一种硝酸还原酶测定试剂盒与应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物制剂领域，特别是一种硝酸还原酶测定试剂盒与应用。
【背景技术】
[0002] 硝酸还原酶是植物体内硝态氮代谢的第一个关键酶，且硝酸还原酶是一种诱导 酶，即在硝态氮(N03^)存在条件下能够诱导产生酶活性。植物从±壤中吸收的硝态氮首先需 要经过硝酸还原酶的催化而形成亚硝态氮，亚硝态氮再经过亚硝酸还原酶作用下转化为 N也+，然后N化+在谷胺酷胺合成酶作用下形成氨基酸，进而完成蛋白质的合成。在植物生长 发育过程中，如果硝态氮代谢的第一个关键酶硝酸还原酶活性受到外界环境的影响则植物 体内氨基酸和蛋白质的合成就会受到阻碍，从而造成对植物生长发育的严重不利影响。因 此，对植物体内硝酸还原酶活性的测定，能正确反应出植物对氮素营养的吸收与代谢能力， 是正确评价外界环境对植物氮代谢影响的一种有效方法。目前已有的关于硝酸还原酶活性 的测定方法可W归纳为两种：
[000；3] -、活体法；
[0004]运种方法是在反应液中加入硝态氮(M)3-)，通过测定硝态氮(M)3-)被植物体内硝 酸还原酶还原成亚硝态氮的量来反应酶活性的高低。但由于硝酸还原酶是一种诱导酶，其 活性会受到反应液中加入硝态氮(N03^)的诱导而提高，因此运种"活体法"测定硝酸还原酶 的活性不能真实反应植物体内硝酸还原酶活性，只是作为一种相对比较而加 W应用。
[000引二、离体法：
[0006] 运是一种目前正在应用的测定植物体内硝酸还原酶活性真实值的方法。"离体法" 测定植物体内硝酸还原酶活性真实值方法具体步骤是：
[0007] 1、反应液配制：
[000引（1)利用憐酸二氨钟和憐酸氨二钟配制0.1mol/L pH7.5的憐酸缓冲液；
[0009] (2)配制O.lmol/L KN03憐酸缓冲液；
[0010] (3)配制NA畑2溶液：称取2.0mg NA畑2溶于1ml O.lmol/L的憐酸缓冲液中；
[0011] (4)配制提取缓冲液:25mmo 1 /L的憐酸缓冲液、5mmo 1 /L半脫氨酸、5mmo 1 /L抓TA- Na2混合液。
[0012] 2、测定方法流程:取实验材料洗净剪碎，放在研鉢中置低溫冰箱冷冻30min。取出 在冰浴中加少量石英砂和提取缓冲液。研磨为匀浆，低溫离屯、5min(400化/min)。上清液即 为粗酶提取液。上述操作尽量在冰浴中进行；
[001引 3、比色:取粗酶提取液，加入KN03憐酸缓冲液和NA畑2溶液。在30°C下保溫30min。保 溫后立即加1血对-氨基苯横酸溶液终止反应，加1血α-糞胺溶液，显色20min，在台式离屯、机 上离屯、lOmin，取上清液在分光光度计上测波长540nm处的光密度值。
[0014]离体法具有的缺点是：（1)需要配制的反应液多（共4种），所需化学药品多，价格 贵；（2)测定方法流程复杂、人为造成误差增大。首先需要低溫冰冻研鉢研磨和低溫离屯、，费 工、费时。从研鉢中转移至离屯、管离屯、时会造成研磨液的损失造成误差；（3)比色时仍需要 进一步低溫离屯、，使测定时间加长，造成人为误差加大；（4)方法复杂，难W实现快速、多组 测定植物体内硝酸还原酶的真实活性。
【发明内容】
[0015] 本发明的目的在于提供一种硝酸还原酶测定试剂盒与应用，建立一种能够简便、 快速测定植物体内硝酸还原酶真实活性的方法在植物氮代谢研究领域具有重要作用。
[0016] 为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明公开了一种硝酸还原酶测定试 剂盒，试剂盒包括了 W下液体：
[0017] A液：用1 % (V/V)的1-丙醇1L作溶剂溶解31.2g Na出P〇4配制0.2M Na出P〇4溶液；
[001引 B液：用1 % (V/V)的1-丙醇1L作溶剂溶解71.6g Na2HP04配成0.2M Na2HP04溶液；
[0019] C液：1 % (W/V)的对-氨基苯横酸溶液；
[0020] 的夜:0.2 % (W/V)的α-糞胺溶液。
[0021] 本发明还公开了一种硝酸还原酶测定试剂盒的应用，应用具体为W下步骤：
[0022] 步骤一:取A液16mL和的夜84mL置于试管中均匀混合，配成ΡΗ7.5的提取液；
[0023] 步骤二:取植物样品0.3-0.5克左右剪碎装入试管，记录样品重量。加入步骤一提 取液6mL，抽真空1-2分钟；
[0024] 步骤Ξ:从步骤二试管中取出ImL溶液放入洁净试管中。把装有样品的反应试管吹 氮气30秒后用锡纸封住试管口，将该试管放入30-35°C水浴中保溫1小时，取反应液ImL放入 洁净试管；
[0025] 步骤四：向步骤Ξ装有样品的试管中加入ImL提取液，再放入30-35°C水浴中保溫1 小时后，取反应液ImL放入洁净试管；
[0026] 步骤五：向步骤四装有样品的试管中加入ImL提取液，放入30-35°C水浴中保溫1小 时，取反应液ImL放入洁净试管；
[0027] 步骤六：向上述获得的4支装有ImL反应液的试管中分别加入去离子水4mL，分别加 入C液ImL和D液ImL，用提取液ImL加入4mL去离子水后分别加入C液ImL和D液ImL作空白对 照；
[002引步骤屯:分光光度计54化m处波长处测定样品光密度值，取同一时间的最佳光密度 值计算硝酸还原酶活性，单位为:μΜ N02-g-中W h-i。
[0029] 本发明具有W下有益效果：
[0030] 1.本发明提取液配制简单(仅巧巾），所需化学药品少，成本低;测定过程无需研磨、 离屯、，且整个实验过程中无硝态氮(N03-)的引入，不会诱导硝酸还原酶活性的提高，因而误 差小，真正实现了对植物体内硝酸还原酶真实值的测定;方法简便，可W实现快速、多组测 定植物体内硝酸还原酶的真实活性。
【具体实施方式】
[0031] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，W下结合实施例，对本发明 进行进一步详细说明。
[0032] 实施例1
[0033] 本发明公开了一种硝酸还原酶测定试剂盒，试剂盒包括了 W下液体：
[0034] A液：用1 % (V/V)的1-丙醇IL作溶剂溶解31.2g Na出P〇4配制0.2M