一种通过下调PAB2和PAB4提高植物对NaCl耐受性的方法
【技术领域】
[00011本发明属于生物技术领域，涉及一种通过下调PAB2和PAB4提高植物对NaCl耐受性 的方法。
【背景技术】
[0002] 随着世界人口不断增长，人类对粮食的需求越来越大。盐胁迫是世界范围内影响 农作物产量的主要因素之一。盐胁迫主要是通过氯化钠作为胁迫来对植物造成损伤。土壤 中高浓度的钠离子会直接影响植物的蛋白质合成、光合作用以及能量代谢等等，导致植物 发育迟缓、发芽率降低、器官的生长和分化被抑制、新陈代谢减缓、蛋白合成减少等等，最终 影响作物的产量。截止到目前为止，全球盐碱土地的总面积达8.4亿hm 2,约占世界陆地面积 的6 %，并按每年1 -4亿hm2的速度增加;我国的盐碱地面积为0.27亿hm2，约占耕地面积的 10%，正以每年1000多亩的速度增加。
[0003] 在我国盐渍地不断增加的严峻形势下，有效改善和利用盐渍地资源以及提高盐渍 化土地上的作物产量对我国农业发展有着重大的现实意义。目前为止，改善和利用盐渍地 的方式主要有两种：一是通过合理灌溉、淡水洗盐等土地改良工程措施;但是，这些方法耗 资巨大且有很强的副作用；当今的淡水资源变得日益珍贵，这些措施的实施难度较大并且 很难维持。另一有效利用盐渍化土地的方法是培育出高效耐盐新品种，这也是今后发展农 业的重要方向。
[0004]植物的耐盐性是由多基因数量性状控制且受环境影响的复杂性状；因此，传统育 种方法在提高作物耐盐性的效果上十分有限。随着分子生物学的发展以及科学家们对植物 耐盐分子机制研究的不断深入，通过基因工程手段提高作物的耐盐性受到广泛重视。基因 工程技术手段的优势在于可以精确、稳定和高效地改变基因表达，进而可以有效提高作物 耐盐性，极大地加快了育种速度，成为培育高效耐盐新品种的有效途径。而鉴定耐盐基因以 及深入研究植物耐盐分子机制是培育高效耐盐新品种的首要任务。
[0005] Poly(A)几乎存在于所有真核生物的mRNA3'端，并且影响着mRNA几乎所有的代谢 活动:转运、翻译和降解。P〇ly(A)结合蛋白[Poly(A)_binding protein，PABP/PAB]是RNA结 合蛋白超家族中一类高度保守的蛋白亚族，广泛存在于酵母、线虫、人和拟南芥等真核生物 不同类型的细胞中。PABP/PAB蛋白是重要的翻译起始因子之一，它能与mRNA末端po 1 y (A)尾 巴相结合，控制poly (A)的长度，参与调节mRNA的合成、降解和稳定性以及翻译的起始等等。
[0006] 酵母和动物中对PABP基因的研究较多，它们的一级结构和基因结构都具有高度保 守性，而高等植物有关PABP基因的研究较少。在酵母细胞中，PABP基因的缺失突变体是致死 型的，说明该基因对酵母细胞极其重要;拟南芥PABP5基因是花药特异性表达的，该基因在 小孢子发育过程中可能也起到重要的作用，它的缺失可能会引起植物的败育。拟南芥中 PAB2基因在tair网站的基因号为At4g34110，PAB4基因在tair网站的基因号为At2g23350 (https ://www.arabidopsis .org/);另外，拟南芥中PAB2、PAB4和PAB8这三个基因被报道参 与调控病毒的复制。
[0007] 随着植物耐盐分子机制研究的深入及应用的拓展，如何利用已发现的耐盐基因改 变植物对NaCl的耐受性以及如何培育高效耐盐新品种成为研究前沿。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供一种通过下调PAB2和PAB4提高植物对NaCl耐受性的方法。
[0009] 本发明提供了如下A-C中任一的应用：
[0010] A.蛋白质1和蛋白质2作为靶标在如下任一中的应用：
[0011] al)提尚植物的耐盐性；
[0012] a2)选育耐盐性提尚的植物品种；
[0013]所述蛋白质1为PAB2蛋白；所述蛋白质2为PAB4蛋白。
[0014] 在所述应用中，所述"蛋白质1和蛋白质2作为靶标"具体可为：以所述蛋白质1和所 述蛋白质2作为靶标，下调所述蛋白质1和所述蛋白质2的表达。
[0015] B.能够抑制植物中蛋白质1和蛋白质2表达的物质在如下任一中的应用：
[0016] al)提尚植物的耐盐性；
[0017] a2)选育耐盐性提尚的植物品种；
[0018] 所述蛋白质1为PAB2蛋白；所述蛋白质2为PAB4蛋白。
[0019] C.能够抑制植物中蛋白质1的编码基因和蛋白质2的编码基因表达的物质在如下 任一中的应用：
[0020] al)提尚植物的耐盐性；
[0021] a2)选育耐盐性提尚的植物品种；
[0022] 所述蛋白质1为PAB2蛋白；所述蛋白质2为PAB4蛋白。
[0023] 更进一步，所述蛋白质1(PAB2蛋白）为由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的 蛋白质;所述蛋白质2 (PAB4蛋白）为由序列表中序列6所不的氣基酸序列组成的蛋白质。
[0024] 在本发明中，以上所有a2)中的所述选育耐盐性提高的植物品种的方法，具体可包 括将所述蛋白质KPAB2蛋白）和所述蛋白质2(PAB4蛋白）表达量均较低的植株作为亲本进 行杂交的步骤。
[0025] 本发明还提供了一种培育耐盐性提高的转基因植物的方法。
[0026] 本发明所提供的培育耐盐性提高的转基因植物的方法，具体可包括如下步骤:在 受体植物中对蛋白质1的编码基因和蛋白质2的编码基因均进行抑制表达，得到转基因植 物;所述转基因植物与所述受体植物相比耐盐性增强；
[0027] 所述蛋白质1为PAB2蛋白；所述蛋白质2为PAB4蛋白。
[0028]更进一步，所述蛋白质1(PAB2蛋白）为由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的 蛋白质;所述蛋白质2 (PAB4蛋白）为由序列表中序列6所不的氣基酸序列组成的蛋白质。
[0029]其中，所述"在受体植物中对蛋白质1的编码基因和蛋白质2的编码基因均进行抑 制表达"可为任何能够抑制所述受体植物中所述蛋白质1的编码基因和所述蛋白质2的编码 基因表达的方法。在本发明中，是从拟南芥生物研究中心[Arabidopsis Biological Resource Center(ABRC)，http: //www. arabidopsis · org/]获得的PAB2和PAB4基因双敲除 突变体，该双突变体对NaCl耐受性增强。当然，也可以通过基因工程手段(RNAi技术）获得 PAB2和PAB4低表达、对NaCl耐受性增强的转基因植物。
[0030] 在上述应用或方法中，所述蛋白质1的编码基因（即PAB2基因）是如下1)至5)中任 一所述的DNA分子：
[0031] 1)编码序列为序列表中序列2自5'末端第346至2235位核苷酸所示的DNA分子；
[0032] 2)序列表中序列2所示的DNA分子；
[0033] 3)序列表中序列1所示的DNA分子；
[0034] 4)在严格条件下与1)-3)任一所限定的DNA分子杂交且编码由序列表中序列3所示 的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子；
[0035] 5)与1)-4)任一限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码由序列表中序列3所示 的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子。
[0036] 在上述应用或方法中，所述蛋白质2的编码基因（即PAB4基因）是如下6)至10)中任 一所述的DNA分子：
[0037] 6)编码序列为序列表中序列5自5'末端第157至2145位核苷酸所示的DNA分子； [0038] 7)序列表中序列5所示的DNA分子；
[0039] 8)序列表中序列4所示的DNA分子；
[0040] 9)在严格条件下与6)-8)任一所限定的DNA分子杂交且编码由序列表中序列6所示 的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子；
[0041] 10)与6)_9)任一限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码由序列表中序列6所 示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子。
[0042] 上述严格条件可为用6 X SSC，0.5 % SDS的溶液，在65°C下杂交，然后用2 X SSC， 0 · 1 % SDS和 1 X SSC，0· 1 % SDS各洗膜一次。
[0043]其中，序列1由3712个核苷酸组成，为所述PAB2基因在拟南芥基因组中序列，其中 第614-846位、第966-1152位、第 1810-1898位、第 1977-2051 位、第2142-2408位、第2547-2780位、第2952-3053位、第3204-3287位均为内含子序列；序列2由2441个核苷酸组成，为所 述PAB2基因的cDNA序列，其中第346-2235位为编码序列(0RF);序列1和序列2均编码序列表 中序列3所示的蛋白质，序列3由629个氨基酸残基组成。
[0044] 序列4由3217个核苷酸组成，为所述PAB4基因在拟南芥基因组中序列，其中第455-666位、第 786-869位、第 1527-1623位、第 1702-1794位、第 1885-1965位、第 2101-2201 位、第 2370-2452位、第2636-2728位均为内含子序列；序列5由2373个核苷酸组成，为所述PAB4基 因的cDNA序列，其中第157-2145位为编码序列(0RF);序列4和序列5均编码序列表中序列6 所示的蛋白质，序列6由662个氨基酸残基组成。
[0045] 在上述应用或方法中，所述植物即可为双子叶植物，也可为单子叶植物。
[0046] 在本发明的一个实施例中，所述植物为双子叶植物，进一步为十字花科植物，具体 为拟南芥，更加具体为拟南芥野生型(Col-Ο生态型）。
[0047] 本发明研究发现，从拟南芥生物研究中心(ABRC)获得的PAB2和PAB4基因双敲除突 变体对NaCl耐受性增强；因此，可利用PAB2和PAB4调节植物对NaCl的耐受性。另外，也可通 过基因工程手段(RNAi技术)获得PAB2和PAB4低表达、耐盐转基因作物。本发明符合可持续 农业发展需求，对于研究植物耐受NaCl分子机制、改良遗传特性，培育高效耐盐新品种等方 面具有重要的实用价值和市场前景。
【附图说明】
[0048] 图1为PAB2和PAB4基因 T-DNA插入双突变体pab2-lpab4-l的鉴定。图中WT代表拟南 芥野生型，即Col-Ο生态型；图中2/4代表pab2-lpab4-l双突变体。从图中可以看出，pab2-lpab4-l双突变体植株为纯合体植株。
[0049] 图2为用实时荧光定量PCR检测PAB2基因 T-DNA插入突变体pab2-l中PAB2基因表达 量的分析结果。从图中可以看出，pab2-l突变体为PAB2基因敲除突变体。
[0050] 图3为用实时荧光定量PCR检测PAB4基因 T-DNA插入突变体pab4-l中PAB4基因表达 量的分析结果。从图中可以看出，pab4-l突变体为PAB4基因敲除突变体。
[0051 ] 图4为用实时荧光定量PCR检测pab2-lpab4-l双突变体中PAB2和PAB4基因表达量 的分析结果。图中WT代表拟南芥野生型，即Col-ο生态型；图中pab2/4代表pab2-lpab4-l双 突变体。从图中可以看出，pab2-lpab4-l双突变体为PAB2和PAB4基因双敲除突变体。
[0052] 图5为NaCl对pab2-lpab4_l双突变体幼苗生长的影响分析结果。图中pab2/4代表 pab2_lp