梨小果基因及其在调控植物果实大小中的用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物学领域，具体地，本发明涉及一种梨小果基因及其在调控植物果 实大小中的用途。
【背景技术】
[0002] 细胞数目和细胞大小是决定库器官大小的两个关键因素，改变其中任何一个因素 都会影响植物库大小。不过有研究表明细胞数目对控制器官的生物量起着关键的主导作 用。经过人工筛选的栽培种果实或种子都会比原来的野生种大很多。通过育种(如通过杂种 优势育种)作物产量显著增加，其主要育种目标就是通过增加库器官中的细胞数目来增大 库容。目前，已经鉴定出的通过控制细胞数目或者细胞大小来调控植物或者器官大小的基 因很少。
[0003] Fruit weight 2.2(fw2.2)是植物中通过负调控细胞数目来控制果实重量或大小 的重要数量性状的主效基因。在番茄、大豆和玉米等作物中的fw2.2直系同源基因的上调表 达都会负调控库器官细胞数目，进而影响器官大小。然而，本领域对于影响亚洲梨果实大小 的基因或调控机理的了解甚少，因此本领域迫切需要开发调控亚洲梨果实大小的相关基因 及其应用。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种梨小果多肽及其编码基因。
[0005] 本发明的另一目的是提供生产所述多肽的方法以及所述多肽和编码基因的用途， 尤其是在调控植物果实大小方面的用途。
[0006] 在本发明的第一方面，提供了一种分离的梨小果多肽(Ppfw2.2)，所述多肽具有调 控果实大小的功能，并且，所述多肽选自下组：
[0007] (i)具有SEQ ID Ν0·:2所示氨基酸序列的多肽；
[0008] (ii)将如SEQ ID Ν0. :2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺 失或添加而形成的，控制果实大小功能的，由（i)衍生的多肽;或
[0009] (iii)氨基酸序列与SEQ ID N0. :2所示氨基酸序列的同源性295%(较佳地2 98%，更佳地2 99% )，具有控制果实大小功能的多肽。
[0010] 在另一优选例中，所述的调控果实大小包括调控果实的细胞数目。
[0011] 在另一优选例中，所述的调控果实大小包括调控果实的细胞大小。
[0012] 在另一优选例中，所述的调控果实大小包括调控梨属植物的果实大小。
[0013] 在另一优选例中，所述的调控果实大小包括调控亚洲梨的果实大小。
[0014] 在另一优选例中，所述的梨小果多肽来自亚洲梨(Pyrus Pyrifolia)。
[0015] 在本发明的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含一核苷酸 序列，所述核苷酸序列编码本发明第一方面所述的多肽。
[0016] 在另一优选例中，所述的多核苷酸的序列选自下组的一种：
[0017] (A)编码如SEQ ID NO. :2所示多肽的多核苷酸；
[0018] (B)序列如SEQ ID NO. :1、或SEQ ID NO. :3所示的多核苷酸；
[0019] (C)核苷酸序列与SEQ ID NO.: 1、或SEQ ID NO. :3所示序列的同源性2 95% (较佳 地2 98 %，更佳地2 99 % )的多核苷酸；
[0020] (D)在SEQ ID N0. :1、或SEQ ID N0. :3所示多核苷酸的5'端和/或3'端截短或添加 1 -60个(较佳地1 -30，更佳地1 -10个)核苷酸的多核苷酸；
[0021] (E)与(A)-(D)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
[0022] 在另一优选例中，所述的Ppfw2.2编码基因包括DNA、cDNA和/或mRNA。
[0023]在另一优选例中，所述的多核苷酸为基因组序列或cDNA序列。
[0024]在另一优选例中，所述多核苷酸还包含与所述梨小果多肽的0RF序列操作性连接 的启动子。
[0025] 在另一优选例中，所述的启动子选自下组:组成型启动子、组织特异性启动子、诱 导型启动子、或者强启动子。
[0026] 在本发明的第三方面，提供了一种载体，所述载体含有本发明第二方面所述的多 核苷酸。
[0027] 在本发明的第四方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞含有本 发明第三方面所述的载体或基因组中整合有本发明第二方面所述的多核苷酸。
[0028] 在另一优选例中，所述的宿主细胞选自下组:植物细胞、原核细胞、酵母细胞。
[0029] 在另一优选例中，所述的宿主细胞包括蔷薇科植物细胞。
[0030] 在另一优选例中，所述的宿主细胞包括梨细胞。
[0031]在本发明的第五方面，提供了一种制备本发明第一方面所述的本发明第一方面的 方法，所述方法包含：
[0032] (a)在适合表达的条件下，培养本发明第四方面所述的宿主细胞；
[0033] (b)从培养物中分离出梨小果多肽。
[0034] 在本发明的第六方面，提供了一种调控植物果实大小的方法，所述方法包括以下 步骤:拮抗或促进本发明第一方面所述多肽的表达或活性。
[0035] 在另一优选例中，所述植物包括梨属植物，较佳地为亚洲梨。
[0036] 在另一优选例中，所述方法包括给予植物所述多肽或其编码基因的拮抗剂从而促 进果实膨大。
[0037] 在另一优选例中，所述方法包括给予植物所述多肽或其编码基因的促进剂从而抑 制果实膨大。
[0038] 在另一优选例中，所述的诘抗剂包括赤霉素(Gibberellin，GA)。
[0039] 在另一优选例中，所述的拮抗剂包括11^、811?嫩、8111^、或其组合。
[0040] 在另一优选例中，所述方法包括向植物中导入外源的梨小果多肽的编码基因。
[0041 ]在另一优选例中，所述方法包括：
[0042] (i)提供一植物或植物细胞；
[0043] (ii)将编码Ppfw2.2多肽的基因序列导入所述植物或植物细胞，从而获得转基因 的植物或植物细胞。
[0044]在另一优选例中，所述方法包括步骤：
[0045] (a)提供携带Ppfw2.2基因序列的表达载体的农杆菌；
[0046] (b)将植物细胞或组织或器官与步骤(a)中的农杆菌接触，从而使表达Ppfw2.2多 肽的基因序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；
[0047] (c)选择已转入表达Ppfw2.2多肽的基因序列的植物细胞或组织或器官；
[0048] (d)将步骤(c)中的植物细胞或组织或器官再生为植株。
[0049] 在本发明的第七方面，提供了一种本发明第一方面所述多肽的抑制剂的用途，用 于制备促进植物果实膨大的组合物。
[0050] 在另一优选例中，所述的组合物包括农用组合物。
[0051 ] 在另一优选例中，所述的抑制剂包括miRNA、RNAi。
[0052]在本发明的第八方面，提供了一种赤霉素的用途，用于制备抑制本发明第一方面 所述多肽表达和活性的组合物。
[0053]在本发明的第九方面，提供了一种改良植物性状的方法，包括步骤：
[0054] (a)将外源的构建物导入植物细胞，其中所述的构建物含有编码本发明第一方面 所述多肽的核苷酸序列或抑制本发明第一方面所述多肽表达的核苷酸序列，从而获得导入 外源构建物的植物细胞；
[0055] (b)将上一步骤获得的所述导入外源构建物的植物细胞，再生成植株：
[0056] (c)任选地对所述再生的植株进行性状鉴定，从而获得性状改良的植物。
[0057] 在另一优选例中，所述植物包括梨属植物，较佳地为亚洲梨。
[0058] 在本发明的第十方面，提供了一种本发明第一方面所述多肽或其编码基因的用 途，用于筛选植物果实膨大促进剂或拮抗剂。
[0059] 在另一优选例中，所述植物包括梨属植物，较佳地为亚洲梨。
[0060] 在本发明的第十一方面，提供了一种筛选植物果实膨大促进剂或拮抗剂的方法， 所述方法包括以下步骤：
[0061 ] a)将待测物质给予某植物；
[0062] b)检测该植物中Ppfw2.2多肽或其编码基因的活性或表达情况；
[0063]如果与未给予待测物质的对照植物相比，所述Ppfw2.2多肽或其编码基因的活性 或表达下调，则所述待测物质是果实膨大促进剂；
[0064]如果与未给予待测物质的对照植物相比，所述Ppfw2.2多肽或其编码基因的活性 或表达上调，则所述待测物质是果实膨大拮抗剂。
[0065] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附图说明】
[0066] 图1显不了亚洲梨Ppfw2.2基因序列的电泳结果。其中图1A显不了Ppfw2.2基因全 长序列的电泳结果，图1B显示了 Ppfw2.2基因⑶S序列的电泳结果。
[0067]图2显示了梨Ppfw2.2基因的cDNA序列及其推导的氨基酸序列。
[0068] 图3显示了Ppfw2.2三维结构模拟结果。
[0069]图4显示了烟草叶片中Ppfw2.2基因表达产物表达于质膜上。
[0070]图5显示了 9个来自不同物种的fw2.2氨基酸序列的聚类分析。
[0071] 图6显不了不同GA处理的果实大小。
[0072] 图7显示了外源GA处理负调控Ppfw2.2在转录水平的表达量。其中图7A和图7B分别 显示了果肉和果心中Ppfw2.2在转录水平的表达量。
【具体实施方式】
[0073] 发明人经过广泛而深入的研究，首次从梨中，利用克隆技术成功筛选到一个新的 梨小果基因，并对其功能进行了研究，显示该基因能调控植物果实大小，因此在农作物育种 中具有应用前景。实验表明，通过抑制剂抑制Ppfw2.2基因的表达，可以显著的促进果实膨 大。在此基础上完成了本发明。
[0074] 术语
[0075]如本文所用，术语"梨小果多肽"、"本发明多肽"、"Ppfw2.2蛋白"、"Ppfw2.2多肽"、 "果实大小调控多肽"可以互换使用，都是指来源于亚洲梨等植物的、具有调控果实大小功 能的Ppfw2.2多肽(SEQ ID N0. :2)，或其衍生的具有相同功能的衍生多肽或活性片段。 [0076]如本文所用，术语"本发明基因"、"梨小果多肽编码基因"、"Ppfw2.2基因"、"果实 大小调控基因"可以互换使用，都是指编码Ppfw2.2多肽的核苷酸序列（包含或不包含其内 含子的序列）。一种特别优选地Ppfw2.2基因是指来源于亚洲梨的Ppfw2.2基因。
[0077]如本文所用，"分离的"是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原 始环境即是天然环境）。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化 的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化 的。
[0078] 如本文所用，术语"特异性表达"是指