一种通过下调PAB2和PAB8提高植物对NaCl耐受性的方法
【技术领域】
[00011本发明属于生物技术领域，涉及一种通过下调PAB2和PAB8提高植物对NaCl耐受性 的方法。
【背景技术】
[0002] 随着世界人口不断增长，人类对粮食的需求越来越大。盐胁迫是影响农作物产量 的主要因素之一。盐胁迫主要是通过氯化钠作为胁迫来对植物造成损伤。土壤中高浓度的 钠离子会直接影响植物的光合作用、蛋白质合成以及能量代谢等等，导致植物发芽率降低、 发育迟缓、器官的生长和分化被抑制、新陈代谢减缓等等，最终影响农作物产量。截止到目 前为止，全球受盐胁迫影响的农业土地高达1/4到1/3。此外，一项评估认为，每年由于高盐 渍化，有超过1000万公顷的土地不得不被放弃。
[0003] 在我国盐渍地不断增加的严峻形势下，快速有效改善和利用盐渍地资源以及提高 盐渍化土地上的农作物产量具有重大意义。目前为止，改善和利用盐渍地的方式主要有两 种：一是通过合理灌溉、淡水洗盐等土地改良工程措施;但是，这些方法耗资巨大且有很强 的副作用;在淡水资源变得日益珍贵的今天，这些措施的实施难度较大并且很难维持。另一 有效利用盐渍化土地的方法是培育出高效耐盐的新品种，这也是今后发展农业的重要方 向。
[0004] 植物的耐盐性是由多基因数量性状控制且受环境影响的复杂性状；因此，传统育 种方法在提高作物耐盐性的效果上并不是特别理想。随着科学家们对植物耐盐分子机制研 究的不断深入，通过基因工程等手段提高作物的耐盐性受到广泛重视。基因工程技术手段 的优势在于可以精确、稳定和高效地改变基因表达，进而可以有效提高作物耐盐性，极大地 加快了育种速度，成为培育高效耐盐新品种的主要途径。而鉴定耐盐基因及深入研究植物 耐盐分子机制是培育高效耐盐新品种的首要任务。
[0005] Poly(A)几乎存在于所有真核生物的mRNA3'端，并且影响着mRNA几乎所有的代谢 活动，例如转运、翻译和降解。Poly(A)结合蛋白[Poly(A)-binding protein，PABP/PAB]是 RNA结合蛋白超家族中一类高度保守的蛋白亚族，广泛存在于酵母、人和拟南芥等真核生物 不同类型的细胞中。PABP/PAB蛋白通过自身的RNA识别模体RRM(RNA recognition motif) 与Poly (A)结合形成翻译起始复合物，调节mRNA的合成、降解和稳定性以及翻译的起始等 等。
[0006] 对PABP基因的研究主要集中在酵母和动物中，它们的一级结构和基因结构都具有 高度保守性，而高等植物有关PABP基因的研究较少。在酵母细胞中，PABP基因的缺失突变体 是致死型的，说明该基因在对酵母细胞极其重要;拟南芥PABP5基因是花药特异性表达的， 该基因在小孢子发育过程中可能也起到重要的作用，它的缺失可能会引起植物的败育。拟 南芥中PAB2基因在tair网站的基因号为At4g34110，PAB8基因在tair网站的基因号为 Atlg49760(http://www·arabidopsis·org/);另外，拟南芥中PAB2，PAB4和PAB8这三个基因 被报道参与调控病毒的复制。
[0007] 随着植物耐盐分子机制研究的深入及应用的拓展，如何利用已发现的耐盐基因改 变植物对NaCl的耐受性以及如何培育高效耐盐新品种成为研究前沿。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供一种通过下调PAB2和PAB8提高植物对NaCl耐受性的方法。 [0009]本发明提供了如下A-C中任一的应用：
[0010] A.蛋白质1和蛋白质2作为靶标在如下任一中的应用：
[0011] al)提尚植物的耐盐性；
[0012] a2)选育耐盐性提尚的植物品种；
[0013]所述蛋白质1为PAB2蛋白；所述蛋白质2为PAB8蛋白。
[0014] 在所述应用中，所述"蛋白质1和蛋白质2作为靶标"具体可为：以所述蛋白质1和所 述蛋白质2作为靶标，下调所述蛋白质1和所述蛋白质2的表达。
[0015] B.能够抑制植物中蛋白质1和蛋白质2表达的物质在如下任一中的应用：
[0016] al)提尚植物的耐盐性；
[0017] a2)选育耐盐性提尚的植物品种；
[0018] 所述蛋白质1为PAB2蛋白；所述蛋白质2为PAB8蛋白。
[0019] C.能够抑制植物中蛋白质1的编码基因和蛋白质2的编码基因表达的物质在如下 任一中的应用：
[0020] al)提尚植物的耐盐性；
[0021 ] a2)选育耐盐性提尚的植物品种；
[0022] A.蛋白质1和蛋白质2作为靶标在如下任一中的应用：
[0023] al)提尚植物的耐盐性；
[0024] a2)选育耐盐性提尚的植物品种；
[0025] 所述蛋白质1为PAB2蛋白；所述蛋白质2为PAB8蛋白。
[0026]更进一步，所述蛋白质1 (PAB2蛋白）为由序列表中序列3所不的氣基酸序列组成的 蛋白质;所述蛋白质2 (PAB8蛋白）为由序列表中序列6所不的氣基酸序列组成的蛋白质。
[0027] 在本发明中，以上所有a2)中的所述选育耐盐性提高的植物品种的方法，具体可包 括将所述蛋白质KPAB2蛋白）和所述蛋白质2(PAB8蛋白）表达量均较低的植株作为亲本进 行杂交的步骤。
[0028] 本发明还提供了一种培育耐盐性提高的转基因植物的方法。
[0029] 本发明所提供的培育耐盐性提高的转基因植物的方法，具体可包括如下步骤:在 受体植物中对蛋白质1的编码基因和蛋白质2的编码基因均进行抑制表达，得到转基因植 物;所述转基因植物与所述受体植物相比耐盐性增强；
[0030] 所述蛋白质1为PAB2蛋白；所述蛋白质2为PAB8蛋白。
[0031 ]更进一步，所述蛋白质1 (PAB2蛋白）为由序列表中序列3所不的氣基酸序列组成的 蛋白质;所述蛋白质2 (PAB8蛋白）为由序列表中序列6所不的氣基酸序列组成的蛋白质。
[0032]其中，所述"在受体植物中对蛋白质1的编码基因和蛋白质2的编码基因均进行抑 制表达"可为任何能够抑制所述受体植物中所述蛋白质1的编码基因和所述蛋白质2的编码 基因表达的方法。在本发明中，是从拟南芥生物研究中心[Arabidopsis Biological Resource Center(ABRC)，http: //www. arabidopsis · org/]获得的PAB2和PAB8基因双敲除 突变体，该双突变体对NaCl耐受性增强。当然，也可以通过基因工程手段(RNAi技术）获得 PAB2和PAB8低表达、对NaCl耐受性增强的转基因植物。
[0033] 在上述应用或方法中，所述蛋白质1的编码基因（即PAB2基因）是如下1)至5)中任 一所述的DNA分子：
[0034] 1)编码序列为序列表中序列2自5'末端第346至2235位核苷酸所示的DNA分子；
[0035] 2)序列表中序列2所示的DNA分子；
[0036] 3)序列表中序列1所示的DNA分子；
[0037] 4)在严格条件下与1)_3)任一所限定的DNA分子杂交且编码由序列表中序列3所示 的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子；
[0038] 5)与1)_4)任一限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码由序列表中序列3所示 的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子。
[0039] 在上述应用或方法中，所述蛋白质2的编码基因（即PAB8基因）是如下6)至10)中任 一所述的DNA分子：
[0040] 6)编码序列为序列表中序列5自5'末端第261至2276位核苷酸所示的DNA分子；
[00411 7)序列表中序列5所示的DNA分子；
[0042] 8)序列表中序列4所示的DNA分子；
[0043] 9)在严格条件下与6)_8)任一所限定的DNA分子杂交且编码由序列表中序列6所示 的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子；
[0044] 10)与6)_9)任一限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码由序列表中序列6所 示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子。
[0045] 上述严格条件可为用6 X SSC，0.5 % SDS的溶液，在65°C下杂交，然后用2 X SSC， 0 · 1 % SDS和 1 X SSC，0· 1 % SDS各洗膜一次。
[0046]其中，序列1由3712个核苷酸组成，为所述PAB2基因在拟南芥基因组中序列，其中 第614-846位、第966-1152位、第 1810-1898位、第 1977-2051 位、第2142-2408位、第2547-2780位、第2952-3053位、第3204-3287位均为内含子序列；序列2由2441个核苷酸组成，为所 述PAB2基因的cDNA序列，其中第346-2235位为编码序列(0RF);序列1和序列2均编码序列表 中序列3所示的蛋白质，序列3由629个氨基酸残基组成。
[0047] 序列4由3568个核苷酸组成，为所述PAB8基因在拟南芥基因组中序列，其中第556- 886位、第 1006-1141 位、第 1799-1883位、第 1962-2062位、第 2153-2243位、第 2379-2455位、 第2651-2738位、第2943-3031位均为内含子序列；序列5由2570个核苷酸组成，为所述PAB8 基因的cDNA序列，其中第261-2276位为编码序列(0RF);序列4和序列5均编码序列表中序列 6所示的蛋白质，序列6由671个氨基酸残基组成。
[0048] 在上述应用或方法中，所述植物即可为双子叶植物，也可为单子叶植物。
[0049]在本发明的一个实施例中，所述植物为双子叶植物，进一步为十字花科植物，具体 为拟南芥，更加具体为拟南芥野生型(Col-Ο生态型）。
[0050] 本发明研究发现，从拟南芥生物研究中心(ABRC)获得的PAB2和PAB8基因双敲除突 变体对NaCl耐受性增强；因此，可利用PAB2和PAB8调节植物对NaCl的耐受性。另外，也可通 过基因工程手段(RNAi技术)获得PAB2和PAB8低表达、耐盐转基因作物。本发明符合可持续 农业发展需求，对于研究植物耐受NaCl分子机制、改良遗传特性，培育高效耐盐新品种等方 面具有重要的实用价值和市场前景。
【附图说明】
[0051 ] 图1为PAB2和PAB8基因 T-DNA插入双突变体pab2-lpab8-l的鉴定。图中WT代表拟南 芥野生型，即Col-Ο生态型；图中2/8代表pab2-lpab8-l双突变体。从图中可以看出，pab2-lpab8-l双突变体植株为纯合体植株。
[0052] 图2为用实时荧光定量PCR检测PAB2基因 T-DNA插入突变体pab2-l中PAB2基因表达 量的分析结果。从图中可以看出，pab2-l突变体为PAB2基因敲除突变体。
[0053] 图3为用实时荧光定量PCR检测PAB8基因 T-DNA插入突变体pab8-l中PAB8基因表达 量的分析结果。从图中可以看出，pab8-l突变体为PAB8基因敲除突变体。
[0054] 图4为用实时荧光定量PCR检测pab2-lpab8-l双突变体中PAB2和PAB8基因表达量 的分析结果。图中WT代表拟南芥野生型，即Col-ο生态型；图中pab2/8代表pab2-lpab8-l双 突变体。从图中可以看出，pab2-lpab8-l双突变体为PAB2和PAB8基因双敲除突变体。
[0055] 图5为NaCl对pab2-lpab8_l双突变体幼苗生长的影响分析结果。图中pab2/8代表