海洋芽孢杆菌、分离方法、海洋右旋糖苷酶制备方法及应用
【专利说明】海洋芽抱杆菌、分离方法、海洋右旋糖昔酶制备方法及应用 【技术领域】
[0001]本发明设及微生物医疗技术领域，具体设及一种海洋芽抱杆菌、其分离方法、海洋 右旋糖巧酶的制备方法W及它们口腔护理、日化方面的应用。 【【背景技术】】 阳00引右旋糖酢酶（dextranase,EC3. 2. 1. 11)是专一'性切割a-1,6糖巧键葡聚糖中a-1,6糖巧键的酶。按切割方式分类将右旋糖酢酶分成外切型和内切型。右旋糖酢是一种 葡萄糖分子Wa-1,6糖巧键为主链，同时含有少量a-1,3、a-1,4等糖巧键构成的支链， 而形成的葡聚糖大分子。外切型右旋糖酢酶从右旋糖酢的非还原端开始，逐一将葡萄糖分 子切割下来，其终产物为葡萄糖分子及无法切割的部分；内切型右旋糖酢酶在右旋糖酢分 子的内部随机切割，生成少量的葡萄糖和异麦芽寡糖。经研究发现霉菌、酵母菌和细菌都能 产生右旋糖酢酶。
[0003] 1968年Fitzgerald首次报道了右旋糖酢酶在離病防治方面的可行性，自此多国 科学家参与研究，进行动物实验、体外人工牙菌斑实验，最终证明此酶确实有抑制牙菌斑生 物膜形成的作用。1969年Gibbons和Keyes在仓鼠的饮用水中加入右旋糖酢酶，在離病防 治中效果明显。2004年，Wiater等人研究了真菌葡聚糖酶对口腔链球菌生物膜中变聚糖的 影响，结果表明变聚糖酶与右旋糖巧酶可W有效地预防牙菌斑生物膜的形成，尤其是两种 酶联用时作用效果更好。2010年，Yano等人研究发现右旋糖巧酶与香茹多糖共同存在时抑 制生物膜形成的能力增强且对已形成的生物膜也具有降解作用，单独使用右旋糖巧酶时则 对已形成的生物膜的作用效果甚微。近年来还出现了各种通过基因工程手段治疗牙菌斑生 物膜的研究，例如将编码右旋糖巧酶的基因在口腔细菌中克隆表达。目前丹麦Novo公司、 美国Miles公司已有商品右旋糖巧酶制品出售。Novo公司右旋糖巧酶的生产主要由青霉属 发酵获得，美国Miles公司生产的右旋糖巧酶则主要通过毛壳菌属发酵生产获得。运些酶 主要应用于制糖工业。运两种微生物来源的右旋糖巧酶尚未被美国食品药物管理局批准认 可用于食品行业。为了预防牙菌斑生物膜的形成，目前国外已经设计了多种含右旋糖巧酶 的口腔护理产品。2001年，Song等人对斯氏油脂酵母Lipomycesstarke}d突变株KSM22 右旋糖巧酶漱口液进行了临床实验。结果表明，与使用含0. 12%洗必泰漱口液的实验组相 tk，Lipomycesstark巧i突变株KSM22右旋糖巧酶漱口液在牙菌斑及牙銀炎的防治方面 效果要好，而且引起的副作用较小。2004年Masaru等人再次证实了右旋糖巧酶漱口液可W 有效地预防牙菌斑生物膜的形成，而且长期使用后效果会越来越好。
[0004] 目前国内关于右旋糖巧酶在牙菌斑生物膜防治中的应用的报道并不多见，而且相 对集中。1988年中国科学院微生物研究所孙晋武等人证明了淡紫拟青霉右旋糖巧酶可W抑 制变异链球菌产生胞外多糖，降低形成牙菌斑的可能性。此后北京口腔医院赵宝荣等人通 过动物实验及临床实验再次证实了淡紫拟青霉右旋糖巧酶对牙菌斑的抑制作用。2007年四 川大学华西口腔医学院蒋丹研究了美国Sigma公司青霉属右旋糖巧酶对变异链球菌单菌 种生物膜的作用效果，结果显示右旋糖巧酶能降解变异链球菌生物膜中的胞外多糖。 阳〇化]尽管国内已出现关于右旋糖巧酶的部分防離报道，但尚未出现含右旋糖巧酶的口 腔护理产品。究其原因主要包括右旋糖巧酶的微生物来源及右旋糖巧酶的酶学特性。右旋 糖巧酶的产生菌主要为霉菌，用霉菌来生产预防口腔牙菌斑的右旋糖巧酶存在一定的安全 性问题，且产酶时间长，如果用在牙膏中，还存在碱性条件下不稳定的问题。 【
【发明内容】
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[0006] 本发明要解决的技术问题在于扩展口腔护理微生物的种类，特别是开发安全性能 高的海洋芽抱杆菌在口腔护理中的应用，W改善现有技术存在的缺陷。
[0007]为此，本发明提供一种海洋芽抱杆菌度acillusSP.)，所述菌株为kl，保藏单位： 武汉大学中国典型培养物保藏中屯、保藏日期：2015年7月9日，保藏号：CCTCCM2015437。
[0008] 所述菌株的16SrDNA基因序列为沈QIDNo. 2。
[0009] 本发明另一方面提供了一种海洋芽抱杆菌的菌株分离方法，包括下述步骤：
[0010] 于溫度为20~30°C的条件下，将勸海沉积物在固体培养基活化培养1~2天后分 离得到，其中，所述述固体培养基的质量组分如下： 1] 屯、脑粉0. 8~1. 0份，蛋白腺0. 5~0. 75份、琼脂1. 0~1. 5份，人工海水100份， 抑为7. 5~8. 0。
[0012] 本发明再一方面提供了一种海洋右旋糖巧酶的制备方法，包括下述步骤：
[0013] 将所述海洋芽抱杆菌的菌株接种于液体种子培养基，在20~3(TC的条件下振荡 培养24~36小时，获得种子培养液，其中，所述液体种子培养基的质量组分如下：屯、脑粉 0. 8~1. 0份，蛋白腺0. 5~0. 75份，灭菌天然海水100份，抑为7. 5~8. 0;
[0014] 按体积比为1~5%将步骤所述种子培养液接种于发酵培养基，经发酵培养后，离 屯、取上清，制得发酵液，其中，所述发酵培养基的质量组分如下：屯、脑粉0.8~1.2份，蛋白 腺0. 1~0. 5份，化Cl0. 1~0. 2份，胞2册〇4 0. 05~0. 1份，灭菌天然海水100份，抑为 8. 0 ;
[0015] 将所述发酵液过滤膜，滤液经冷冻干燥后制得海洋右旋糖巧酶。
[0016] 在一些实施例中，在完成上述步骤后，还包括将所述海洋右旋糖巧酶进行分离纯 化的步骤。
[0017] 在一些实施例中，所述屯、脑粉是由牛屯、脑经过脱脂、冻干、研磨、过筛后得到。
[0018] 在一些实施例中，所述发酵培养的溫度为20~30°C，时间为26~30h。
[0019] 在一些实施例中，所述分离纯化溫度为4~6°C。
[0020] 此外，本发明还提供了的上述海洋右旋糖巧酶的用途，所述海洋右旋糖巧酶在口 腔护理、日化上的应用。
[0021] 本发明的提供了一种海洋芽抱杆菌，将其应用于口腔护理、日化、海洋生物医疗 中，拓展了生物医疗微生物的范围。本发明应用于上述海洋芽抱杆菌制备得到海洋右旋糖 巧酶，对变异链球菌具有抑制其生物膜形成的功能，除了可W应用于離齿防治及在医疗，日 化等方面W外，对海洋生物医药等方面也具有巨大的应用潜力。 【【附图说明】】
[0022] 图1为右旋糖巧酶产生菌株周围的蓝色透明圈；
[0023] 图2为发酵溫度与海洋胞外右旋糖巧酶酶活的关系图；
[0024] 图3为发酵时间与海洋胞外右旋糖巧酶酶活的关系图；
[00巧]图4为最适发酵条件下细菌的生长曲线（A)与产酶曲线度）图。 【【具体实施方式】】
[00%] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图和具体实施 例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，而 非限定本发明。
[0027]本发明提供一种海洋芽抱杆菌度acillusSP.)，所述菌株为kl，保藏单位：武汉 大学中国典型培养物保藏中屯、，保藏日期：2015年7月9日，保藏号：CCTCCM2015437。
[0028] 经测定，所述芽抱杆菌的菌株16SrDNA基因序列为SEQIDNo. 2,经检索，在 Genebank数据库中未发现完全相同的序列。
[0029] 由于筛选的微生物为芽抱杆菌，已经作为口腔护理产品来源菌株，芽抱杆菌已在 化妆品生产名录内，无需再做额外检测。
[0030] 本发明