专利名称：小球藻硝酸还原酶基因缺陷型稳定表达的转化体系的构建方法以及所构建的转化体系的制作方法
技术领域：
本发明涉及小球藻硝酸还原酶基因缺陷型稳定表达的转化体系的构建方法以及利用该方法所构建的转化体系。
本发明采用普通小球藻作转化受体。普通小球藻(Chlorella vulgaris)属于单细胞绿藻。它的体积小，直径约3～5μm，能在固体培养基上生长，并可以象细菌一样，划线分出单克隆藻落，理论上认为来源于同一个细胞，因此转化后的细胞用直接挑取单克隆藻落的方法就可以选出转化体，无需经过高等植物必需的再生培养，极大地简化了转化培养体系。它的生活周期比一般高等植物短很多。通常，单克隆藻落接入20ml培养液中，50～60小时就可得到约108个/ml的藻液。普通小球藻属自养型生物，生命力强，对培养基的要求不高，少量的无机盐就可维持其正常生活；对光照强度，光照时间的要求也不严格，暗环境下同样可以分裂增殖，与正常条件下培养的细胞无显著性差异。小球藻属于真核生物。来源于真核生物的外源基因在小球藻中能够被糖基化，酰基化或者其它转录后修饰，呈现与天然蛋白一样的活性。更重要的是，单细胞的小球藻是微藻中首先被开发利用的种类之一，其培养方式已由开放池培养发展为生物反应器中连续培养。
小球藻的营养价值相当高。蛋白质含量约占50～80％，组成这些蛋白质的氨基酸中至少有十种在动物体内不能合成，而且含量丰富，约为总蛋白质的42％。脂类的含量高，用不同的培养方法，其含量有变动，幅度为20～85％。大多数脂类是不饱和脂肪酸，还含有一些微量不常见的脂肪酸。它所含的糖类物质同其它植物相比较，纤维素含量少，葡萄糖和果糖含量多，易于吸收。同时，它的维生素含量也很丰富，经测定，维生素A，B1，B2和烟酸的含量是同等重量的某些蔬菜的五倍到五十几倍。通过这些数据，我们不难看出，小球藻是一种具有经济价值的生物，可作为饲料，肥料，而且是潜在的未来食品和医疗保健用品。本发明中将工程抗体基因转入小球藻，把工程藻大量繁殖扩增，那么在收获工程抗体的同时还可以从小球藻中得到其它有用的蛋白质、脂肪酸和维生素类营养物质，达到综合利用的效果。
藻类基因工程的研究开展得比高等植物晚许多。八十年代初期，研究者依据转化高等植物所获得的经验，尝试着将外源基因转入藻类。莱茵衣藻(Rochaix JD，1982；Leung WC，1985；Debuchy R，1989；Mayfield SP，1990；Hall LM，1993)、伞藻(Neuhaus A，1986)、小球藻(Jarvis EE，1991；Dawson HN，1997；Hawkins RL，1999)、红藻(Cheney DP，1992；Kubler JE，1994)、硅藻(Dunahay TG，1995)、褐藻(秦松，1994)陆续成为了转化对象。采用的转化方法大体上与转化高等植物类似，有原生质体PEG法、电击法、基因枪法、微注射法等等。经过近二十年的努力，人们对藻类遗传背景的认识深入了，许多藻类的转化体系也已初步建成，可以在实际应用过程进一步中加以完善。
藻类遗传转化体系的建立是很有意义的。作为新兴的模式生物和其他生物类别相比较，其特有的长处是和原核生物表达系统相比，它能够进行翻译后修饰，保持外源蛋白的天然性状；和哺乳动物表达系统相比，它操作简单，生长迅速，周期短，对生活环境要求不高，还可用发酵技术大批量生产，成本低；和酵母细胞表达系统相比，它能利用其它真核生物的启动子，因此启动子可选择范围大。更优越的是，细胞内含物丰富，营养价值高。可以用它作为生物反应器来生产药用外源蛋白或其它有用蛋白。
然而，在植物转基因工作中经常碰到外源基因不易整合到染色体基因组，或整合后表达不稳定和与预期结果不一致的现象时有发生，如插入基因的拷贝数，含多个插入基因时表达水平反而低；又如含强启动子的外源基因，在转化体中有时不表达或表现出内源基因失活；或具有相同启动子的两种外源基因，相继转化同一植物，结果先转入的基因失活；或正义、反义DNA的转入，使内源基因失活等，目前称之为转基因沉默现象。造成这些现象的原因目前已发现有1.DNA甲基化作用这一作用本是细胞整个生活周期中重要的调控机制。当外来基因刚进入细胞时，胞内限制酶会通过识别DNA甲基化程度来判断该基因是自己的或非己的，进而降解非己DNA达到稳定自身DNA结构的目的。如果外源基因侥幸逃避过这一监视系统而整合入染色体组，又由于外源基因碱基组成与插入位点处原有碱基组成的不一致，破坏了原有染色体的组织结构，则细胞中类似于细菌限制修饰系统会进行识别并将之甲基化，结果导致外源基因转录受抑制，表达被阻断而失活。在工作中常表现为用Southern Blot能检测到外源基因的完整插入，而在细胞水平或个体水平上却检测不出外源基因的表达产物。再用对甲基化敏感的限制性内切酶分析，可发现外源基因已被甲基化。
2.外源基因拷贝数的影响大多数转基因植物中发现，外源基因多拷贝地整合入基因组DNA，往往导致外源基因失活。究其原因，可能是多个拷贝的外源基因发生异位配对，形成DNA三链或四链结构，致使染色体局部构型改变，增加了异染色质化的可能性所致(Howard-Flander P，1984)。
3.反式失活作用当采用相同的启动子引导不同的外源基因时。外源基因的表达并不象预计的一样高。这一现象曾让研究人员迷惑不解。后来，人们推测这一现象的发生可能是因为相同的启动子竞争资源有限的转录因子，引起转录水平降低从而影响到外源基因的翻译水平。这一推测于1996年被Park等人所证明(Park YD，1986)。通常反式失活是由启动子区域内的一段同源序列引起，已有报道指出，启动子区域内90bp的同源序列就足以抑制两个基因的表达水平(Vaucheret H，1993)；反式失活引起的基因表达抑制的程度还与其在宿主染色体中的位置相关(NeuhuberF，1994)。因此，采用非同源的启动子引导不同外源基因是避开反式失活最直接的方法。
4.共抑制现象 共抑制现象最早在矮牵牛上发现(Mol et al.1989，Napoli et al.1990，van der Krol et al，1990)，将编码矮牵牛查尔酮合成酶的Chs基因转入开深色花的矮牵牛中，结果42％的转基因植株开全白花或杂色花，即外源和内源Chs基因的表达均受到抑制。这一现象产生的机制与反式失活相似，也是由同源序列引起，然而两者却存在显著性差异。由共抑制引起的基因失活，核内Chs mRNA表达量仍高，只是在细胞质中mRNA才被降解，抑制发生在转录之后。对这一现象的解释有三种不同的假说。第一种假说来自Tanzer(Tanzer MM，1997)，他认为mRNA的降解过程发生于细胞质中。同时，Lee证明多聚核糖体是mRNA降解所必需的(Lee KY，1997)。第二种假说来自Cornelissen，认为反义RNA加速了mRNA的降解过程(Cornelissen M，1989)。在此基础上人们提出了第三种假说特定类型mRNA特异性降解是由于缺乏特异tRNA而引起的转译未成熟终止(Murray EE，1991)。
5.染色体位置效应人们发现外源基因进入细胞后常常呈现不同的表达强度，有的超出正常值，有的与正常值相近，有的表达很少或几乎完全受抑制。研究人员推测，这些意外的表达结果主要由于外源基因整合入细胞染色体的位点及临近DNA顺式作用元件的影响所致，即染色体位置效应。1990年，Raya al Shawi证实了这一推断。他将MUP启动子引导下的HSV-TK基因转化小鼠时发现，大部分转基因小鼠在外分泌腺中能检测到HSV-TK活性及其mRNA。但是编号为64的转基因小鼠系却没有HSV-TK蛋白表达。为弄清HSV-TK的不表达是因为基因本身的原因，如点突变、DNA断裂、重组等，还是因为受到HSV-TK插入染色体位点的微环境影响所致，他将64系中外源片段重新转化小鼠。结果证明，HSV-TK在外分泌腺的不表达是缘于染色体位置效应(Raya al-showi，1990)。
同时期，在研究由人β-珠蛋白基因家族突变引起的广谱遗传病的过程中，科学家们幸运地发现，远离β-珠蛋白基因上游50kb及下游30kb的区域对β-珠蛋白基因家族的表达起着关键性的作用。当这一“微位点”引入载体后，转基因小鼠中外源基因不依赖于整合位点，呈现依赖于拷贝数的组织特异性表达(Grosveld F，1987)。这一抗拒位置效应的区域是红细胞特异的DNase I超敏位点，称为位置控制区(LCR)。LCR的发现为基因治疗β-珠蛋白基因家族突变造成的遗传病解决了一大难题，为外源基因在生物体内排除位置效应干扰，进行稳定表达提供了一则可行性方法。另一种能抗拒位置效应的顺式作用元件称核基质附着区(MAR)或染色体骨架附着区(SAR)。电镜下观察染色体的高级结构是一簇一簇的突环。每一突环被认为是一个结构域，每个结构域中的一个基因或多个基因在调控或功能上是明确相关的。因此，理论上认为，如果外源基因两端带有MARs，如人载脂蛋白B(apoB)的MARs(Kalos M，1995)，就构成了一个结构域，可以免受相邻结构域中顺式作用元件的影响，按照自己应有的方式表达蛋白。但是，研究表明，来自鸡、豌豆、酵母或烟草的MARs不能抗拒某些位点上外源基因的反式失活(Vaucheret H，1998)。
Dnase I超敏位点大多数是转录调控元件，所以人们猜测，除了LCRs和MARs外，某些DNase I超敏位点可能具有相似的抵抗临近DNA顺式元件的作用。Chung等人提出，鸡β-珠蛋白5’端DNase I超敏位点可以在红细胞中充当绝缘子，在果蝇中保护外源基因免受位置效应的影响(Chung J，1993)。
除了采用某些具绝缘作用的DNA区域来消除位置效应外，定向替换或同源重组是保证外源基因稳定表达的另一有效方法。Le Mouellic H用E.coli的lacZ替换下Hox-3.1，利用Hox-3.1原有的ATG及整套转录翻译系统，得到了与体内Hox-3.1相似表达量的lacZ蛋白(Le Mouellic H，1990)。但是要实现定向替换并不是件容易的事情，一不小心就可能破坏蛋白移码框，翻译出错误蛋白。同源重组虽然在理论上可行，但是实际操作起来却很被动，不可控因素太多，目前多采用较长的同源序列来保障同源重组的发生是较有效的措施。
消除上述影响的对策当前已可以采用一些办法针对不同的影响进行消除。可直接使用去甲基化试剂，如5-氮胞苷(5-azacytidine)来逆转(Zhu Zhen，1991)外源DNA甲基化，或通过有性杂交(Scheid OM，1991)、嫁接(van Slogteren GMS，1984)、体外培养(Scheid OM，1991)以及改变外界生存环境(Meyer P，1994)等改变外源DNA甲基化程度。用农杆菌转化法转入外源基因，可避免多拷贝插入；或尽量选择完整单拷贝插入事件；构建表达载体时避免同源序列，其中包括启动子、结构基因及标记基因中的序列。另外，采用定点整合方式如同源重组或核骨架结合序列(MAR)等，可有效减少多拷贝插入、反式失活、共抑制现象以及染色体位置效应的发生。
本发明采用同源重组方法来克服转基因植物后代中出现的上述意外事件，并通过构建同源重组载体达到此目的。同源重组表达载体是指外源基因的表达载体中，含有一段核苷酸序列与受体细胞染色体组DNA中的某一段序列相同，当该表达载体进入受体细胞后这两段序列之间发生同源重组，外源基因整合到受体细胞染色体组中的特定部位，获得稳定表达。这一方法最大限度地保证外源基因以单拷贝的方式整合入受体细胞基因组，同时通过同源整合，也可以尽量避免外源基因的甲基化和染色体位置效应的干扰。
本发明采用的是小球藻硝酸还原酶基因作为同源序列，其原因有第一，小球藻中硝酸还原酶基因是活性表达的单拷贝基因。如果外源基因同源重组进硝酸还原酶基因位点就可以保证至少有一个拷贝的外源基因能够活性表达。第二，硝酸还原酶基因可以作为筛选标记基因来判断同源重组事件是否发生。因为同源重组事件发生后，硝酸还原酶基因被破坏，转基因藻不能利用硝酸盐，所以野生型小球藻能在以硝酸盐为唯一氮源的培养基上生长，硝酸还原酶缺陷型小球藻则不能。
另外，本发明采用三种不同的启动子(PGK，CaMV35S和Ubi)分别启动两个选择标记基因和目的基因，以求进一步避免外源基因之间发生重组而出现反式失活，导致基因不表达。
本发明构建的同源重组表达载体中含有三种选择标记基因。首先是由PGK启动子驱动的磷酸新霉素转移酶(neo)基因，用G418作选择压力。小球藻对多种抗生素都有耐受性，但对G418敏感，这是通过抗性初步筛选转基因小球藻的良好基因；其次是由CaMV35S启动子驱动的绿色萤光蛋白(GFP)酶基因，在长波紫外线照射下GFP发出绿色萤光，可在活体条件下对转化体进行确定；第三是硝酸还原酶基因缺陷型，由于该基因的缺失，转基因藻细胞不能在含硝酸盐的培养基上生长，只能利用氨态氮作唯一氮源，因此只需挑选只在含氯化氨的培养基上生长，不能在含硝酸根的培养基上生长的藻落即可。
本发明的另一个目的是提供一种能优质、高产、价廉地生产外源有用目的蛋白(如工程抗体)的小球藻株系。同时小球藻内的其它营养成分也还可以分类提取综合利用。
本发明的另一目的是提供一个能使外源基因定向的，单拷贝同源整合的、便于筛选的质粒载体，供低等真核藻类植物转化之用。
本发明提供了一种小球藻硝酸还原酶基因缺陷型稳定表达的转化体系的构建方法，该方法包括a.将小球藻硝酸还原酶基因和外源基因表达盒进行连接，使该外源基因表达盒的两端分别连有小球藻硝酸还原酶基因的5′端和3’端的序列，从而构建一种可以转化小球藻的同源重组表达载体；b.使用所构建的同源重组载体转化小球藻；c.筛选并繁殖发生了同源重组的小球藻。
在本发明的方法中，对于可以转化小球藻的骨架载体没有特别的限制，例如可以是pBCGP35ab，或者pBluescriptSK(+/-)。所述的外源基因可以是任何一种需要表达的外源基因，例如抗膀胱癌单链抗体的基因。
在本发明的方法中，为了便于转基因藻的筛选，所述的外源基因表达盒中最好还含有绿色荧光蛋白基因(GFP)和新霉素磷酸转移酶基因(neo)。
在本发明的方法中，所述的外源基因表达盒位于小球藻硝酸还原酶基因之中，其一端含有小球藻硝酸还原酶基因的3′端序列，另一端含有小球藻硝酸还原酶基因的5′端序列。所述的小球藻硝酸还原酶基因的5′端和3’端的序列长度最好分别为3.6kb和3.0kb。例如所述的小球藻硝酸还原酶基因的5′端和3’端的序列长度分别为SEQ ID NO1和SEQ IDNO2所示的序列。
在本发明的方法中，所述小球藻藻种可以为普通小球藻或者椭圆小球藻。
本发明还提供了一种小球藻硝酸还原酶基因缺陷型稳定表达的转化体系，其特征在于，在该小球藻的基因组中编码硝酸还原酶的基因中插入了一种外源基因表达盒。
在本发明的所述的转化体系中，所述的外源基因可以为抗膀胱癌单链抗体的基因。所述的外源基因表达盒中还可以含有绿色荧光蛋白基因(GFP)和新霉素磷酸转移酶基因(neo)。在外源基因表达盒插入位点的两侧小球藻硝酸还原酶基因片段的长度可以分别为3.6kb和3.0kb。例如，在外源基因表达盒插入位点的两侧小球藻硝酸还原酶基因的片段可以分别具有SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示的序列。
在本发明的所述的转化体系中，所述小球藻藻种可以为普通小球藻或者椭圆小球藻。
本发明还提供了一种用于构建小球藻硝酸还原酶基因缺陷型稳定表达的转化体系的同源重组载体，该载体含有外源基因表达盒，并且该外源基因表达盒的两端分别连有小球藻硝酸还原酶基因的5′端和3，端的序列。
本发明的同源重组载体可以是以BluescriptSK(+/-)为骨架构建的。所述的外源基因可以为抗膀胱癌单链抗体的基因。所述的外源基因表达盒中还可以含有绿色荧光蛋白基因(GFP)和新霉素磷酸转移酶基因(neo)。所述的小球藻硝酸还原酶基因的5′端和3’端的序列长度分别为3.6kb和3.0kb。例如，所述的小球藻硝酸还原酶基因的5′端和3’端的序列长度可以分别为SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示的序列。
因此，本发明提供了含硝酸还原酶基因同源序列片段和由PGK-NEO和CaMV35S-GFP作为标记基因的同源重组质粒pBCG35S，该质粒中可插入任何目的基因，在转入小球藻细胞后获得硝酸还原酶基因缺陷型同源重组转化体。
本发明提供了已经在上述质粒中插入工程抗体基因(实例中用抗膀胱癌单链抗体基因)的质粒pBCG35Sab，该目的基因是在强有力的Ubiquitin启动子驱动之下表达的。
本发明还提供了被pBCG35Sab转化的藻株，该藻株可高效的生产出有抗原结合活性的工程抗体，实例中为抗膀胱癌单链抗体。
图2.质粒pBCGP的物理图。
图3.硝酸还原酶基因(NR)基因5’端3.6kb和3’端3.0kb片段引物和接头。
图4.扩增硝酸还原酶(NR)基因片段的电泳图。
图5.质粒pBCGP3的物理图。
图6.质粒pBCGP35的物理图。
图7.质粒pBP35的物理图。
图8.质粒pBCGP35ab的物理图。
图9.小球藻生长曲线图。
图10.转基因小球藻中的GFP在荧光显微镜的紫外线激发下的表达(细胞中黄色斑点)。
图11.转基因小球藻在不同氮源培养基上的生长状况。
图12.DNA斑点杂交结果。
图13.转基因小球藻可溶性蛋白质SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
实施例(一)硝酸还原酶基因缺陷型同源重组质粒的构建以pBluescriptSK(+/-)为骨架质粒，构建一个内含不同启动子驱动、转录方向不同的抗膀胱癌单链抗体(Anti-bladder carcinoma scFv)基因、绿色荧光蛋白基因(GFP)和新霉素磷酸转移酶基因(neo)的表达质粒。在这三个基因的两側分别是3.6kb、3.0kb、的小球藻硝酸还原酶基因(NR)的5`端和3`端序列的同源重组质粒。
根据质粒pBluescriptSK(+/-)上的酶切位点，不同基因的插入位点如下在该质粒的HindIII和EcoRI之间插入绿色荧光蛋白基因(GFP)，在EcoRI和SmaI之间插入新霉素磷酸转移霉基因(neo)，以两端相同的黏末端HindIII插入抗膀胱癌单链抗体基因，在HindIII和SalI之间，以及SmaI间连接上硝酸还原酶基因(NR)片段。
硝酸还原酶基因缺陷型同源重组质粒的构建程序如下1.CaMV35S-mGFP4片段插入质粒pBluescriptSK(+/-)质粒pBIN35S-mGFP4中载有绿色荧光蛋白基因(约735bp)，酶切图谱显示，它位于XbalI和SacI位点之间，5`端上游为35S启动子(约800bp)驱动，3`端下游为NOS终止子(约260bp)。
从pBIN35S-mGFP4中用HindIII、EcoRI切下CaMV 35S-mGFP4片段，并以其粘末端插入质粒pBluescriptSK(+/-)，筛选得到重组子pBCG。HindIII、EcoRI双酶切质粒pBCG，得到一条长约1.8kb的带，证明插入成功(图1)。
2.PGK-neo片段的插入质粒pPNT中PGK-neo片段与质粒pBCG缺乏合适的匹配位点，无法直接插入。因此首先用SmaI、SacI从质粒pPNT切下PGK-neo片段，连入质粒pUC19，建成质粒pUPN。然后利用质粒pUC19多克隆位点中的EcoRI，以EcoRI、SmaI双酶切切下PGK-neo片段再插入质粒pBCG中，筛选得到重组子pBCGP(图2)。
3.硝酸还原酶(NR)基因5’端3.6kb和3’端3.0kb片段的扩增和插入为了扩增硝酸还原酶(NR)基因5’端3.6kb和3’端3.0kb两个片段，人工合成两对引物(图3)，以小球藻总DNA为模板，进行PCR扩增(图4)。随后，将NR基因3’端3.0kb片段以平端连入质粒pBCGP。筛选时，用MluI位点的有无来判断其是否已经插入，用KpnI单酶切后各条带的大小来判断其插入方向。当其插入方向与CaMV 35S-mGFP4同向时，酶切后各带大小分别约为3.0kb和6.6kb。当其插入方向与CaMV 35S-mGFP4反向时，酶切后各带大小分别约为3.6kb和6.0kb。选择插入方向与CaMV35S-mGFP4同向的重组子，定名为pBCGP3(图5)。接着，将NR基因5’端3.6kb片段以两匹配粘端HindIII和SalI连入质粒pBCGP3，筛选得到重组子pBCGP35并酶切鉴定(图6)。
4.Ubi-scFv片段插入质粒pBCGP35Ubiquitin启动子(Ubi)是真核生物中表达非常强的启动子，用它来驱动单链抗体将会使其得到大量的表达。本发明用质粒pUbi-GUS作Ubiquitin启动子的供体，用BamH1酶切该质粒去除GUS基因的编码序列(约2.0kb)后，回收其大片段自连产物形成的质粒pUB。再从抗膀胱癌单链抗体(anti-bladder scFv)的载体质粒pWAI80上，用NotI、EcoRI双酶切下的anti-bladder scFv片段，与一个带有五个串联组氨酸密码子(His)5和终止密码子的小分子接头(图4)相连，然后，用T4 DNA Polymerase将该连接片段处理为平端，并以平端方式插入pUB中Ubiquitin启动子的下游，经转化E.coli筛选得到重组子pBP35。正确连接的重组子的鉴定，是根据在靠近Ubi启动子处的BamH1位点缺失，而靠近35S PolyA的BamHI位点保留而得。因此若scFv插入方向正确，用EcoRI，BamHI分别单酶切重组子，可得到各约1.2kb和0.2kb的小带。如果scFv基因的插入方向相反，用EcoRI和BamHI分别单酶切重组子，会得到各约0.5kb和0.2kb小带。电泳结果显示，scFv基因已以正确的方式插入Ubiquitin启动子的下游(图7)。接着，用HindIII酶切下质粒pBP35中的Ubiquitin启动子+anti-bladder scFv+(His)5+终止密码子片段(Ubi-scFv)，以HindIII粘端插入质粒pBCGP35，EcoRI单酶切可鉴定重组子的插入方向若Ubi-scFv片段插入方向与CaMV 35S-mGFP4片段反向，EcoRI单酶切重组子将得到1.2kb、3.1kb和11.9kb三条带；若Ubi-scFv片段插入方向与CaMV 35S-mGFP4片段同向，EcoRI单酶切重组子将得到1.2kb、1.6kb和13.4kb三条带。选择其插入方向与GFP基因启动方向相反的重组子为最终质粒载体pBCGP35ab，图8显示其电泳结果。
(二).Ubi-scFv的硝酸还原酶基因缺陷型同源重组质粒在普通小球藻中的表达1.用作受体细胞的普通小球藻的选取用挑选单克隆藻落的方法，选出生长旺盛的藻落作受体藻株，转化前的小球藻培养于以硝酸盐为唯一氮源的培养基(MgSO40.20g/l；KH2PO40.67g/l；K2HPO43.50g/l；Na3C6H5O7·H2O 1.00g/l；1mol/l KNO320ml/l；微量元素母液10ml/l；50％Glucose 20ml/l；pH7.4。微量元素母液Fe(NO3)3·9H2O1000mg/l；FeSO4·7H2O 500mg/l；H3BO3300mg/l；MnSO4·H2O 150mg/l；ZnSO4·7H2O 22mg/l；CuSO4·5H2O 8mg/l；CoCl2·6H2O 2mg/l；(NH4)6Mo7O244mg/l)中，以保证被转化前小球藻是NR基因野生型。选取对数生长期的小球藻用于基因枪转化。从生长曲线(图9)看，生长50-60hr的小球藻正处于旺盛的对数生长期，适于转化。转化后的小球藻培养于以氨盐为唯一氮源的培养基上(即在上述培养基中用1mol/l NH4Cl取代1mol/l KNO3；用FeCl3取代Fe(NO3)3·9H2O)中，以确保发生同源重组的转基因小球藻能够存活下来。
2.基因枪转化小球藻1).受体材料的制备轰击前2-3hr，收集对数生长期小球藻藻液2ml(密度为2×108个/ml)，涂布于培养板的中心(直径3cm)备用。
2).微弹(DNA-金粉悬液)的制备(参照Becker等的方法)称取直径1μm的60mg金粉于1.5ml的离心管中，加入lml无水乙醇，涡旋振荡1-2min，重复振荡后于10,000rpm离心1min。去上清，加入1ml dH2O充分混匀后再离心，去上清。重复上述步骤3次，将金粉悬浮于1ml dH2O中，4℃或室温保存。
取上述金粉50μl(用前需涡旋振荡)，加入10μl质粒DNA(0.5μg/μl)溶液。在3min内依次逐滴加入2.5mol/l的CaCl2·2H2O溶液(经高压灭菌)50μl以及0.1mol/l的亚精胺溶液(经抽滤灭菌，宜现用现配，有效期1月)20μl，边加边涡旋振荡。加入300μl无水乙醇，涡旋振荡后静置一会儿，10,000rpm离心10see，弃上清液。重新悬浮于100μl的无水乙醇中。可供5-10枪之用(10μl/枪)。
3.)基因枪轰击小球藻细胞在无菌条件下，用70％乙醇对基因枪的表面及样品室进行灭菌，同时将阻挡网、压力膜(采用1100psi)、微弹载体及其固定器、固定工具用70％乙醇浸泡20min，置超净工作台内晾干备用。将压力膜固定盖、微弹载体发射装置用70％乙醇表面灭菌、吹干备用。
使用固定装置将微弹载体安装在固定环上，确保其边缘与固定环四周紧密接触，吸取10μl充分悬浮的微弹DNA悬液均匀涂于微弹载体中央，干燥1min左右(现用现配)。
安装好可裂圆片、微弹载体后，将装有受体材料的培养皿放置于样品室支架上，安放于样品室中合适的位置，关好样品室。打开氦气瓶阀们，使压力稳定在比可裂圆片的耐受压(1100psi)高约200psi的状态。打开基因枪电源开关及真空泵开关，待真空度达到27英寸汞柱时，关闭真空泵阀门并启动轰击开关，使氦气进入压力室，待氦气压表升至可裂圆片最大耐受压时圆片会破裂，此时应立即松开轰击开关，将真空开关打至排气档，待真空度降为零时，即可取出样品。
3.转化后小球藻的筛选和克隆化经基因枪轰击过的小球藻细胞孵育24hr后，铺于含抗菌素G418 60μg/ml的以氨态氮作唯一氮源的培养基上筛选。15天后，阴性对照细胞死亡数达50％以上，并且与日俱增；转化小球藻的死亡数相对较少。挑取抗性小球藻单克隆划线于上述相同培养基上，反复多次，以获得来源于单个细胞的抗性藻落。为了进一步纯化，本发明对初筛的抗性藻落继续用两种方法进行克隆化。一种同初筛一样反复挑抗性单克隆藻落划线筛选；另一种方法是无限稀释法。即先用含抗菌素的上述相同液体培养基将抗性藻落的细胞密度调至大约10个/ml，然后取100μl藻液加于96孔板的小孔中。理论上每个小孔中只有一个细胞，实际情况是大多数孔中含一个细胞，少数孔中没有或含两个细胞。96孔板置于35℃下培养，约5天后可见一薄层绿色小球藻细胞铺于孔底部，而获得纯系。
4.转基因小球藻的鉴定1.)GFP基因在转化小球藻中的表达绿色荧光蛋白的特性是，在紫外线照射下发出绿色荧光。根据此特点，本鉴定在荧光显微镜下进行。在紫外线照射下，野生型小球藻呈现出鲜亮的红色，这是叶绿体在紫外线作用下的表现，转基因小球藻中GFP发绿色或黄绿色，在叶绿体的红色背景下，显现出黄色斑点(图10)，说明绿色荧光蛋白基因已转入小球藻。
2.)营养缺陷型表达测定成功转化的小球藻由于含有上述质粒pBCGP35，是不能在以硝酸盐为唯一氮源的培养基上生长的，因此，可以用不同氮源的培养板上的生长状况对其进行鉴别。图11显示，大多数藻落能够在以硝酸盐为唯一氮源的培养基上生长的，只有L3克隆的生长受到抑制，说明其为硝酸还原酶基因缺陷型。
3.)斑点杂交鉴定将各单克隆藻落的总DNA点在尼龙膜上，以抗膀胱癌单链抗体基因片段为模板制备探针进行分子杂交。图12显示，质粒pBCGP35ab的DNA(阳性对照)杂交信号极强，野生型小球藻DNA(阴性对照)无杂交信号，若干转化单克隆藻落有强的杂交信号，其中包括A14、B9、L3等克隆。
4).蛋白质SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳从上述单克隆藻落中提取蛋白，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。结果显示(图13)在分子量为30kDa的附近，待测藻落中A14、B9和L3有特异条带，与单链抗体分子量的大小相吻合。经扫描测定，表达量约为小球藻可溶性蛋白的1.1％。
(三)结论本发明构建的工程抗体基因小球藻同源重组质粒载体pBCGP35ab及其小球藻的转化体系，在普通小球藻中高效表达了该单链抗体(Anti-bladder scFv)，其表达量可占小球藻可溶性蛋白的1.1％。这一系统可用于单链抗体的生产。
序列表<110>中国科学院遗传研究所北京安波特基因工程技术有限公司<120>小球藻硝酸还原酶基因缺陷型稳定表达的转化体系的构建方法以及所构建的转化体系<130>12001275<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>3588<212>DNA<213>Chlorella vulgaris<400>1atggctacag cacagaggca tcagcagcat cgccgcaagc acccgccgcc gagtgcggca 60aggcgccggt ggaggagccg ctgcagcccg gcactgacga gtacaagctg cacctgcccg120tcaccgaagt gctggacgca gacaagggca ccaaggacga gtggatcccc cggtgagctc180tccggctgcg gctcaagact gtgagccagg cggccggcgg ctgggctgcg gctggctccc240ccgtgcacct ctgctcatgc ctttctgcgt gggtgcagca gctctgccgc tgtgtgtcgg300cccggagatt gtgcatcttt gcagcagatg cgttcctcct ctgcaccttc ctggcccctc360acctgccggc gctgcaaaca cgtcgcacct ccttgcatgg ctgcacagcc tgcgtcgcct420cttgccaccc aacgcctccc cctgctgccc tgccccctgc aggcacccag accttgtgcg480gctcacaggg cggcatccct tcaacgtcga gcccatcccg tcccgcctct ttgagtcgta540catcacacca ccctccctgc actatgtccg caaccacgga gctgtaccgc agattaagtg600ggaggagcac cgcctggcag tcaacggtga gggggcgtgt atggctagct catagccagg660tagcgtgtct agctggctag ctatcgtgtc cagctagcct gcaagtgtac atggctagca720tggctgggcg 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gccagccgca tcagcatgat tgctggcggc acaggcatca 2280cccccatgct ccaggtgaac ccttgaattg ctcgctgttg acgccgctgg tttgcacccg 2340ccatgtggcc ggcggcttcc tccagggctt gcctgtggcc caggcccatg cacatgcacc 2400acaatctcca ctgctgcagc tgccgcagcc tgcttattgt gctcagttgt ccctgttcca 2460tgtacccggc ccctctgccc atcctgctgc tttcctcctt tcctcgtttc tttcttcccg 2520ccaggtcatt aaagcggtgc tgaaggaccc caaagacaca acgcagctct ccctgctgta 2580tgccaatgtg tcaccggacg acatcctgct gcgagaagag ctggacgcac tggcagcgaa 2640gcacgacaac ttcagcgtgt ggtacacagg tgcgctgtgc tgcgcagtag catcagctgg 2700cagctggtgg gctgggccag gcgggaaggg ctggatgcag tgcgtgcagg gttgctagat 2760gggaggcagg gagacttggg atgctgggac gtgcaaggga ctgtcaggga aaatgctgcg 2820cgttgcccct gcacaaacgc actgtggcgt gtggcgccgc ttctctctgc tctcgtcccc 2880ttctcgccat gctcccacac ccctgccttg gtttgtggtg cagttgacaa ggcggatgag 2940gggtggccgt tcagcaccgg gttcatcaat g 297权利要求
1.一种小球藻硝酸还原酶基因缺陷型稳定表达的转化体系的构建方法，包括a.将小球藻硝酸还原酶基因和外源基因表达盒进行连接，使该外源基因表达盒的两端分别连有小球藻硝酸还原酶基因的5′端和3’端的序列，从而构建一种可以转化小球藻的同源重组表达载体；b.使用所构建的小球藻硝酸还原酶基因同源重组表达载体转化小球藻；c.筛选并繁殖发生了同源重组的小球藻。
2.按照权利要求1所述的方法，其中，所述的可转化小球藻的载体为pBCGP35，或者pBCGP35ab。
3.按照权利要求1所述的方法，其中，所述的外源基因为抗膀胱癌单链抗体的基因。
4.按照权利要求1所述的方法，其中，所述的外源基因表达盒中还含有绿色荧光蛋白基因(GFP)和新霉素磷酸转移酶基因(neo)。
5.按照权利要求1所述的方法，其中，所述的小球藻硝酸还原酶基因的5′端和3’端的序列长度分别为3.6kb和3.0kb。
6.按照权利要求1所述的方法，其中，所述的小球藻硝酸还原酶基因的5′端和3’端的序列分别为SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示的序列。
7.按照权利要求1所述的方法，其中，所述小球藻藻种为普通小球藻或者椭圆小球藻。
8.一种小球藻硝酸还原酶基因缺陷型稳定表达的转化体系，其特征在于，在该小球藻的基因组中编码硝酸还原酶的基因中插入了一种外源基因表达盒。
9.按照权利要求8所述的转化体系，其中，所述的外源基因为抗膀胱癌单链抗体的基因。
10.按照权利要求8所述的转化体系，其中，所述的外源基因表达盒中还含有绿色荧光蛋白基因(GFP)和新霉素磷酸转移酶基因(neo)。
11.按照权利要求8所述的转化体系，其中，在外源基因表达盒插入位点的两侧小球藻硝酸还原酶基因片段的长度分别为3.6kb和3.0kb。
12.按照权利要求8所述的转化体系，其中，在外源基因表达盒插入位点的两侧小球藻硝酸还原酶基因的片段分别具有SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示的序列。
13.按照权利要求8所述的转化体系，其中，所述小球藻藻种为普通小球藻或者椭圆小球藻。
14.一种用于构建小球藻硝酸还原酶基因缺陷型稳定表达的转化体系的同源重组表达载体，该载体含有外源基因表达盒，并且该外源基因表达盒的两端分别连有小球藻硝酸还原酶基因的5′端和3’端的序列。
15.按照权利要求14所述的同源重组表达载体，其中，该载体是以BluescriptSK(+/-)为骨架构建的。
16.按照权利要求14所述的同源重组表达载体，其中，所述的外源基因为抗膀胱癌单链抗体的基因。
17.按照权利要求14所述的同源重组表达载体，其中，所述的外源基因表达盒中还含有绿色荧光蛋白基因(GFP)和新霉素磷酸转移酶基因(neo)。
18.按照权利要求14所述的同源重组表达载体，其中，所述的小球藻硝酸还原酶基因的5′端和3’端的序列长度分别为3.6kb和3.0kb。
19.按照权利要求14所述的同源重组表达载体，其中，所述的小球藻硝酸还原酶基因的5′端和3’端的序列长度分别为SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示的序列。
20.按照权利要求14所述的表达任何外源基因的同源重组表达载体，它是pBCGP35。
21.按照权利要求14所述的表达抗膀胱癌单链抗体基因的同源重组表达载体，它是pBCGP35ab。
全文摘要
本发明提供了一种小球藻硝酸还原酶基因缺陷型稳定表达的转化体系的构建方法，包括将小球藻硝酸还原酶基因和外源基因表达盒进行连接，使该外源基因表达盒的两端分别连有小球藻硝酸还原酶基因的5′端和3’端的序列，从而构建一种可以转化小球藻的同源重组表达载体的步骤；本发明还提供了一种小球藻硝酸还原酶基因缺陷型稳定表达的转化体系和一种用于构建小球藻硝酸还原酶基因缺陷型稳定表达的转化体系的同源重组表达载体。
文档编号C12N15/63GK1414104SQ0113681
公开日2003年4月30日 申请日期2001年10月24日 优先权日2001年10月24日
发明者曾君祉, 熊英, 周志勇, 尹长城, 刘晶, 黄华樑 申请人:中国科学院遗传研究所, 北京安波特基因工程技术有限公司