载，芝麻“耐风湿，补衰老”。每年约有50%的芝麻用于榨油，产生副产品一芝麻柏约15万吨，后者主要用做农业肥料或者饲料，农业附加值比较低。近年来医学及食品营养学等方面的研究表明，芝麻柏含很多的生物活性成分，比如蛋白质，芝麻素，氨基酸等，其中蛋白质及多肽的含量最高，大约38%-50%。芝麻柏中所含的芝麻素，促进酒精代谢以及脂肪酸β-氧化，加速排除酒精等有害化学物质，降低肝功能损伤及肝肿瘤的产生概率;芝麻素舒张血管肌肉，增加血管直径，顺畅血液流动，维持血压稳定;芝麻素抑制血胆固醇的合成与吸收，改善血液流动性;此外，芝麻素抗氧化，抑制流感病毒、仙台病毒和结核杆菌的生长，对杀虫剂除虫菊酯有增效作用。因此，基于农业副产物重复利用的巨大潜能，芝麻柏受到越来越多人们的关注。
[0003]延长寿命，延缓衰老是人类永恒的追求。目前已经提出几种衰老理论，其中自由基理论最为普遍的。该理论认为自由基在体内的积累和对机体造成的氧化损伤是衰老的根本原因。清除自由基或阻碍过度自由基的合成是抗氧化剂发挥延缓衰老并延长寿命的主要机制。植物或植物源膳食中存在着较多的抗氧化活性物质，可以通过降低体内自由基水平来发挥抗衰老功能。比如，白藜芦醇可以提高急性热应激能力和急性氧化应激能力来发挥抗衰老活性;槲皮素具有显著的抗氧化性，可以通过直接清除体内的游离自由基，延缓秀丽隐杆线虫衰老;其它一些抗氧化物质，如维生素Ε、姜黄素、蓝莓提取物、银杏叶提取物等，也能延缓线虫衰老，显著延长秀丽隐杆线虫的健康寿命。多肽是一种分子量较小，由多个氨基酸通过肽键连接的一类化合物，许多的功能多肽具有特殊的生物活性，如降血压、抗疲劳、增强机体免疫力及降低胆固醇等，而这些活性大多与其抗氧化性质有关。因此，利用农业副产物芝麻柏进一步发现并制备活性多肽，明确其功能性功能的作用机理，开发出有价值的功能性食品，对于提高农产品的附加值具有显著的经济价值及社会价值。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种芝麻柏阳离子多肽的制备方法，以及该多肽在制备抗衰老功能性食品中的应用。
[0005]本发明提供的一种芝麻柏阳离子多肽，来源于芝麻柏，其分子量4kD左右。
[0006]本发明提供的一种芝麻柏阳离子多肽，可以通过如下方法制得:将干燥的芝麻柏，粉碎后，按每克芝麻柏加入10-15mL pH 4.5-5.5的乙酸铵-乙酸缓冲液(20mM)，室温抽提6-8h，8000rpm离心30min除去沉淀，收集上清液;将上清液用细纱布过滤，除去麸皮，加入固体硫酸铵，至80 %的饱和度，室温搅拌4h ； 8000rpm离心30min，收集沉淀；用少量pH 5.0的乙酸钱-乙酸缓冲液重新溶解沉淀，12000rpm离心30min，上清液上样于HiPrep?26/10脱盐柱，除去硫酸铵，收集蛋白峰得到芝麻柏阳离子多肽粗提物；将粗提物进一步上样于HiTrap?DEAE FF弱阴离子交换柱进行分离，收集穿透峰，真空冷冻干燥，得到芝麻柏阳离子多肽干粉。采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术，通过与标准分子量比对，该芝麻柏阳离子多肽的实际分子量为4kD左右。
[0007]本发明提供的一种芝麻柏阳离子多肽具有很好的体外抗氧化活性。
[0008]本发明提供的一种芝麻柏阳离子多肽延长秀丽隐杆线虫的平均寿命约17.6%。
[0009]实验表明，该芝麻柏阳离子多肽显著地延长秀丽隐杆线虫的健康寿命。用终浓度为12.5ug/mL的该多肽处理秀丽隐杆线虫10d，明显降低线虫体内褐脂质的积累。并且，相同浓度的该多肽处理秀丽隐杆线虫2d，提高了线虫的运动能力约15.9 %，咽抽速率约23.2 %。
[0010]本发明获得的抗氧化活性的芝麻柏阳离子多肽经体内抗衰老活性检测，显著延长秀丽隐杆线虫的健康寿命。该多肽可以在抗衰老功能性食品中应用。
[0011 ]与现有技术相比，本发明首次从农业副产物一芝麻柏中分离制备出一种芝麻柏阳离子多肽，显著延长秀丽隐杆线虫的健康寿命。这一多肽的发现，对于芝麻柏资源的深度开发及综合利用具有巨大的经济价值，同时也为抗衰老功能性食品的开发提供技术支持。
【附图说明】
[0012]图1是芝麻柏阳离子多肽的SDS-PAGE分析图和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱图
[0013]图2是芝麻柏阳离子多肽的.0H自由基清除能力
[0014]图3是芝麻柏阳离子多肽对秀丽隐杆线虫寿命的影响
[0015]图4是芝麻柏阳离子多肽对线虫咽抽速率、运动能力、褐脂质积累的影响
【具体实施方式】
[0016]实施例1:芝麻柏阳离子多肽的制备
[0017]将干燥的芝麻柏，粉碎后，收集粉末;称取10g粉末，加入100mLpH 5的20mM的乙酸铵-乙酸缓冲液，室温提取8h，8000rpm离心30min除去沉淀，收集上清液;将上清液用细纱布过滤，除去麸皮，缓慢、均匀地加入固体硫酸铵，至80 %的饱和度，室温搅拌4h; 8000rpm离心30min，收集沉淀；用30mL pH 5.0的乙酸铵-乙酸缓冲液重新溶解沉淀，12000rpm离心30min，上样于HiPrepTM26/10脱盐柱，除去硫酸铵，收集蛋白峰得到芝麻柏阳离子多肽粗提物;将粗提物上样于HiTrap? DEAE FF弱阴离子交换柱进行分离纯化，收集穿透峰，真空冷冻干燥，得到芝麻柏阳离子多肽干粉。采用Folin-酚法测定多肽浓度，经计算采用该方法制得50mg芝麻柏阳离子多肽，经SDS-PAGE分析，芝麻柏阳离子多肽表观分子量为1kD左右，纯度为95%以上(见图1中B)。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱测定，芝麻柏阳离子多肽的实际分子量为4kD左右(见图1中A)。
[0018]实施例2:芝麻柏阳离子多肽的.0H自由基清除能力
[0019]实施例1制备的芝麻柏阳离子多肽，配成不同浓度梯度，按以下方法进行实验。在I OmL试管中依次加入6mmol/L硫酸亚铁溶液2.0mL，不同质量浓度的芝麻柏阳离子多肽溶液
2.0mL，6mmol/L双氧水溶液2.0mL，摇勾后静置1min，再加入6mmol/L水杨酸溶液2.0mL，摇勾，静置30min后于波长510nm处测定其吸光度。重复测定3次。
[0020]清除率/%= (I — (As—Ax)/A。)X 100
[0021]式中:Ao为不加样品液的本底吸光度;As为加入样品溶液反应后的吸光度;Ax为不加水杨酸溶液酶解液的吸光度。实验表明，随着芝麻柏阳离子多肽质量浓度的不断增大，.0H自由基清除能力升高，说明芝麻柏阳离子多肽具有一定的清除.0H自由基能力(见图2)。
[0022]实施例3:芝麻柏阳离子多肽对秀丽隐杆线虫寿命的影响
[0023]用五氟尿嘧啶(FUDR)的方法测定芝麻柏阳离子多肽对模式生物一秀丽隐杆线虫寿命的影响。具体操作如下:多肽用药组浓度为12.5ug/mL，设对照组。每组培养基中均含75mMFUDR以抑制线虫子代的孵育。挑取同步化的L4期线虫到各组培养基中，每组含60条，于20°C培养。从转移时刻起开始计算线虫存活天数，转移当天记为寿命实验第4天。隔天检查线虫，记录存活线虫数，剔除逃逸、意外死亡和袋样虫。实验结果表明:12.5yg/mL的芝麻柏阳离子多肽延长秀丽隐杆线虫的平均寿命约17.6% (见图3)。
[0024]实施例4:芝麻柏阳离子多肽对秀丽隐杆线虫咽抽速率、运动能力、褐脂质积累的影响
[0025]用显微镜观察的方法测定芝麻柏阳离子多肽对线虫咽抽速率、运动能力、褐脂质积累的影响。具体操作如下:
[0026](I)随机挑取20条同步化的L4期成虫，至多肽质量浓度12.5yg/mL NGM培养基，设对照组。分别处理4d和8d，在显微镜下观察并记录30s内线虫的咽抽速率，作为线虫咽抽速率的指标。
[0027](2)随机挑取20条同步化的L4期成虫，至多肽质量浓度12.5yg/mL NGM培养基，设对照组。分别处理4d和8d，在显微镜下观察并记录30s内线虫身体弯曲的次数，作为线虫运动能力的指标。
[0028](3)同步化的线虫至L4期，12.5μg/mL的多肽处理10d，设对照，然后将其麻醉，制片，激光共聚焦显微镜观察线虫肠道的自发荧光，并拍照。
[0029]实验表明:芝麻柏阳离子多肽增加了线虫的咽抽速率约23.2%(见图4中A)，提高其运动能力约15.9% (见图4中B)，并明显降低线虫体内褐脂质的积累(见图4中C)，因此，芝麻柏阳离子多肽显著延长线虫的健康寿命。
【主权项】
1.一种芝麻柏阳离子多肽的制备方法，其特征在于包括如下步骤:将干燥的芝麻柏，粉碎后，按每克芝麻柏加入10-15mL pH 4.5-5.5的20mM乙酸铵-乙酸缓冲液，室温抽提6_8h，8000rpm离心30min除去沉淀，收集上清液;将上清液用细纱布过滤，除去麸皮，加入固体硫酸铵，至80 %的饱和度，室温搅拌4h ； 8000rpm离心30min，收集沉淀；用少量pH 4.5_5.5的20mM乙酸铵-乙酸缓冲液重新溶解沉淀，12000rpm离心30min，上清液上样于HiPrep?26/10脱盐柱，除去硫酸铵，收集蛋白峰得到芝麻柏阳离子多肽粗提物;将粗提物进一步上样于Hi Trap? DEAE FF弱阴离子交换柱进行分离，收集穿透峰，真空冷冻干燥，得到芝麻柏阳离子多肽干粉。2.如权利要求1所述方法制备的芝麻柏阳离子多肽在制备抗衰老功能性食品中的应用。
【专利摘要】本发明提供了一种芝麻粕阳离子多肽(Cationic？Peptides？of？Sesame？Pomace，CPSP)的制备方法，以及该多肽在制备功能性食品中的应用。其制备方法是将芝麻粕粉碎，加入蛋白提取液提取，随后加入硫酸铵沉淀多肽，再经过脱盐,阴离子交换层析等步骤获得纯的芝麻粕阳离子多肽。本发明提供的芝麻粕阳离子多肽，具有很好的抗氧化活性，并且能显著地延长秀丽隐杆线虫的健康寿命，可以作为一种功能因子，应用在抗衰老功能性食品中。
【IPC分类】C07K1/30, C07K14/415, C07K1/36, C07K1/18, A23L33/185
【公开号】CN105566474
【申请号】CN201610131532
【发明人】崔晓东, 王转花, 马晓丽
【申请人】山西大学
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2016年3月8日