巨大芽孢杆菌同化硝酸还原酶和亚硝酸还原酶基因及应用的制作方法
【专利摘要】一种生物【技术领域】的巨大芽孢杆菌同化硝酸还原酶和亚硝酸还原酶基因及应用，包括编码同化硝酸盐还原酶Nas的催化亚基nasC（Seq?ID?No.1）以及编码同化亚酸盐还原酶NiR的大亚基nasD（Seq?ID?No.2）。本发明通过从巨大芽孢杆菌NCT-2中提取得到总RNA后进行cDNA合成，得到cDNA模板后经荧光定量PCR实现功能表达；并进一步用于进行土壤中过多硝酸盐的去除研究。
【专利说明】巨大芽孢杆菌同化硝酸还原酶和亚硝酸还原酶基因及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及的是一种生物【技术领域】的基因及应用，具体是一种巨大芽孢杆菌同化硝酸还原酶和亚硝酸还原酶基因及应用。
【背景技术】
[0002]由于大棚、温室等是在人为改变传统露地的前提下形成的一种高度集约化的设施栽培，具有常年高温、高湿、无降水淋洗、高施肥、高产出、超强度使用等特点，与露天土壤相t匕，其特殊的生态环境与不合理的水肥管理从而导致土壤次生盐溃化。硝酸盐的积累既是设施栽培土壤次生盐溃化的主要特征之一，同时也是引起设施栽培作物生理障碍的主导因子，造成蔬菜作物生长受阻，产量减少以及作物体内硝酸盐的大量累积。由于次生盐溃化问题越来越严重，已经成为制约设施栽培生产的主要障碍因子，如何有效地控制和去除环境中硝酸盐成为当前研究的热点。
[0003]在整个氮循环中，土壤中的硝酸盐主要有三个去向，即通过同化硝酸盐还原(同化作用)、发酵性硝酸盐还原、呼吸性硝酸盐还原(发酵性和呼吸性硝酸盐还原共同组成异化硝酸盐还原)3种作用，所得产物分别为细菌等生物体内的有机氮化物、亚硝酸盐和铵盐、亚硝酸盐或NH3或N2O或N2。同化硝酸盐还原是硝酸盐被硝酸盐还原酶还原成亚硝酸盐，亚硝酸盐被亚硝酸盐还原酶还原为氨，氨被同化成氨基酸的过程。
[0004]已有研究表明，细菌Bacilus subtilis硝酸盐的同化作用基因簇为nasABCDEF，硝酸盐转运子NasA负责将硝酸盐由生物体外转运至体内；硝酸盐还原酶NasBC将体内的硝酸盐还原成亚硝酸盐；亚硝酸盐还原酶NasDE进一步将亚硝酸盐还原酶还原成铵盐。随后在ATP供能下，谷氨酰胺合成酶(GS)将谷氨酸和NH4+转换成谷氨酰胺，最终铵参与微生物体内到氨基酸的合成。所以，研究微生物的硝酸盐同化作用，提高同化作用的效率，在为作物提供更多、更有效的氮素营养这一重要目标的同时，还可适当降低异化硝酸盐还原的趋势，以减少致癌物质亚硝酸盐和臭氧层杀手、温室气体N2O等的排放，符合“低碳”、“减排”的发展方向。
【发明内容】
[0005]本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种巨大芽孢杆菌同化硝酸还原酶和亚硝酸还原酶基因及应用，能够针对解决设施大棚土壤硝酸盐的去除问题。
[0006]本发明提供的基因对研究微生物硝酸盐同化作用机理具有重要的价值，同时为进一步研究环境中硝酸盐的去除提供理论基础。
[0007]本发明是通过以下技术方案实现的:
[0008]本发明涉及一种编码同化硝酸盐还原酶Nas (assimilation nitrate reductase)的催化亚基nasC，其氨基酸序列如Seq ID N0.1所示，由716个氨基酸组成。
[0009]本发明涉及一种编码`同化亚酸盐还原酶NiR的大亚基nasD，其氨基酸序列如SeqID N0.2所示，由804个氨基酸组成。[0010]本发明涉及一种基因功能表达方法，通过从巨大芽孢杆菌NCT-2中提取得到总RNA后进行cDNA合成，得到cDNA模板后经荧光定量PCR实现功能表达。
[0011]所述的基因是指:编码同化硝酸盐还原酶Nas的催化亚基nasC以及编码同化亚酸盐还原酶NiR的大亚基nasD。
[0012]所述的巨大芽孢杆菌NCT-2通过以下方式进行培养:无机盐培养基中加入不同量的KNO3,使其浓度分别为:10、30和50mM，每个浓度设3个重复。阴性对照以(NH4) 2S04为氮源，培养瓶放入培养箱30°C，180rpm培养。分别在2、4、8、12、24h取样。
[0013]所述的总RNA通过以下方式进行提取:按照Takara的RNAi so Plus试剂的说明书进行，基本实验步骤如下:将ImL RNAiso Plus试剂加入上述培养的细菌中，室温放置5min后，12, OOOrpm离心,取上清，加入0.2mL氯仿；用力振荡15s后室温放置2-3min, 12，000rpm4 V离心15min ；小心取出上清，加入等体积异丙醇，室温静置IOmin后，12，000rpm4°C再次离心15min ;弃去上清，用70%乙醇洗涤沉淀后，室温干燥mRNA至半透明状；于55-60°C的水浴中用20-100 μ L无RNA酶的焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate, DEPC)水使RNA全部溶解；取少量于RNA的浓度米用NanodropND-1000测定含量及纯度的测定，其余保存于-80°C冰箱。
[0014]所述的cDNA合成是指:利用PrimeScript? RT反转录试剂盒(TaKaRaBiotechnology, Japan)进行样品的反转录,得到的cDNA样本于-20O保存,用于突光定量PCR。
[0015]所述的反转录的反应体系为:5XPrimeScript?Buffer2 μ L ；PrimeScript? RTEnzyme Mix 10.5 μ L ；01igo dT Primer(5 X10 5mol/L)0.5 μ L ；Random6mers(I X10 4mol/L) 0.5 μ L ；RNA 模板(3 X l(T2g/L) 6.5 μ L,总体系为 10 μ L。
[0016]所述的反转录的条件如下:37°C 15min,85°C 5s。
[0017]所述的荧光定量PCR是指:采用TaKaRa公司的SYBR Green I荧光定量PCR试剂盒和ABI公司的StepOne?荧光定量PCR仪进行荧光实时反转录定量PCR。
[0018]所述的定量PCR 的反应体系为:2XSYBR Premix Ex TaqlO μ L ；cDNAtemplatel μ L (0.lg/L);引物(I X 10 4mol/L) 0.4 μ L ;无酶水 8.2 μ L。
[0019]所述的定量PCR的扩增条件为:95°C 30s ；95°C 10s，59°C 30s，72°C 30s，在延伸阶段检测荧光强 度，收集信号，40个循环；72°C IOs ;熔解曲线为:加热样品从70°C到95°C，每隔0.5°C停留Is检测I次荧光强度变化。
[0020]所述的定量PCR的内标基因为16S rRNA。
[0021]所述的PCR的引物序列包括:
[0022]①nasC荧光定量RT-PCR用的引物序列为:
[0023]正向弓丨物序列:5，-CGGCGAAATCAAACACGA-3，和反向引物序列:5’ -TAATCCGCGATCCCTCCT-3’。
[0024]②nasD荧光定量RT-PCR用的引物序列为:
[0025]正向引物序列:5’ -TTCTTCC GATTCCAGGGTC-3’和反向引物序列:5’ -AGTCCGCCTCCAATAACC-3’。
[0026]③内标基因16S rRNA所用引物序列为:
[0027]正向引物序列:5’ -CCTTACCAGG TCTTGACATCC-3’和反向引物序列:5’ -CCTTAGAGTGCCCAACTGAAT-3’。
[0028]本发明渉及一种基于上沭nasC基因以及nasD基因的应用，将其用于从土壤中去除硝酸盐。
【专利附图】
【附图说明】
[0029]图1菌株NCT-2在不同硝酸盐浓度的无机盐培养基培养下硝酸盐还原酶nasC基因表达差异示意图；
[0030]图中可见菌株在硝酸盐浓度为50mM培养8h后nasC基因表达量最高.[0031]图2菌株NCT-2在不同硝酸盐浓度的无机盐培养基培养下硝酸盐还原酶nasD基因表达差异示意图；
[0032]图中可见菌株在硝酸盐浓度为50mM培养12h后nasD基因表达量最高。
【具体实施方式】
[0033]下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
[0034]菌株NCT-2同化硝酸盐还原酶和亚硝酸盐还原酶序列获得
[0035]1.1菌株来源:巨大芽孢杆菌NCT-2分离自上海市崇明岛设施栽培12_15年的大棚，保藏编号为CGMCC N0.4698，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址是北京市朝 阳区北辰西路I号院3号，中国科学微生物研究所；保存日期为2011年3月21日。
[0036]1.2该菌种接种于菌种培养基，置于30°C, 150rpm,摇床振荡培养24h。
[0037]菌种培养基:KNO3IOg,KH2PO40.5g，KCllg，MgSO4.7Η200.5g，CaCl2Img,FeSO4.7H2010mg,葡萄糖15g,去离子水定容至1L,用NaOH调pH至7.0,高压灭菌。
[0038]1.3基因组DNA的提取:采用CTAB法，基因组DNA提取后样进行品质量检测，其要求包括以下三个方面:1)样品纯度:A260/280值应在1.8-2.0之间；2)样品浓度:样品的浓度越高越好，最低不应低于30ng/y L ；3)样品量:每次SE样品制备至少需要5 μ g样品，大于2kb大片段PE样品制备至少需要30 μ g以上的样品。
[0039]1.4文库构建:检测通过后的样品采用超声波处理，将基因组DNA随机打断成500bp左右的小片段；DNA片段胶回收后进行末端补平；在DNA的5’端磷酸化和3’末端加碱基A ;将Adapter连接在DNA片段末端；连接产物经过PCR扩增后在Flowcell上进行长簇操作。
[0040]1.5测序:构建好的文库使用Illumina Genome Analyzer测序平台进行测序,采用双末端测序策略，两末端各测Slbp的长度。测序完成后对获得的reads序列进行预处理操作，去除接头引物序列等，然后使用组装软件Velvet assembler对reads序列进行组装，生成 Scaffolds 和 Contigs 序列。
[0041]1.6拼接:将拼接得到的结果contigs与参考基因组比对后，将所有congtigs排序并合并。对合并的基因组进行蛋白质预测，运用GeneMarker, Glimmer3和Gismo三个基因预测软件同时进行预测，将3种结果对比，取出两种或两种以上软件预测出的基因，剩余的基因通过Blast和Interproscan比对,取出有比对结果的序列和前面取出的序列合并后进行后续分析。对于基因的功能注释利用蛋白氨基酸序列与NCBI非冗余蛋白数据库(nr)进行Blastp比对。基因COG分类通过将蛋白氨基酸序列与NCBI，Go和COGs数据库进行Blastp比对。为了注释和鉴定代谢途径，基因组序列同时提交到KEGG。根据基因注释结果寻找到硝酸盐同化硝酸盐还原酶和亚硝酸还原酶基因序列。
[0042]1.7实施结果
[0043]得到的硝酸盐还原酶和亚硝酸还原酶相关的基因，名称为nasC和nasD。同化硝酸盐还原酶和亚硝酸盐还原酶分别具有序列表中Seq ID N0.1和Seq ID N0.2的所示的氨基酸序列。
实施例2
[0044]菌株NCT-2在不同硝酸盐浓度培养下同化硝酸盐还原酶和亚硝酸还原酶基因表达量变化
[0045]2.1菌株NCT-2在不同硝酸盐浓度培养
[0046]1)无机盐培养基中加入不同量的KNO3,使其浓度分别为:10、30和50mM，每个浓度
设3个重复。
[0047]2)阴性对照以(NH4)2SO4为氮源，无机盐培养基中分别加入不同量的(NH4)2SO4使其浓度分别为:10、30和50mM，每个浓度设3个重复。
[0048]3)母液培养:以IOmM (NH4)2SO4氮源的无机盐培养菌种。一个三角瓶200mL培养基加入菌种培养箱培养24h，培养条件为30°C，180rpm。阴性对照同此。
[0049]4)每个三角瓶加培养基95mL，加菌液5mL。放入培养箱30°C，180rpm培养。
[0050]5)在 2、4、8、12、24h 分别取样。
[0051]2.2 总 RNA 提取
[0052]总RNA的提取按照Takara的RNAiso Plus试剂的说明书进行,基本实验步骤如下:将ImL RNAiso Plus试剂加入上述培养的细菌中，室温放置5min后，12，OOOrpm离心，取上清，加入0.2mL氯仿；用力振荡15s后室温放置2-3min, 12, 000rpm4°C离心15min ;小心取出上清，加入等体积异丙醇，室温静置IOmin后，12，000rpm4°C再次离心15min ;弃去上清,用70%乙醇洗涤沉淀后，室温干燥mRNA至半透明状；于55-60°C的水浴中用20-100 μ L无RNA酶的焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate, DEPC)水使RNA全部溶解；取少量于RNA的浓度采用Nanodrop ND-1000测定含量及纯度的测定，其余保存于_80°C冰箱。
[0053]2.3cDNA 合成
[0054]利用PrimeScript? RT 反转录试剂盒(TaKaRaBiotechnology, Japan)进行样品的反转录，得到的cDNA样本于-20°C保存，用于荧光定量PCR。反转录反应体系为:5XPrimeScript? Buffer2 μ L ；PrimeScript? RT Enzyme Mix 10.5 μ L ；01igo dTPrimer (5 X 10 5mol/L) 0.5 μ L ；Random6mers (I X 10 4mol/L) 0.5 μ L ；RNA 模板(3 X 10 2g/L)6.5yL，总体系为10 μ L0反转录条件如下:37°C 15min，85°C 5s。
[0055]2.4用突光定量Real-time RT-PCR对nasC和nasD基因进行功能表达
[0056]采用TaKaRa公司的SYBR Green I荧光定量PCR试剂盒和ABI公司的St印One?荧光定量PCR仪进行荧光定量PCR试验。PCR反应体系如下:2XSYBR Premix Ex TaqlO μ L ；cDNA templatel μ L (0.lg/L);引物(I X 10_4mol/L) 0.4 μ L ;无酶水 8.2 μ L。PCR 扩增条件如下:95°C 30s ；95°C 10s，59°C 30s, 72°C 30s，在延伸阶段检测荧光强度，收集信号，40个循环；72°C IOs0熔解曲线:加热样品从70°C到95°C，每隔0.5°C停留Is检测I次荧光强度变化。mRNA 相对表达水平计算公式为 2 a%t，其中 Δ Δ Ct= (Ct.Target-C16S rENA) x~ (CT.Target-C16Smm)Cl。该公式中X表示任何时间点或者处理的样本，对照组为0。采用16S rRNA为内标基因，引物由上海生工生物有限公司合成。
[0057]nasC荧光定量RT-PCR用的引物序列为:
[0058]正向引物序列:5，-CGGCGAAATCAAACACGA-3’；
[0059]反向引物序列:5’-TAATCCGCGATCCCTCCT-3’。
[0060]nasD荧光定量RT-PCR用的引物序列为:
[0061]正向引物序列:5’-TTCTTCC GATTCCAGGGTC-3’ ；
[0062]反向引物序列:5’ -AGTCCGCCTCCAA TAACC-3 ’。
[0063]内标基因16S rRNA所用引物序列为:
[0064]正向引物序列:5’-CCTTACCAGG TCTTGACATCC-3’ ；
[0065]反向引物序列:5，-CCTTAGAGTGCCCAACTGAAT-3，。
[0066]2.5实施结果
[0067]nasC 是编码同化硝酸盐还原酶 Nas (assimilation nitrate reductase)的基因，硝酸盐是Nas的反应底物。不同硝酸盐浓度和不同时间nasC mRNA表达见图1。硝酸盐能调控菌株NCT-2的nasC mRNA的表达水平，硝酸盐的浓度能促进其表达。当NO3-浓度为50mM、菌株培养8h时，同化硝酸盐还原酶基因表达量最高，为对照的4.85倍。
[0068]nasD 是编码同化亚酸盐还原酶 NiR(assimilation nitrite reductase)的基因，硝酸盐还原酶产物-亚硝酸盐是NiR的反应底物，NiR催化亚硝酸盐转化为氨。不同硝酸盐浓度和不同时间nasD mRNA表达见图2。
[0069]结果表明，在10mM-50mM硝酸盐浓度范围内，菌株NCT-2的nasD mRNA的表达量随着浓度的增加而上升，尤其是在硝酸盐浓度从30mM增加50mM ；nasD最高表达量出现在N03-浓度为50mM、菌株培养12h时达到对照的7.32倍。
[0070]通过突光定量PCR验证了 nasC和nasD在不同硝酸盐浓度下的表达模式,结果表明，这两个基因在随着硝酸盐浓度的提高，转录水平均有明显提高。以上结果表明nasC和nasD在硝酸盐同化过程中`发挥重要作用。
【权利要求】
1.一种编码同化硝酸盐还原酶Nas的催化亚基nasC，其特征在于，其氨基酸序列如SeqID N0.1所示，由716个氨基酸组成。
2.一种编码同化亚酸盐还原酶NiR的大亚基nasD，其特征在于，其氨基酸序列如SeqID N0.2所示，由804个氨基酸组成。
3.一种基因功能表达方法，其特征在于，通过从巨大芽孢杆菌NCT-2中提取得到总RNA后进行cDNA合成，得到cDNA模板后经荧光定量PCR实现功能表达； 所述的基因是指:编码同化硝酸盐还原酶Nas的催化亚基nasC以及编码同化亚酸盐还原酶NiR的大亚基nasD。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征是，所述的荧光定量PCR是指:采用TaKaRa公司的SYBR Green I荧光定量PCR试剂盒和ABI公司的StepOne?荧光定量PCR仪进行荧光实时反转录定量PCR。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征是，所述的定量PCR的内标基因为16SrRNA。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征是，所述的PCR的引物序列包括: ①nasC荧光定量RT-PCR用的引物序列为: 正向引物序列:5’ -CGGCGAAATCAAACACGA-3’和反向引物序列:5， -TAATCCGCGATCCCTCCT-3，； ②nasD荧光定量RT-PCR用的引物序列为: 正向引物序列:5’ -TTCTTCC GATTCCAGGGTC-3’ 和反向引物序列:5’ -AGTCCGCCTCCAATAACC-3’ ； ③内标基因16SrRNA所用引物序列为: 正向引物序列:5’ -CCTTACCAGG TCTTGACATCC-3’和反向引物序列:5’ -CCTTAGAGTGCCCAACTGAAT-3’。
7.一种基于巨大芽孢杆菌NCT-2的基因应用，其特征在于，将其用于从土壤中去除硝酸盐； 所述的基因是指:编码同化硝酸盐还原酶Nas的催化亚基nasC以及编码同化亚酸盐还原酶NiR的大亚基nasD。
【文档编号】C12R1/11GK103725654SQ201310674679
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2013年12月11日 优先权日:2013年12月11日
【发明者】周培, 支月娥, 时唯伟, 卫星, 初少华, 冯海玮 申请人:上海交通大学