除草剂耐受性蛋白质的用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种除草剂耐受性蛋白质的用途，特别是涉及一种噻吩磺隆水解酶降 解甲嘧磺隆除草剂的用途。
【背景技术】
[0002] 杂草可以迅速耗尽土壤中作物和其它目的植物所需要的有价值的养分。目前有许 多类型的除草剂用于控制杂草，一种特别流行的除草剂是草甘膦。已经开发了对草甘膦具 有抗性的作物，如玉米、大豆、棉花、甜菜、小麦和水稻等。因此可以对种植草甘膦抗性作物 的田地喷洒草甘膦以控制杂草而不显著损害作物。
[0003] 草甘膦已经在全球广泛使用超过20年，由此导致对草甘膦和草甘膦耐性作物技术 的过度依赖，并在野生杂草物种中对草甘膦天然更具耐受性或已经发展出抗草甘膦活性的 植物施加了高选择压。已报道有少数杂草已发展出对草甘膦的抗性，包括阔叶杂草和禾本 科杂草，如瑞士黑麦草、多花黑麦草、牛筋草、豚草、小飞蓬、野塘蒿和长叶车前。此外，在广 泛使用草甘膦耐性作物之前并不是农业问题的杂草也逐渐盛行，并且难于用草甘膦耐性作 物控制，这些杂草主要与(但不仅与）难于控制的阔叶杂草一起出现，如苋属、藜属、蒲公英 属和鸭跖草科物种。
[0004] 在草甘膦抗性杂草或难于控制的杂草物种的地区，种植者可以通过罐混或换用能 控制遗漏杂草的其它除草剂来弥补草甘膦的弱点，如磺酰脲类除草剂。磺酰脲类除草剂已 经成为继有机磷、乙酰胺类除草剂后的第三大除草剂，全球年销售额达到30亿美元以上，我 国磺酰脲类除草剂每年的应用面积已超过200万公顷，并仍呈扩大的趋势。
[0005] 随着草甘膦抗性杂草的出现和磺酰脲类除草剂的扩大应用，需要对磺酰脲类除草 剂敏感的目的植物中输入磺酰脲类除草剂耐受性。磺酰脲类除草剂可大致分为含酯键的和 不含酯键的，其中含酯键且化学结构相近的磺酰脲类除草剂至少有十余种。仅已鉴定了噻 吩磺隆水解酶可以降解噻吩磺隆，但和噻吩磺隆一样，甲嘧磺隆也属于含酯键的磺酰脲类 除草剂，而目前未发现噻吩磺隆水解酶对甲嘧磺隆除草剂具有耐受性的报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种除草剂耐受性蛋白质的用途，首次提供了将含有有效剂 量甲嘧磺隆的除草剂施加到存在至少一种表达噻吩磺隆水解酶的转基因植物的植物生长 环境中以控制田间杂草生长的方法，增加了噻吩磺隆水解酶对除草剂的耐受范围。
[0007] 为实现上述目的，本发明提供了一种控制杂草的方法，包括将含有有效剂量甲嘧 磺隆的除草剂施加到存在至少一种转基因植物的植物生长环境中，所述转基因植物在其基 因组中包含编码噻吩磺隆水解酶的核苷酸序列，所述转基因植物与其他不具有编码噻吩磺 隆水解酶的核苷酸序列的植物相比具有减弱的植物损伤和/或具有增加的植物产量。
[0008] 进一步地，所述有效剂量甲嘧磺隆为9_120g ai/ha。
[0009] 更进一步地，所述转基因植物为单子叶植物或双子叶植物。
[0010]优选地，所述转基因植物为玉米、大豆、拟南芥、棉花、油菜、水稻、高粱、小麦、大 麦、粟、甘鹿或燕麦。
[0011]在上述技术方案的基础上，所述噻吩磺隆水解酶的氨基酸序列具有SEQ ID N0:1、 SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
[0012] 优选地，所述噻吩磺隆水解酶的核苷酸序列具有：
[0013] (a)编码SEQIDN0:l、SEQIDN0:4或SEQIDN0:7所示的氨基酸序列的核苷酸序 列;或
[0014] (b)SEQIDN0:2或SEQIDN0:3所示的核苷酸序列；或
[0015] (c)SEQIDN0:5或SEQIDN0:6所示的核苷酸序列 ；或
[0016] (d)SEQ ID N0:8或SEQ ID N0:9所示的核苷酸序列。
[0017] 进一步地，所述转基因植物还可以包括至少一种不同于编码所述噻吩磺隆水解酶 的核苷酸序列的第二种核苷酸。
[0018] 所述第二种核苷酸编码选择标记蛋白质、合成活性蛋白质、分解活性蛋白质、抗生 物胁迫蛋白质、抗非生物胁迫蛋白质、雄性不育蛋白质、影响植物产量的蛋白质和/或影响 植物品质的蛋白质。
[0019] 具体地，所述第二种核苷酸编码5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶、草甘膦氧化还 原酶、草甘膦-N-乙酰转移酶、草甘膦脱羧酶、草铵膦乙酰转移酶、α酮戊二酸依赖性双加氧 酶、麦草畏单加氧酶、4-羟苯基丙酮酸双加氧酶、乙酰乳酸合酶、细胞色素类蛋白质和/或原 卟啉原氧化酶。
[0020] 可选择地，所述含有有效剂量甲嘧磺隆的除草剂还包括草甘膦除草剂、草铵膦除 草剂、植物生长素类除草剂、禾本科除草剂、发芽前选择性除草剂和/或发芽后选择性除草 剂。
[0021] 为实现上述目的，本发明还提供了一种控制草甘膦耐受性杂草的方法，包括将有 效剂量的甲嘧磺隆除草剂和草甘膦除草剂施加到种植至少一种转基因植物的大田中，所述 大田中包含草甘膦耐受性杂草或其种子，所述转基因植物在其基因组中包含编码噻吩磺隆 水解酶的核苷酸序列和编码草甘膦耐受性蛋白质的核苷酸序列，所述转基因植物与其他不 具有编码噻吩磺隆水解酶的核苷酸序列和/或编码草甘膦耐受性蛋白质的核苷酸序列的植 物相比具有减弱的植物损伤和/或具有增加的植物产量。
[0022]进一步地，所述有效剂量甲嘧磺隆为9_120g ai/ha。所述有效剂量草甘膦为200-1600g ae/ha〇
[0023]更进一步地，所述转基因植物为单子叶植物或双子叶植物。
[0024]优选地，所述转基因植物为玉米、大豆、拟南芥、棉花、油菜、水稻、高粱、小麦、大 麦、粟、甘鹿或燕麦。
[0025]在上述技术方案的基础上，所述噻吩磺隆水解酶的氨基酸序列具有SEQ ID N0:1、 SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
[0026]优选地，所述噻吩磺隆水解酶的核苷酸序列具有：
[0027] (a)编码SEQIDN0:l、SEQIDN0:4或SEQIDN0:7所示的氨基酸序列的核苷酸序 列;或
[0028] (b)SEQIDN0:2或SEQIDN0:3所示的核苷酸序列；或
[0029] (c)SEQ ID N0:5或SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列；或
[0030] (d)SEQ ID N0:8或SEQ ID N0:9所示的核苷酸序列。
[0031] 进一步地，所述草甘膦耐受性蛋白质包括5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶、草甘 膦氧化还原酶、草甘膦-N-乙酰转移酶或草甘膦脱羧酶。
[0032]具体地，所述草甘膦耐受性蛋白质的氨基酸序列具有SEQ ID N0:10所示的氨基酸 序列。
[0033]优选地，所述草甘膦耐受性蛋白质的核苷酸序列具有：
[0034] (a)编码SEQ ID N0:10所示的氨基酸序列的核苷酸序列;或
[0035] (b)SEQ ID N0:11所示的核苷酸序列。
[0036]为实现上述目的，本发明还提供了一种控制杂草生长的种植系统，包括甲嘧磺隆 除草剂和存在至少一种转基因植物的植物生长环境，将含有有效剂量的所述甲嘧磺隆除草 剂施加到所述存在至少一种转基因植物的植物生长环境中，所述转基因植物在其基因组中 包含编码噻吩磺隆水解酶的核苷酸序列，所述转基因植物与其他不具有编码噻吩磺隆水解 酶的核苷酸序列的植物相比具有减弱的植物损伤和/或具有增加的植物产量。
[0037] 进一步地，所述有效剂量甲嘧磺隆为9_120g ai/ha。
[0038]更进一步地，所述转基因植物为单子叶植物或双子叶植物。
[0039]优选地，所述转基因植物为玉米、大豆、拟南芥、棉花、油菜、水稻、高粱、小麦、大 麦、粟、甘鹿或燕麦。
[0040]在上述技术方案的基础上，所述噻吩磺隆水解酶的氨基酸序列具有SEQ ID N0:1、 SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
[0041 ]优选地，所述噻吩磺隆水解酶的核苷酸序列具有：
[0042] (a)编码SEQIDN0:l、SEQIDN0:4或SEQIDN0:7所示的氨基酸序列的核苷酸序 列;或
[0043] (b)SEQIDN0:2或SEQIDN0:3所示的核苷酸序列；或
[0044] (c)SEQIDN0:5或SEQIDN0:6所示的核苷酸序列；或
[0045] (d)SEQ ID N0:8或SEQ ID N0:9所示的核苷酸序列。
[0046] 进一步地，所述转基因植物还可以包括至少一种不同于编码所述噻吩磺隆水解酶 的核苷酸序列的第二种核苷酸。
[0047] 所述第二种核苷酸编码选择标记蛋白质、合成活性蛋白质、分解活性蛋白质、抗生 物胁迫蛋白质、抗非生物胁迫蛋白质、雄性不育蛋白质、影响植物产量的蛋白质和/或影响 植物品质的蛋白质。
[0048] 具体地，所述第二种核苷酸编码5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶、草甘膦氧化还 原酶、草甘膦-N-乙酰转移酶、草甘膦脱羧酶、草铵膦乙酰转移酶、α酮戊二酸依赖性双加氧 酶、4-羟苯基丙酮酸双加氧酶、乙酰乳酸合酶、细胞色素类蛋白质和/或原卟啉原氧化酶。
[0049] 可选择地，所述含有除草有效剂量甲嘧磺隆的除草剂还包括草甘膦除草剂、草铵 膦除草剂、植物生长素类除草剂、禾本科除草剂、发芽前选择性除草剂和/或发芽后选择性 除草剂。
[0050] 为实现上述目的，本发明还提供了一种控制草甘膦耐受性杂草的种植系统，包括 甲嘧磺隆除草剂、草甘膦除草剂和种植至少一种转基因植物的大田，将有效剂量的所述甲 嘧磺隆除草剂和所述草甘膦除草剂施加到所述种植至少一种转基因植物的大田中，所述大 田中包含草甘膦耐受性杂草或其种子，所述转基因植物在其基因组中包含编码噻吩磺隆水 解酶的核苷酸序列和编码草甘膦耐受性蛋白质的核苷酸序列，所述转基因植物与其他不具 有编码噻吩磺隆水解酶的核苷酸序列和/或编码草甘膦耐受性蛋白质的核苷酸序列的植物 相比具有减弱的植物损伤和/或具有增加的植物产量。
[0051 ]进一步地，所述有效剂量甲嘧磺隆为9-120g ai/ha。所述有效剂量草甘膦为200-1600g ae/ha〇
[0052]更进一步地，所述转基因植物为单子叶植物或双子叶植物。
[0053]优选地，所述转基因植物为玉米、大豆、拟南芥、棉花、油菜、水稻、高粱、小麦、大 麦、粟、甘鹿或燕麦。
[0054]在上述技术方案的基础上，所述噻吩磺隆水解酶的氨基酸序列具有SEQ ID N0:1、 SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
[0055]优选地，所述噻吩磺隆水解酶的核苷酸序列具有：
[0056] (a)编码SEQIDN0:l、SEQIDN0:4或SEQIDN0:7所示的氨基酸序列的核苷酸序 列;或
[0057] (b)SEQIDN0:2或SEQIDN0:3所示的核苷酸序列；或
[0058] (c)SEQIDN0:5或SEQIDN0:6所示的核苷酸序列；或
[0059] (d)SEQ ID N0:8或SEQ ID N0:9所示的核苷酸序列。
[0060] 进一步地，所述草甘膦耐受性蛋白质包括5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶、草甘 膦氧化还原酶、草甘膦-N-乙酰转移酶或草甘膦脱羧酶。
[0061] 具体地，所述草甘膦耐受性蛋白质的氨基酸序列具有SEQ ID N0:10所示的氨基酸 序列。
[0062] 优选地，所述草甘膦耐受性蛋白质的核苷酸序列具有：
[0063] (a)编码SEQ ID N0:10所示的氨基酸序列的核苷酸序列;或
[0064] (b)SEQ ID N0:11所示的核苷酸序列。
[0065] 为实现上述目的，本发明还提供了一种产生耐受甲嘧磺隆除草剂的植物的方法， 包括向植物的基因组中引入编码噻吩磺隆水解酶的核苷酸序列，当含有有效剂量甲嘧磺隆 的除草剂施加到至少存在所述植物的大田中，所述植物与其他不具有编码噻吩磺隆水解酶 的核苷酸序列的植物相比具有减弱的植物损伤和/或具有增加的植物产量。
[0066] 为实现上述目的，本发明还提供了一种培养耐受甲嘧磺隆除草剂的植物的方法， 包括：
[0067] 种植至少一个植物繁殖体，所述植物繁殖体的基因组中包括编码噻吩磺隆水解酶 的多核苷酸序列；
[0068] 使所述植物繁殖体长成植株；
[0069] 将含有有效剂量甲嘧磺隆的除草剂施加到至少包含所述植株的植物生长环境中， 收获与其他不具有编码噻吩磺隆水解酶的多核苷酸序列的植株相比具有减弱的植物损伤 和/或具有增加的植物产量的植株。
[0070] 为实现上述目的，本发明还提供了一种保护植物免受由甲嘧磺隆除草剂引起的损 伤的方法，包括将含有有效剂量甲嘧磺隆的除草剂施加到存在至少一种转基因植物的植物 生长环境中，所述转基因植物在其基因组中包含编码噻吩磺隆水解酶的核苷酸序列，所述 转基因植物与其他不具有编码噻吩磺隆水解酶的核苷酸序列的植物相比具有减弱的植物 损伤和/或具有增加的植物产量。
[0071] 为实现上述目的，本发明还提供了一种噻吩磺隆水解酶降解甲嘧磺隆除草剂的方 法，包括将含有有效剂量甲嘧磺隆的除草剂施加到存在至少一种转基因植物的植物生长环 境中，所述转基因植物在其基因组中包含编码噻吩磺隆水解酶的核苷酸序列，所述转基因 植物与其他不具有编码噻吩磺隆水解酶的核苷酸序列的植物相比具有减弱的植物损伤和/ 或具有增加的植物产量。
[0072] 为实现上述目的，本发明还提供了一种噻吩磺隆水解酶降解甲嘧磺隆除草剂的用 途。
[0073] 具体地，所述噻吩磺隆水解酶降解甲嘧磺隆除草剂的用途包括将含有有效剂量甲 嘧磺隆的除草剂施加到存在至少一种转基因植物的植物生长环境中，所述转基因植物在其 基因组中包含编码噻吩磺隆水解酶的核苷酸序列，所述转基因植物与其他不具有编码噻吩 磺隆水解酶的核苷酸序列的植物相比具有减弱的植物损伤和/或具有增加的植物产量。 [0074]在上述技术方案的基础上，所述噻吩磺隆水解酶的氨基酸序列具有SEQ ID N0:1、 SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
[0075]优选地，所述噻吩磺隆水解酶的核苷酸序列具有：
[0076] (a)编码SEQIDN0:l、SEQIDN0:4或SEQIDN0:7所示的氨基酸序列的核苷酸序 列;或
[0077] (b)SEQIDN0:2或SEQIDN0:3所示的核苷酸序列；或
[0078] (c)SEQIDN0:5或SEQIDN0:6所示的核苷酸序列；或
[0079] (d)SEQ ID N0:8或SEQ ID N0:9所示的核苷酸序列。
[0080] 本发明中所述转基因植物在施用所述除草剂的21天内种植在所述植物生长环境 的土壤中。可选择地，所述除草剂可以在转基因植物种植之前、同时或之后施用。具体地，所 述转基因植物在施用所述除草剂之前12、10、7或3天内种植在土壤内；所述转基因植物在施 用所述除草剂之后12、10、7或3天内种植在土壤内。所述除草剂还可以对所述转基因植物进 行第二次处理，所述第二次处理可以为V1-V2和V3-V4阶段之间、开花前、开花时、开花后或 种子形成时。
[0081 ] 本发明中所述甲啼磺隆（Sulf ometuron-methy 1)是指2_( 4，6-二甲基啼啶-2-基氨 基甲酰氨基磺酰基）苯甲酸甲酯，为白色固体。常用剂型为10%甲嘧磺隆可湿性粉剂、10% 甲嘧磺隆水悬剂（也称为干燥悬浮剂或干悬浮剂）。甲嘧磺隆的商业制剂包括但不限于， Oust、森草净。
[0082] 本发明中所述有效剂量甲嘧磺隆是指以9_120g ai/ha使用，包括10-100gai/ha、 15_90g ai/ha、20_80g ai/ha、25_70g ai/ha、30_60g ai/ha或40_50g ai/ha。
[0083] 本发明中所述双子叶植物包括但不限于苜蓿、菜豆、花椰菜、甘蓝、胡萝卜、芹菜、棉 花、黄瓜、茄子、莴苣、甜瓜、豌豆、胡椒、西萌芦、萝卜、油菜、菠菜、大豆、南瓜、番茄、拟南芥或 西瓜。优选地，所述双子叶植物是指大豆、拟南芥、棉花或油菜。
[0084] 本发明中所述单子叶植物包括但不限于玉米、水稻、高粱、小麦、大麦、黑麦、粟、甘 蔗、燕麦或草坪草。优选地，所述单子叶植物是指玉米、水稻、高粱、小麦、大麦、粟、甘蔗或燕 麦。
[0085] 本发明中，所述除草剂耐受性蛋白质为噻吩磺隆水解酶，如序列表中SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:4和SEQ ID N0:7所示。所述除草剂耐受性基因为编码噻吩磺隆水解酶的核苷 酸序列，如序列表中SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:8 和SEQ ID N0:9所示。所述除草剂耐受性基因为用于植物，除了包含噻吩磺隆水解酶的编码 区外，也可包含其他元件，例如编码选择标记蛋白质、合成活性蛋白质、分解活性蛋白质、抗 生物胁迫蛋白质、抗非生物胁迫蛋白质、雄性不育蛋白质、影响植物产量的蛋白质和/或影 响植物品质的蛋白质，从而获得既具有除草剂耐受性活性、又具有其它性状的转基因植物。
[0086] 本发明中所述抗生物胁迫蛋白质是指抵抗由其他生物所施加的胁迫的蛋白质，如 昆虫抗性蛋白质、（病毒、细菌、真菌、线虫)疾病抗性蛋白质等。
[0087] 本发明中所述抗非生物胁迫蛋白质是指抵抗外界环境所施加的胁迫的蛋白质，如 对除草剂、干旱、热、寒冷、冰冻、盐胁迫、氧化胁迫等具有耐性的蛋白质。
[0088] 本发明中所述影响植物品质的蛋白质是指影响植物输出性状的蛋白质，如改进淀 粉、油、维生素等质量和含量的蛋白质、提高纤维品质的蛋白质等。
[0089] 此外，包含编码噻吩磺隆水解酶的核苷酸序列的表达盒在植物中还可以与至少一 种编码除草剂耐受性基因的蛋白质一起表达，所述除草剂耐受性基因包括但不限于，5-烯 醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)、草甘膦氧化还原酶(G0X)、草甘膦-N-乙酰转移酶 (GAT)、草甘膦脱羧酶、草铵膦乙酰转移酶(ΡΑΤ)、α酮戊二酸依赖性双加氧酶(AAD)、麦草畏 单加氧酶(DM0)、4_羟苯基丙酮酸双加氧酶(ΗΡΗ))、乙酰乳酸合酶(ALS)、细胞色素类蛋白质 (P450)和/或原卟啉原氧化酶(Protox)。
[0090] 本发明中所述"草甘膦"是指N-膦酰甲基甘氨酸和它的盐，用"草甘膦除草剂"处理 是指使用任何一种含有草甘膦的除草剂制剂进行处理。草甘膦的商业制剂包括但不限于， ROUNDUP? (作为异丙胺盐的草甘膦）、R〇UNDUP?weathermax(作为钾盐的草甘 膦）、ROUNDUP?dry 和 RIVAL? (作为胺盐的草甘膦）、R〇UNDUP?geoforce(作为 钠盐的草甘膦)和TOUCHDCWN? (作为三甲基硫盐的草甘膦）。
[0091] 本发明中所述有效剂量草甘膦是指以200-1600g ae/ha使用，包括250-1600g ae/ ha、300_1600g ae/ha、500_1600g ae/ha、800_1500g ae/ha、1000_1500g ae/ha或1200-1500g ae/ha〇
[0092] 本发明中所述"草铵膦"又名草丁膦，是指2-氨基-4-[羟基（甲基