专利名称：亚硝酸还原酶的制备及亚硝酸还原酶制剂的制备方法
技术领域：
本发明属于生物酶及酶制剂的制备技术领域，更具体的说，采用发酵技术制 备可以降低亚硝酸盐的一种亚硝酸还原酶的制备及亚硝酸还原酶制剂的制备方 法。
背景技术：
亚硝酸盐作为国家食品卫生法允许使用的食品添加剂，在肉制品加工中被广 泛用。它与肌红蛋白反应，生成亚硝基肌红蛋白，呈粉红色，赋予肉制品诱人的 色泽，即发色作用；同时可以抑制微生物的繁殖，尤其是抑制肉毒梭状芽抱杆菌 的繁殖，此菌可以产生肉毒毒素，引起食物中毒，即防腐作用；还可以使肉制品 具有弹性，口感良好，消除原料肉的异味，提高产品品质。但是亚硝酸盐也是公 认的致癌物质，对人体有很大的伤害。现在世界各国都在致力于亚硝酸盐替代物 以及降低其残留研究。但是至今还未找到一种理想的、能够完全替代亚硝酸盐的 物质，世界各国现在都在致力于研究减少肉制品中亚硝酸盐残留量的措施。利用 微生物发酵产生的亚硝酸还原酶，可以很好的降解亚硝酸盐，减少其残留，在肉 制品加工有很广泛的应用前景。发明内容本发明的目的是提供一种亚硝酸还原酶的制备及亚硝酸还原酶制剂的制备方法。所述亚硝酸还原酶的制备是采用发酵技术制备的，制备方法包括以下步骤(1) 将产生亚硝酸盐还原酶的巨大芽孢杆菌(万aciWi/6^e^3Z^rj'i/历MPF-906) 干菌粉溶解于生理盐水中，接种于斜面种子培养基，获得种子培养液，其中巨大芽孢杆菌干菌粉生理盐水=1: 2-5(重量比)；(2) 将步骤(1)获得的种子培养液以1-10%的接种量接种于液体发酵培养基 中，初始pH为5. 0-7. 5，在25-40°C、转速100-240r/min下恒温培养20-36h， 得到菌悬液；(3)菌体细胞的收集，将歩骤(2)获得的菌悬液摇瓶发酵液在离心率为10000-20000Xg 、 l-4。C冷冻离心10-20min，沉淀菌体用磷酸缓冲液重新悬浮， 然后再次离心得到菌体；(4) 菌体细胞的超声波破碎，将提取的菌体细胞，按1000mL培养液菌体细胞 加入50-100mM， p朋.5-7. 5的100mL磷酸缓冲液(是用磷酸氢二钾和磷酸二氢钾 配制的，比例是用pH值来控制的，业内人氏都知道)，超声波破碎，超声波条件 为180-220w，超声2-10s，间歇9-15s， 60-120次，在离心率为26000Xg、 4°C 冷冻离心15min，上清液即为粗酶液；(5) 将粗酶液分离提取，得到亚硝酸还原酶。 所述粗酶液分离提取还包括如下两个步骤① 硫酸铵分级沉淀准确量取粗酶液100mL，加入硫酸铵至10-30 %饱和度， 缓慢搅拌充分混合，4'C下静置2-6h,在离心率为20000-30000Xg， 4。C下离心 10-30rain，弃去沉淀，留取上清液；在上清液中继续加入硫酸铵粉末至饱和度 50-80%，缓慢搅拌充分混和，4'C下静置过夜，在离心率为20000-30000Xg， 4°C 下离心10-30min后，收集沉淀，溶于50mM， pH6. 5的20mL磷酸缓冲液中，于4°C 下存放，作透析备用；② 酶液透析及浓縮将硫酸铵分级沉淀所得酶液于pH6. 5-7. 5、 50-lOOmM的磷 酸缓冲液中透析24-36h，每隔6-8h更换缓冲液一次，透析后，用聚乙二醇粉末 浓縮至4000-8000IUZmL。所述斜面种子培养基为营养肉汤粉l-2wt9i，琼脂1.8-2讨％， p朋.5-7.5;或 葡萄糖15g ，關02 lg， K異1.35 g， KH2P04 0. 7g， MgSO, 7H20 0. 2g，，琼脂 20g，定容至1L，调节pH为7， 12rC灭菌20min。所述发酵培养基配方葡萄糖1-2wt%，蛋白胨O. lwt%，氯化钠0. 1-0. 5wt%， 磷酸氢二钾0. 1-0. 3wt°/。，磷酸二氢钾0. 05-0. 2wt%， MgS04 7H20 0. 02-0. 06wt%， MnS04 H20 0. 001-0. 00 3wt。/。， CaCl2 2H20 0. 002-0. 004wt%， pH 6. 5-7. 5。所述亚硝酸还原酶酶制剂的制备向浓縮亚硝酸盐还原酶液中添加氯化钠和糖，使其最终质量浓度氯化钠10-20%，蔗糖5-20%，制成亚硝酸盐还原酶液体酶制剂。 所述亚硝酸盐还原酶活性的测定 (1)亚硝酸盐标准曲线的建立按照GB/T 5009. 33-2003标准测定，用北京普析仪器厂生产的UV-1900型号 双光束紫外分光光度计测定，以浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制标准曲线。(2)亚硝酸盐还原酶活性的测定参照Rosa (Rosa M, et al， 2001)的方法，构建亚硝酸盐还原酶的活性测 定方法，测定酶活反应体系共250uL: 0. 1M磷酸盐缓冲液(pH6. 5) 125yL， 0. 1M NaC115ttL， 0. 1MN0212. 5uL， 0. 1M MV 7. 5 u L， 0. 1M Na2S204 40 u L，酶液50iiL。 20-36。C水浴中反应10 min，剧烈振荡终止反应，取10 u L加格利斯试剂显色， 在480-620nm比色法测定亚硝酸盐的变化。根据标准曲线，可以得出亚硝酸还原酶的酶活。酶活定义每分钟所还原lnmoL亚硝酸盐所需要的酶量定义为一个酶活力单 位。酶活单位U/mL培养液。本发明中使用的菌种来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)保藏，可商购获得。活化和生长条件按菌种保藏单位提供的说明进行。 本发明的有意效果为1. 应用本发明获得的亚硝酸还原酶的粗酶液或提纯液，得出酶活为 4000-8000U，酶活力回收率达到70-95%。2. 由于本发明所用菌种产生的亚硝酸还原酶具有耐高温特性，在70-8(TC下 仍保留很高的酶活。因此有可能将其用于肉类产品加工，极大的降低了亚硝酸盐 的残留量，保证了肉制品的食用安全，也将促进肉类制品加工企业提高质量，具 有重要的社会效益。本发明用普通的微生物培养器和微生物实验手段生产酶制剂， 方法简便，生产周期短(4-5天)。同时用来减少亚硝酸盐对人体的危害，减少人 类疾病产生，维护公共食品安全，保证了人民身心健康，具有重要的社会效益。
具体实施方式
本发明提供一种亚硝酸还原酶的制备及亚硝酸还原酶制剂的制备方法，下面 用实例进一步说明本发明，但是本发明的内容并不局限于此。 实施例11. 培养基制备(1) 斜面种子培养基配方营养肉汤粉1-2wt%，琼脂1.8-2wtl PH6. 5-7,5。(2) 发酵培养基配方葡萄糖1-2wt%，蛋白胨O. lwt%，氯化钠0. 1-0. 5wt%， 磷酸氢二钾0. 1-0. 3wt%，磷酸二氢钾0. 05-0. 2wt%， MgS(X 7H20 0. 02-0. 06wt%， MnS04 H20 0. 001-0. 003wt%、 CaCl2 2H20 0. 002-0. 004wt%， pH6. 5-7. 5。2. 将巨大芽孢杆菌冻干粉以1: 4的重量比溶解于生理盐水中，用接种环挑 取一环，接种到斜面种子培养基上，37"C培养20h，获得活化斜面；用10mL发酵 培养基在无菌条件下将活化的斜面菌种洗下来，接入250 mL摇瓶，每瓶装100mL 种子培养基，每支斜面接种2-4个，在25 3(TC、转速100-240r/min下恒温培 养20-24h，获得液体种子液。3. 将上述液体种子液分别转接到250 niL摇瓶中，每瓶装发酵培养基100mL， 或者500 mL的瓶子装200mL培养基，在25 30°C、转速100-240r/min下恒温培 养20-24h,获得培养液菌体细胞。4. 菌体细胞的收集，将步骤3获得的菌悬液摇瓶发酵液在1-4t冷冻离心 10min (20000Xg)，沉淀菌体用磷酸缓冲液重新悬浮，然后再次离心得到菌体。5. 将步骤4提取的菌体细胞，按1000mL培养液菌体细胞加100mL、 50-70mM， pH6. 5的磷酸氢钠-磷酸二氢钠缓冲液，超声波破碎，超声波条件为180-220w，超 声2-10s，间歇9-15s， 60-120次，4。C冷冻离心15min、 26000Xg，上清液即为 粗酶液。6. 准确量取步骤5获取的粗酶液100raL，加入硫酸铵至10-30 °/。饱和度，缓慢 搅拌充分混合，4。C下静置2-6h， 30000Xg， 4。C下离心10min，弃去沉淀留取上 清液。在上清液中继续加入硫酸铵粉末至饱和度50-80%，缓慢搅拌充分混和，4°C 下静置过夜，20000Xg， 4。C离心20min后，收集沉淀溶于20mL、 50mM， p服.5 的磷酸氢钠-磷酸二氢钠缓冲液中，于4"C下存放，作透析备用。将适量的酶液装入透析袋，于pH6.5-7.5的50-70mM磷酸缓冲液中透析 24-28h，每隔6-8h更换一次缓冲液。将透析袋中的酶液浓縮到所4000-8000IU/mL。7.向浓縮亚硝酸盐还原酶液中添加氯化钠和糖，使其最终质量浓度氯化钠10 %，蔗糖10%，制成亚硝酸盐还原酶液体酶制剂。对上述亚硝酸盐还原酶液进行活性测定，得出酶活为4000-8000U，酶活力回 收率达到70-95%。实施例21.得到菌体制备(1) 斜面种子培养基配方葡萄糖15.0 g ， NaN02 1.0 g， K2HP04 1.35 g， KH2P04 0 . 70 g， MgS04 7H20 0. 20 g，琼脂20. 0 g，定容至1L，调节pH为7. 0，121。C灭菌20min。(2) .发酵培养基配方:葡萄糖15.0，蛋白胨2.0g， Na異1.35g， KH2P04 0. 70 g， MgS04 7H20 0. 10 g， NaCl 1. 0 g， CaCl2 2H20 . 02 g， MnS04 H20 0. 01 g， NaN02， 0.138 g，定容至1L，调节pH为7. 0， 12rC灭菌20min。2. 将巨大芽孢杆菌冻干粉以1: 2的重量比溶解于生理盐水中，用接种环挑取 一环，接种到斜面培养基上，37。C培养20h，获得活化斜面。再用接种环挑取3-4 环接种于250mL摇瓶中，每瓶装种子培养基50mL，在30 35°C ，转速100-240r/min 下恒温培养24h，获得种子培养液。3. 将种子培养液转接到250 mL液体发酵培养基中，每瓶装100mL，或者500 mL 的瓶子装200mL培养基，在30 35。C、转速100-240r/min下恒温培养24-30h，获 得培养液菌体细胞。4. 菌体细胞的收集，将步骤3获得的菌悬液摇瓶发酵液在l-4'C冷冻离心 20min (10000Xg)，沉淀菌体用磷酸缓冲液重新悬浮，然后再次离心得到菌体。5. 将步骤4提取的菌体细胞，按1000mL培养液菌体细胞加100mL、 70-90mM， pH6. 5-7. 0的磷酸氢钠-磷酸二氢钠缓冲液，超声波破碎，超声波条件为180-220w， 超声2-10s，间歇9-15s， 60-120次。4。C冷冻离心15min、 26000Xg，上清液即 为粗酶液。6. 准确量取步骤5获取的粗酶液100mL，加入硫酸铵至10-30%饱和度，缓慢 搅拌充分混合，4'C下静置2-6h， 30000Xg， 4t:下离心10mim，弃去沉淀留取 上清液。在上清液中继续加入硫酸铵粉末至饱和度50-80%，缓慢搅拌充分混和， 4。C下静置过夜，20000Xg， 4。C离心20min后，收集沉淀溶于20mU 50mM， p服.5的磷酸氢钠-磷酸二氢钠缓冲液中，于4x:下存放，作透析备用。将适量的酶液装入透析袋，于p朋.5-7.5的70-80mM磷酸缓冲液中透析 28-32h，每隔6-8h更换一次缓冲液。将透析袋中的酶液浓縮到所需要的浓度。7. 向浓縮亚硝酸盐还原酶酶液中添加氯化钠，使其最终质量浓度氯化钠20 %，蔗糖5%，制成亚硝酸盐还原酶液体酶制剂。对上述亚硝酸盐还原酶液进行活性测定，得出酶活为4000-8000U，酶活力回收率 达到70-95%。最后应说明的是，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管参 照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以 对本发明的技术方案进行修改或者进行替换，而不脱离本发明的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围之内。
权利要求
1.一种亚硝酸还原酶的制备方法，其特征在于，所述亚硝酸还原酶的制备是采用发酵技术制备的，制备方法包括以下步骤(1)将产生亚硝酸盐还原酶的巨大芽孢杆菌(Bacillus megateriumMPF-906)干菌粉溶解于生理盐水中，接种于斜面种子培养基，获得活化菌种，其中巨大芽孢杆菌干菌粉∶生理盐水＝1∶2-5(重量比)；再将该活化菌种接种于种子培养基中获得种子培养液；(2)将步骤(1)获得的种子培养液以1-10％的接种量接种于液体发酵培养基中，初始pH为5.0-7.5，在25-40℃、转速100-240r/min下恒温培养20-36h，得到菌悬液；(3)菌体细胞的收集，将步骤(2)获得的菌悬液摇瓶发酵液在离心率为10000-20000×g、1-4℃冷冻离心10-20min，沉淀菌体用磷酸缓冲液重新悬浮，然后再次离心得到菌体；(4)菌体细胞的超声波破碎，将提取的菌体细胞，按1000mL培养液菌体细胞加入50-100mM，pH6.5-7.5的100mL磷酸缓冲液，超声波破碎，超声波条件为180-220w，超声2-10s，间歇9-15s，60-120次，在离心率为26000×g、4℃冷冻离心15min，上清液即为粗酶液；(5)将粗酶液分离提取，得到亚硝酸还原酶。
2.根据权利要求1所述亚硝酸还原酶的制备方法，其特征在于，所述粗酶液分 离提取还包括如下两个步骤① 硫酸铵分级沉淀准确量取粗酶液100mL，加入硫酸铵至10-30wt。/。饱和度， 缓慢搅拌充分混合，4C下静置2-6h,在离心率为20000-30000Xg， 4'C下离心 10-30min，弃去沉淀，留取上清液；在上清液中继续加入硫酸铵粉末至饱和度 50-80%，缓慢搅拌充分混和，4"下静置过夜，在离心率为20000-30000Xg， 4°C 下离心10-30min后，收集沉淀，溶于50mM， pH6. 5的20mL磷酸缓冲液中，于4°C 下存放，作透析备用；② 酶液透析及浓缩将硫酸铵分级沉淀所得酶液于p朋.5-7.5、 50-100mM的磷酸缓冲液中透析24-36h，每隔6-8h更换缓冲液一次，透析后，用聚乙二醇粉末 浓縮到4000-8000 IU/mL。
3.根据权利要求1所述亚硝酸还原酶的制备方法，其特征在于，所述斜面培 养基为营养肉汤粉1-2wt%，琼脂1. 8-2wt%， p朋.5-7. 5;或为葡萄糖15. 0 g ， NaN02 1. 0 g，&跳1. 35 g，KH2P04 0. 70 g，MgS04 7H20 0. 20 g，琼月旨20. 0 g，定容至1L，调节pH为7.0， 121。C灭菌20min。
4.根据权利要求1所述亚硝酸还原酶的制备方法，其特征在于，所述发酵培 养基配方葡萄糖l-2wt%,蛋白胨0. lwt%，氯化钠0. 1-0. 5wt%，磷酸氢二钾 0. 1-0, 3wt%，磷酸二氢钾0. 05-0. 2wt%， MgS04 7H20 0. 02-0. 06wtD/。， MnS04 H20 0. 001-0. 003wt%， CaCl2 2H20 0. 002-0. 004wt%， pH6. 5_7. 5。
5.—种亚硝酸还原酶酶制剂的制备方法，其特征在于，所述亚硝酸还原酶酶 制剂的制备为向浓缩亚硝酸盐还原酶液中添加氯化钠和蔗糖，使其最终质量浓度 氯化钠10-20%，蔗糖5-20%，制成亚硝酸盐还原酶液体酶制剂。
全文摘要
本发明公开了属于生物酶及酶制剂的制备技术领域的一种亚硝酸还原酶的制备及亚硝酸还原酶制剂的制备方法。将产生亚硝酸还原酶的巨大芽孢杆菌进行活化制备成种子，获得的种子培养液以1-10％的接种量接种于液体发酵培养基中，初始pH为5.0-7.5，在25-40℃、转速100-240r/min下恒温培养20-36h，得到菌悬液，菌悬液用磷酸缓冲液重新悬浮得到菌体，菌体细胞经超声波破碎，冷冻离心上清液即为粗酶液，粗酶液经分离纯化可得到不同浓度、纯度的亚硝酸盐还原酶，加入酶保护剂制成液体酶制剂，应用本发明获得的亚硝酸还原酶制剂，酶活力为4000-8000U/mL。本制备方法简便，生产周期短，维护公共食品安全。
文档编号C12N9/02GK101230337SQ20081010108
公开日2008年7月30日 申请日期2008年2月28日 优先权日2008年2月28日
发明者萍 刘, 孙君社, 郑怀忠, 马鹏飞 申请人:中国农业大学