高葡萄糖耐受性β‑葡萄糖苷酶突变体及其基因和应用的制作方法

本发明涉及基因工程和遗传工程领域，具体地，本发明涉及高葡萄糖耐受性β-葡萄糖苷酶突变体及其基因和应用。

背景技术：

β-葡萄糖苷酶能水解结合于非还原性末端的β-d-葡萄糖苷键，同时释放出β-d-葡萄糖和相应的配基，是纤维素分解酶系中的重要组成成分。

β-葡萄糖苷酶在饲料工业、食品工业、生物合成以及生物燃料等领域具有重要的应用价值。农业饲料豆粕中含有丰富的大豆异黄酮，且在天然大豆中大豆异黄酮主要以结合型存在。然而，研究表明结合型糖苷不能直接被小肠壁吸收，因此必须将结合型大豆异黄酮转化为游离型大豆异黄酮才能发挥其药理功效。β-葡萄糖苷酶可以将结合型大豆异黄酮转化为游离型活性苷元，在豆粕饲料中添加一定的β-葡萄糖苷酶可以提高动物对大豆异黄酮的利用率。

在以玉米豆粕型日粮为主的饲料行业，单胃动物中胃肠道内的大豆异黄酮的水解是在一个较高的葡萄糖浓度环境下进行的，淀粉类能量物质水解产生的葡萄糖浓度远大于大豆异黄酮的浓度，因此显著抑制肠道内β-葡萄糖苷酶的活性，通过外源添加具有高葡萄糖耐受性β-葡萄糖苷酶是提高单胃动物肠道内大豆异黄酮的水解效率，提高饲料利用率的一个有效途径。

β-葡萄糖苷酶也被广泛应用于食品医药领域，在医药领域也具有重要应用。另外，在纤维素乙醇行业，具有高耐受性的β-葡萄糖苷酶不仅可以减弱中间产物纤维二糖对上游eg和bgh的反馈抑制作用，也可以减弱产物葡萄糖对自身酶活的抑制。

因此，筛选或者改造得到较高葡萄糖耐受性的β-葡萄糖苷酶对该酶的工业化应用具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供了一种高葡萄糖耐受性β-葡萄糖苷酶突变体。

本发明的再一目的是提供编码上述高葡萄糖耐受性β-葡萄糖苷酶突变体的基因。

本发明的再一目的是提供包含上述突变体基因的重组载体。

本发明的再一目的是提供包含上述基因的重组菌株。

本发明的另一目的是提供一种较高葡萄糖耐受性β-葡萄糖苷酶的应用。

本发明以来源于嗜酸耐热脂环酸芽孢杆菌alicyclobacillussp.a4的β-葡萄糖苷酶为母本，采用分子生物学技术对β-葡萄糖苷酶序列进行定点突变表达。

根据本发明的较高葡萄糖耐受性β-葡萄糖苷酶突变体，是β-葡萄糖苷酶的催化通道非活性位点单点突变后得到的突变体，即β-葡萄糖苷酶的315位氨基酸由组氨酸“h”突变为精氨酸“r”

所较高葡萄糖耐受性β-葡萄糖苷酶突变体的氨基酸序列如seqidno.1所示。

msqnlsfpddfiwgaatasyqiegaaaedgrgpsiwdtfsktpgkvlhghtgdiacdhyhryesdvklmaelgirsyrfslawprvfpakgkvldngfdfykrlleqlhkhgitpaatiyhwdlpqwiedeggwsnravvdyylefaekafrelgdqipmwithnepwcasllsygigehapglrdwrrayraahhlllshgeavklyrslglkgeigitlnltpaysasdspqdvaaaarqdcfanrwfldplfkgeypaefmerverfcgdldvvrpgdmeaiatkmdflginfytrslvaddpndpllgvkrlktdnpvtdmgwevypdalydllhrlqkdytdlpiyitengaasadvvedgnvhdadriaylhqhleaarkfiseggnlkgyylwslldnfewafgytkrfgiiyvdydtqeripkdsfewyrqviaanslpetvqgtv

编码上述高葡萄糖耐受性β-葡萄糖苷酶突变体的基因的核苷酸序列如seqidno.2所示。

atgagtcaaaacctttcgtttccggacgattttatctggggcgctgcgaccgcgtcctatcaaatcgaaggggccgctgccgaagatggcagaggaccgtcgatttgggacacgttttcgaagacgccgggcaaggtattacacggccacacgggtgacatcgcctgtgatcactaccatcgctacgaatctgacgtaaagctcatggcggaattgggaatccgttcttatcgcttttccttggcttggccccgcgtattcccagcgaagggaaaggttctagacaacgggtttgatttctacaagcggttattggagcagttacacaagcatggcatcaccccggcggcgacgatttaccactgggatctaccacagtggattgaagatgagggcggttggtcgaaccgagccgtcgtggattattatctcgaatttgcagaaaaggcatttcgggagcttggcgatcaaattccaatgtggattacgcacaacgaaccttggtgtgcatcgttgctgagctacggcatcggcgagcacgcgccaggtttgcgcgattggcgacgggcctatcgtgcggcacatcaccttttgctctcgcacggcgaggcggtgaaattgtatcgttcactcgggttgaagggcgagatcggcatcacgctcaacctgacgcccgcgtattccgcctccgactcgccgcaggatgtagctgcggccgcgcgccaagattgctttgccaatcgctggttcctcgatccgcttttcaaaggcgaatatccggccgagttcatggagagggtggagcgcttctgtggcgatttagatgtggtccgccctggggacatggaggccatcgccacaaagatggattttctcggcatcaacttctatacgcgctccttagttgcggatgacccaaacgacccgctgcttggcgtgaagcgcctgaagacggacaaccccgtgaccgacatgggttgggaagtgtatcctgatgcgttgtatgaccttttgcaccgcttgcaaaaggattacacggatctccctatctacattacggagaatggggcagcgagcgccgatgtggtcgaagatggaaatgtgcatgatgcagatagaatcgcgtacttgcatcaacacctggaggcggcgcgtaagtttatttcggaaggcgggaacttgaagggatattacctttggtccttgctggataactttgaatgggctttcggttataccaaacgctttggcatcatttacgtcgactatgatacccaagagcgcattccgaaggacagtttcgagtggtatcgccaggtgatcgccgcaaatagcttgccagaaaccgtgcaaggaacggta

本发明还提供一种制备较高葡萄糖耐受性β-葡萄糖苷酶的方法：

1)以野生型重组质粒asbg1-pet30a(+)为模板，采用over-lappcr的方法，一步扩增得到含有较高葡萄糖耐受性β-葡萄糖苷酶突变体基因的重组载体h315r-pet30a(+)；

2)将突变体重组载体转化，诱导表达，获得突变株，优选为h315r-pet30a(+)-bl21(de3)。

本发明还提供了包含上述β-葡萄糖苷酶突变体基因的重组载体，优选为h315r-pet30a(+)。将本发明的β-葡萄糖苷酶突变体基因与合适的表达载体进行连接，作为本发明的一个最优选的实施方案，优选over-lappcr的方法，一步扩增得到含有较高葡萄糖耐受性β-葡萄糖苷酶突变体基因的重组载体h315r-pet30a(+)；

本发明还提供了包含上述β-葡萄糖苷酶基因的重组菌株，优选为重组菌株h315r-pet30a(+)-bl21(de3)。

本发明还提供了上述较高葡萄糖耐受性β-葡萄糖苷酶突变体的应用，例如作为饲料添加剂，应用于单胃动物的玉米豆粕型日粮饲料中。

本发明首先所要解决的技术问题是克服现有β-葡萄糖苷酶的不足，提供一种在水解大豆异黄酮时，具有较高耐受性或具有更好酶活促进效果的β-葡萄糖苷酶突变体。本发明的高葡萄糖耐受性的β-葡萄糖苷酶突变体水解底物pnpg时，葡萄糖的半抑制浓度ic50为1200mm，比野生型高出400mm。在水解1mm大豆苷时，10mm葡萄糖对野生型和突变体的酶活促进作用分别为163％和212％。

附图说明

图1为本发明的高葡萄糖耐受性β-葡萄糖苷酶突变体与野生型β-葡萄糖苷酶的葡萄糖耐受型曲线；

图2为大豆苷水解时的葡萄糖耐受性hplc图谱，其中，(a)未添加葡萄糖；(b)添加葡萄糖。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：表达宿主大肠杆菌bl21(de3)购自北京全式金生物技术有限公司，表达质粒载体pet30a(+)为本实验室保存。

2、酶类及其它生化试剂：kod-plus-neo高保真dna聚合酶购自toyobo公司，质粒小提中量试剂盒购自tiangen，dmt酶购自北京全式金生物技术有限公司。对硝基苯β-d-葡萄糖苷(p-nitrophenylβ-d-glucopy-ranoside，pnpg)购自sigma公司，大豆苷(daidzin)购自梯希爱化成工业发展有限公司，其它试剂均为国产分析纯。

实施例1高葡萄糖耐受性β-葡萄糖苷酶突变体的制备

本发明以来源于嗜酸耐热脂环酸芽孢杆菌alicyclobacillussp.a4β-葡萄糖苷酶asbg1(其氨基酸序列如seqidno.3)为母本，采用分子生物学技术对asbg1进行单点突变后表达。

seqidno.3如下所示：

msqnlsfpddfiwgaatasyqiegaaaedgrgpsiwdtfsktpgkvlhghtgdiacdhyhryesdvklmaelgirsyrfslawprvfpakgkvldngfdfykrlleqlhkhgitpaatiyhwdlpqwiedeggwsnravvdyylefaekafrelgdqipmwithnepwcasllsygigehapglrdwrrayraahhlllshgeavklyrslglkgeigitlnltpaysasdspqdvaaaarqdcfanrwfldplfkgeypaefmerverfcgdldvvrpgdmeaiatkmdflginfytrslvaddpndpllgvkhlktdnpvtdmgwevypdalydllhrlqkdytdlpiyitengaasadvvedgnvhdadriaylhqhleaarkfiseggnlkgyylwslldnfewafgytkrfgiiyvdydtqeripkdsfewyrqviaanslpetvqgtv

以野生型重组质粒asbg1-pet30a(+)为模板，在β-葡萄糖苷酶突变位点的左右各17bp处设计长约34bp并包含突变位点序列的突变引物，一步扩增得到含有较高葡萄糖耐受性β-葡萄糖苷酶突变体基因的重组载体h315r-pet30a(+)。并转化大肠杆菌感受态细胞bl21(de3)，获得重组表达菌株h315r-pet30a(+)-bl21(de3)。

表1.较高葡萄糖耐受性β-葡萄糖苷酶突变体的突变引物

a，下划线表示突变位点序列

将构建好的重组表达菌株h315r-pet30a(+)-bl21(de3)过夜活化，后按1％转接至装有300mllb培养液(含50μg/mlkana)的1l大瓶中，37℃，220rpm培养至od600值约为0.6-0.8(约2-3h)时加入终浓度为0.6mmiptg诱导表达，并转至28℃，190rpm诱导培养约8-10h。12,000rpm，10min离心收集菌体。粗酶液采用his-tag蛋白磁珠纯化，经酶活测定和sds-page验证，收集得到纯蛋白洗脱峰。

实施例2重组高葡萄糖耐受性β-葡萄糖苷酶突变体和野生型的比活分析

β-葡萄糖苷酶活性的测定：在405nm下测定酶水解底物pnpg所生成的产物对硝基苯酚(pnp)的量。

反应步骤：125μl4mmpnpg底物与125μl缓冲液混匀，加入250μl适当稀释的酶液，于55℃反应10min，加入1.5ml1mol/l的na2co3终止反应，使用分光光度计测定od405值。

酶活单位的定义：1个β-葡萄糖苷酶活性单位(u)定义为在给定反应条件下，每分钟分解底物pnpg生成1μmol对硝基苯酚(pnp)所需的酶量。

酶活测定表明：在反应条件下，测得野生型酶比活为54u/mg，重组较高葡萄糖耐受型突变体酶比活为52u/mg，两者相差不大。

实施例3重组β-葡萄糖苷酶突变体和野生型的葡萄糖耐受性曲线测定

以pnpg为底物，分别测定重组β-葡萄糖苷酶突变体和野生型在不同葡萄糖浓度梯度(0-3mol/l)下突变体和野生型的酶比活，以添加葡萄糖的反应组和未添加葡萄糖的对照组酶活的相对比值表征相应浓度葡萄糖对突变体或野生型酶活的促进作用。以相应葡萄糖浓度为横坐标，相对酶活为纵坐标绘制葡萄糖耐受性曲线。

测定结果(图1)表明，重组较高葡萄糖耐受型突变体的葡萄糖耐受型显著提高，野生型酶的ic50为800mm，重组较高葡萄糖耐受型突变体β-葡萄糖苷酶的ic50提高至1200mm。

实施例4重组β-葡萄糖苷酶突变体和野生型水解大豆苷时的葡萄糖耐受性测定

以大豆苷为底物测定重组β-葡萄糖苷酶突变体及野生型的葡萄糖耐受性，反应体系为400μl，由终浓度为1mm的大豆苷、外源添加的终浓度0或10mm的葡萄糖和适当稀释的酶液组成，最适条件下反应10min后，于沸水浴5min终止反应。水解产物成分分析用反向高效液相色谱仪进行检测，以底物大豆苷的水解率来表征酶活的高低。水解率＝100％×(ac-at)/ac,其中ac和at分别表示空白组(未加酶液)和处理组(加酶液)的底物峰面积。hplc图谱如图2，对图谱进行定量分析表明，葡萄糖对重组较高葡萄糖耐受型突变体的酶活促进作用为212％，对野生型酶活促进作用为163％，突变体的葡萄糖促进作用高于野生型。

<110>中国农业科学院饲料研究所

<120>高葡萄糖耐受性β-葡萄糖苷酶突变体及其基因和应用

<160>3

<210>1

<211>454

<212>prt

<213>人工序列

<400>1

msqnlsfpddfiwgaatasyqiegaaaedgrgpsiwdtfsktpgkvlhghtgdiacdhyh60

ryesdvklmaelgirsyrfslawprvfpakgkvldngfdfykrlleqlhkhgitpaatiy120

hwdlpqwiedeggwsnravvdyylefaekafrelgdqipmwithnepwcasllsygigeh180

apglrdwrrayraahhlllshgeavklyrslglkgeigitlnltpaysasdspqdvaaaa240

rqdcfanrwfldplfkgeypaefmerverfcgdldvvrpgdmeaiatkmdflginfytrs300

lvaddpndpllgvkrlktdnpvtdmgwevypdalydllhrlqkdytdlpiyitengaasa360

dvvedgnvhdadriaylhqhleaarkfiseggnlkgyylwslldnfewafgytkrfgiiy420

vdydtqeripkdsfewyrqviaanslpetvqgtv454

<210>2

<211>1362

<212>prt

<213>人工序列

<400>2

atgagtcaaaacctttcgtttccggacgattttatctggggcgctgcgaccgcgtcctat60

caaatcgaaggggccgctgccgaagatggcagaggaccgtcgatttgggacacgttttcg120

aagacgccgggcaaggtattacacggccacacgggtgacatcgcctgtgatcactaccat180

cgctacgaatctgacgtaaagctcatggcggaattgggaatccgttcttatcgcttttcc240

ttggcttggccccgcgtattcccagcgaagggaaaggttctagacaacgggtttgatttc300

tacaagcggttattggagcagttacacaagcatggcatcaccccggcggcgacgatttac360

cactgggatctaccacagtggattgaagatgagggcggttggtcgaaccgagccgtcgtg420

gattattatctcgaatttgcagaaaaggcatttcgggagcttggcgatcaaattccaatg480

tggattacgcacaacgaaccttggtgtgcatcgttgctgagctacggcatcggcgagcac540

gcgccaggtttgcgcgattggcgacgggcctatcgtgcggcacatcaccttttgctctcg600

cacggcgaggcggtgaaattgtatcgttcactcgggttgaagggcgagatcggcatcacg660

ctcaacctgacgcccgcgtattccgcctccgactcgccgcaggatgtagctgcggccgcg720

cgccaagattgctttgccaatcgctggttcctcgatccgcttttcaaaggcgaatatccg780

gccgagttcatggagagggtggagcgcttctgtggcgatttagatgtggtccgccctggg840

gacatggaggccatcgccacaaagatggattttctcggcatcaacttctatacgcgctcc900

ttagttgcggatgacccaaacgacccgctgcttggcgtgaagcgcctgaagacggacaac960

cccgtgaccgacatgggttgggaagtgtatcctgatgcgttgtatgaccttttgcaccgc1020

ttgcaaaaggattacacggatctccctatctacattacggagaatggggcagcgagcgcc1080

gatgtggtcgaagatggaaatgtgcatgatgcagatagaatcgcgtacttgcatcaacac1140

ctggaggcggcgcgtaagtttatttcggaaggcgggaacttgaagggatattacctttgg1200

tccttgctggataactttgaatgggctttcggttataccaaacgctttggcatcatttac1260

gtcgactatgatacccaagagcgcattccgaaggacagtttcgagtggtatcgccaggtg1320

atcgccgcaaatagcttgccagaaaccgtgcaaggaacggta1362

<210>1

<211>454

<212>prt

<213>嗜酸耐热脂环酸芽孢杆菌alicyclobacillussp.a4

<400>1

msqnlsfpddfiwgaatasyqiegaaaedgrgpsiwdtfsktpgkvlhghtgdiacdhyh60

ryesdvklmaelgirsyrfslawprvfpakgkvldngfdfykrlleqlhkhgitpaatiy120

hwdlpqwiedeggwsnravvdyylefaekafrelgdqipmwithnepwcasllsygigeh180

apglrdwrrayraahhlllshgeavklyrslglkgeigitlnltpaysasdspqdvaaaa240

rqdcfanrwfldplfkgeypaefmerverfcgdldvvrpgdmeaiatkmdflginfytrs300

lvaddpndpllgvkhlktdnpvtdmgwevypdalydllhrlqkdytdlpiyitengaasa360

dvvedgnvhdadriaylhqhleaarkfiseggnlkgyylwslldnfewafgytkrfgiiy420

vdydtqeripkdsfewyrqviaanslpetvqgtv454