专利名称：一种检测HMG-CoA还原酶活性的改良分光光度法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种测定HMG-CoA还原酶活性的改良分光光度法，同时还涉及基于该方法建立的一种HMG-CoA还原酶抑制剂检测系统在降血脂药物筛选中的应用。
背景技术：
已知甲羟戊酸通过系列的反应可最终生成胆固醇，高胆固醇能诱发动脉粥样硬化，导致高血压、冠心病、血栓、脑溢血等疾病，有效抑制胆固醇合成的药物能降低这些疾病的发生。3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶 A(3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzymeA， HMG-CoA)还原酶是甲羟戊酸通过系列反应合成胆固醇的限速酶，其活性可在蛋白合成、降解及磷酸化等水平进行调节。虽然检测各种调节机制中HMG-CoA还原酶mRNA及蛋白水平表达的方法学均已建立，但评价蛋白酶功能最终、最有效的方法仍应是酶活性的检测。已知 HMG-CoA还原酶抑制剂能有效降低胆固醇生物合成，是一类新型的降脂药，也是临床防治动脉粥样硬化的首选药，筛选和研发新的HMG-CoA还原酶抑制剂一直是该领域的热点问题。经典的检测HMG-CoA还原酶活性的方法为放射性同位素法，其原理为14C标记 HMG-CoA，体系反应完成后产物为14C-甲羟戊酸，再将其转变为14C-甲羟戊酸内酯，再通过层析的方法分离14C-甲羟戊酸内酯，检测其放射性，与HMG-CoA还原酶活性成正比(Kim HK, Jeong TS, Lee MK, et al. Lipid-Iowering efficacy of hesperetin metabolites inhigh-cholesterol fed rats. Clinica Chimica Acta. 2003 ；327 129-37) 但因其使用放射性活性物质，操作繁琐，需要控制放射性物质的污染，而且14C标记的HMG-CoA和甲羟戊酸价钱昂贵，筛选成本高，因此给该方法的推广应用带来困难。传统的HMG-CoA 还原酶活性检测分光光度法(Ness GC, Spindler CD, Moffler ΜΗ. Purification of3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase from rat liver.Arch Biochem Biophys. 1979 ；197 :493_9)的原理为检测反应中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的消耗量反映酶活性，但其特异性不高，且背景(本底)反应明显。为了减少背景反应，需通过后继的系列纯化来提高HMG-CoA还原酶纯度，但带来步骤繁多、酶得率较低等问题，因此该方法的应用较少。目前国内外尚无通过优化分光光度法中多环节(如制备可溶性HMG-CoA 还原酶、反应体系PH值、酶蛋白量、底物浓度、预温浴时间和反应时间等)进行HMG-CoA还原酶活性的测定，更无基于该方法建立的HMG-CoA还原酶抑制剂筛选系统。
发明内容
本发明目的是在于提供了一种检测HMG-CoA还原酶活性的改良分光光度法，通过多次勻浆离心、优化预温浴及反应时间、反应缓冲液PH值、蛋白浓度及底物浓度等方法，获得高HMG-CoA还原酶活性的肝微粒体，大大提高了分光光度法的特异性及灵敏性。本发明的另一个目的是在于提供了一种基于改良分光光度法的HMG-CoA还原酶抑制剂检测体系在筛选降血脂药物中的应用。与经典的放射性同位素法相比显著降低了筛选HMG-CoA还原酶抑制剂的成本，避免了使用放射性物质，可应用于系列降血脂药物的筛选。为了实现上述目的，本发明采用了以下技术措施一种检测HMG-CoA还原酶活性的改良分光光度法，其步骤是A、将新鲜肝脏组织(市场购置)以1 3(w/v)加入勻浆缓冲液A(100mM蔗糖、 50mM KCl、40mM K2HPO4,30mM EDTA，pH 7. 2)，勻菜，常温下 12，OOOXg离心两次，每次 15min， 取上清100，OOOXg离心60min，沉淀用勻浆缓冲液重悬后，100, OOOXg再次离心60min，沉淀即为肝微粒体；B、将肝微粒体用缓冲液B (缓冲液A加IOmM 二硫苏糖醇，pH 7. 2)重悬，再加入等体积含50% (ν/ν)甘油的37°C缓冲液B，手动勻浆，37°C温浴60min后，再以缓冲液B稀释 3倍，混勻，最后25°C 100，000 X g离心60min取上清，含有可溶性HMG-CoA还原酶的肝微粒体蛋白；C、根据蛋白测定试剂盒检测步骤⑶得到肝微粒体的蛋白含量，用缓冲液B稀释蛋白浓度至lmg/ml，得到了蛋白浓度已知的肝微粒体蛋白；D、将步骤(C)得到的肝微粒体蛋白加入优化的反应体系(pH 7.0)，包括 NADPH100 μ mol/L、HMG-CoA 50 μ mol/L、蛋白浓度为 200 μ g/ml,和缓冲液 C(0. 2MKC1、 0. 16MK2HP04、4mMEDTA和IOmM 二硫苏糖醇)，反应总体积为1ml。先进行37°C预温浴20min， 随后加入底物HMG-CoA以启动酶催化反应，反应时间为60min，用紫外分光光度计检测OD34tl 值的变化，根据以下公式得到HMG-CoA还原酶活性。酶活性[nmol/(mg.min)]=(测定管 Δ OD340-空白对照 Δ OD340) X 1000/ (6. 22X0. 2X60)根据该公式得到的HMG-CoA还原酶活性，可用于计算抑制剂的抑制率等参数，用于比较抑制剂的抑制活性。一种基于改良分光光度法的HMG-CoA还原酶抑制剂检测体系在筛选降血脂药物中的应用，其步骤是Α、按一种检测HMG-CoA还原酶活性的改良分光光度法制备步骤所得的含可溶性 HMG-CoA还原酶活性的肝微粒体；B、在上述HMG-CoA还原酶反应体系中加入10 μ 1不同浓度的受试物(HMG-CoA还原酶抑制剂)，预温浴20min后，加入HMG-CoA启动反应。C、用紫外分光光度计测定60min内反应体系OD34tl值的变化，并根据以下公式计算酶活性抑制率和半数抑制浓度(IC5tl)值。根据该公式得到的酶活性抑制率和IC5tl值可用以反映和比较药物对HMG-CoA还原酶的抑制活性大小。酶抑制率(％ )=(对照管酶活性_抑制剂管酶活性)/对照管酶活性X 100与现有的HMG-CoA还原酶活性测定方法和HMG-CoA还原酶抑制剂筛选系统相比， 本发明筛选系统具有体系优化、安全价廉、批量筛选、结论可信等特点，可用来准确、有效的筛选具有抑制HMG-CoA还原酶活性的药物，为开发新的降脂药物提供了简便、快速的检测方法。其具体是(1)体系优化本发明通过对肝微粒体的多次离心纯化，获得高活性的HMG-CoA还原酶源，无需再进行后继的蛋白纯化过程；同时，本发明对反应的多环节进行了优化(预温
4浴及反应时间、反应缓冲液PH值、蛋白浓度及底物浓度)，使分光光度法的特异性明显增高，结果更为可靠；(2)安全价廉与经典的放射性同位素法相比，无环境污染，对操作者无放射性伤害，且研究成本极低；(3)批量筛选所建的筛选系统操作简单、方便易行，可用于大批量药物的短期内筛选；(4)结论可信用三种已知的HMG-CoA还原酶抑制剂进行方法学验证，同时也与经典的放射性同位素法进行了比较，其结果基本一致。证明基于改良分光光度法的HMG-CoA 还原酶抑制剂检测系统完全可以用于系列降血脂新药的筛选。
图1为一种不同预温浴时间HMG-CoA还原酶活性的影响示意2.为一种不同反应体系pH值对HMG-CoA还原酶活性的影响示意3.为一种不同反应时间对HMG-CoA还原酶活性的影响示意4.为一种不同底物浓度对HMG-CoA还原酶活性的影响示意5.为一种不同微粒体蛋白量对HMG-CoA还原酶活性的影响示意6.为一种本发明方法测定普伐他汀、氟伐他汀和瑞舒伐他汀的HMG-CoA还原酶抑制活性示意图A 普伐他汀；B 氟伐他汀；C 瑞舒伐他汀.图7.为一种放射性同位素法测定普伐他汀、氟伐他汀和瑞舒伐他汀的HMG-CoA还原酶抑制活性示意图A 普伐他汀；B 氟伐他汀；C 瑞舒伐他汀.图8.为一种本发明方法测定银杏提取物GBE50的HMG-CoA还原酶抑制活性示意图。
具体实施例方式下面通过具体的实验实例，进一步阐述本发明中测定HMG-CoA还原酶活性的改良分光光度法，和基于该方法建立的一种HMG-CoA还原酶抑制剂检测系统，及其在降血脂药物筛选中的应用。实施例1 改良分光光度法测定HMG-CoA还原酶活性一种检测HMG-CoA还原酶活性的改良分光光度法，其步骤是A、将新鲜肝脏组织(市场购置)以1 3(w/v)加入勻浆缓冲液A(100mM蔗糖、 50mM KCl、40mM K2HPO4,30mM EDTA，pH 7. 2)，勻菜，常温下 12，OOOXg离心两次，每次 15min， 取上清100，OOOXg离心60min，沉淀用勻浆缓冲液重悬后，100, OOOXg再次离心60min，沉淀即为肝微粒体；B、将肝微粒体用缓冲液B (缓冲液A加IOmM 二硫苏糖醇，pH 7. 2)重悬，再加入等体积含50% (ν/ν)甘油的37°C缓冲液B，手动勻浆，37°C温浴60min后，再以缓冲液B稀释 3倍，混勻，最后25°C 100，000 X g离心60min取上清，含有可溶性HMG-CoA还原酶的肝微粒体蛋白；
C、根据蛋白测定试剂盒检测步骤⑶得到肝微粒体的蛋白含量，用缓冲液B稀释蛋白浓度至lmg/ml，得到了蛋白浓度已知的肝微粒体蛋白；D、将步骤C得到的HMG-CoA还原酶加入反应体系[含NADPH 100 μ mo 1/L,HMG-CoA 50口11101/1、蛋白浓度为20(^ g/ml 和缓冲液 C(0. 2M KCl、0. 16MK2HP04、4mM EDTA 禾口 IOmM 二硫苏糖醇)]，反应总体积为1ml，在加入HMG-CoA反应之前，先进行37°C预温浴20min，随后加入HMG-CoA启动反应60min，用紫外分光光度计检测OD34tl变化。结果见图1_5。基于该检测方法建立HMG-CoA还原酶抑制剂检测体系，计算酶活性抑制率和半数抑制浓度(IC5tl),可用于筛选降血脂药物。实施例2 本发明的检测系统对普伐他汀、氟伐他汀和瑞舒伐他汀抑制HMG-CoA还原酶活性的确证。一种基于改良分光光度法的HMG-CoA还原酶抑制剂检测体系在降血脂药物的筛选中的应用，其步骤是A、按一种检测HMG-CoA还原酶活性的改良分光光度法制备步骤所得的含可溶性 HMG-CoA还原酶活性的肝微粒体；B、建立HMG-CoA还原酶抑制剂检测体系，包括HMG-CoA还原酶(蛋白量200 μ g)、 NADPH (100 μ Μ)、HMG-CoA (50 μ Μ)和 buffer B (0. 2Μ KC1、0. 16Μ K2HPO4,4mM EDTA 和 IOmM 二硫苏糖醇，PH 7.0)，加入10μ 1不同浓度的已上市的降血脂药物(普伐他汀、氟伐他汀和瑞舒伐他汀)，反应总体积为1ml，预温浴20min，用紫外分光光度计测定60min内反应体系
OD340变化，并计算还原酶活性抑制率。C、结果见图6，三种药物均呈现出良好的抑制活性，且呈浓度依赖性，相关系数 (R)值分别为0. 999,0. 98,0. 87，说明本结果可靠性高。通过应用本发明法检测三种已上市降血脂药物的HMG-CoA还原酶抑制活性，建立了酶抑制剂筛选方法，得到了最佳的筛选反应条件。实施例3 本发明的检测系统与HMG-CoA还原酶活性的放射性同位素法比较。本发明的检测系统与HMG-CoA还原酶活性的放射性同位素法比较，其步骤是A、按实施例2所述方法制备含可溶性HMG-CoA还原酶的肝微粒体；B、按实施例2建立HMG-CoA还原酶抑制剂检测体系，检测已上市的降血脂药物 (普伐他汀、氟伐他汀和瑞舒伐他汀)的半数抑制浓度(IC5tl)。结果见表1，普伐他汀、氟伐他汀和瑞舒伐他汀的IC5tl分别为11. 07,6. 19和3. 19 μ g/L。C、采用放射性同位素法(Kim HK, Jeong TS, Lee MK, et al. Lipid-Iowering efficacy ofhesperetin metabolites in high-cholesterol fed rats. Clinica Chimica Acta 2003 ；327 :129_37)，检测普伐他汀、氟伐他汀和瑞舒伐他汀的IC5tl，对本发明所建立的HMG-CoA还原酶检测系统进行验证。结果见图7和表1，普伐他汀、氟伐他汀和瑞舒伐他汀的IC50分别为14. 57、19. 96和5. 74 μ g/L,与本发明所建立的HMG-CoA还原酶检测系统结果比较一致，从而证明本发明的HMG-CoA还原酶检测系统结果可靠，具有可重复性。表1.改良分光光度法和放射性同位素法检测普伐他汀、氟伐他汀和瑞舒伐他汀对HMG-CoA还原酶的半数抑制浓度(IC5tl).
权利要求
1.一种检测HMG-CoA还原酶活性的改良分光光度法，其步骤是A、将新鲜肝脏组织以1 3w/v加入勻浆缓冲液A :100mM蔗糖、50mM KCl、40mMK2HP04、 30mM EDTA, ρΗ 7. 2，勻浆，常温下12，000 X g离心两次，每次15min，取上清100，000 X g离心60min，沉淀用勻浆缓冲液重悬后，100，000 X g再次离心60min，沉淀即为肝微粒体；B、将肝微粒体用缓冲液B缓冲液A加IOmM 二硫苏糖醇，ρΗ 7. 2重悬，再加入等体积含50% ν/ν甘油的37°C缓冲液B，手动勻浆，37°C温浴60min后，再以缓冲液B稀释3倍， 混勻，最后25°C 100，OOOXg离心60min取上清，含有可溶性HMG-CoA还原酶的肝微粒体蛋白；C、根据蛋白测定试剂盒检测步骤⑶得到肝微粒体的蛋白含量，用缓冲液B稀释蛋白浓度至lmg/ml，得到了蛋白浓度已知的肝微粒体蛋白；D、将步骤(C)得到的肝微粒体蛋白加入优化的反应体系ρΗ7.0，包括NADPH 100 μ mo 1/L、HMG-CoA 50 μ mol/L、蛋白浓度为 200 μ g/ml，和缓冲液 C :0. 2M KC1、0. 16M K2HPO4,4mM EDTA和IOmM 二硫苏糖醇，反应总体积为1ml，先进行37°C预温浴20min，随后加入底物HMG-CoA以启动酶催化反应，反应时间为60min，用紫外分光光度计检测OD34tl值的变化，根据以下公式得到HMG-CoA还原酶活性；酶活性 nmol/mg.min =测定管 AOD34。-空白对照 Δ OD340X 1000/6. 22 X 0. 2 X 60。
2.基于权利要求1建立的一种HMG-CoA还原酶抑制剂检测体系在降血脂药物的筛选中的应用，其步骤是Α、按一种检测HMG-CoA还原酶活性的改良分光光度法制备步骤所得的含可溶性 HMG-CoA还原酶活性的肝微粒体；B、在上述HMG-CoA还原酶反应体系中加入10μ 1不同浓度的受试物，预温浴20min后， 加入HMG-CoA启动反应；C、用紫外分光光度计测定60min内反应体系OD34tl值的变化，并根据以下公式计算酶活性抑制率和半数抑制浓度值。根据该公式得到的酶活性抑制率和IC5tl值可用以反映和比较药物对HMG-CoA还原酶的抑制活性大小；酶抑制率％ =对照管酶活性-抑制剂管酶活性/对照管酶活性X 100。
全文摘要
本发明公开了一种检测HMG-CoA还原酶活性的改良分光光度法及应用。其检测方法a、新鲜肝脏组织离心制备肝微粒体；b、肝微粒体重悬、匀浆、稀释、离心后取上清得到含可溶性HMG-CoA还原酶源；c、检测HMG-CoA还原酶源的蛋白含量，并稀释至已知浓度；d、将HMG-CoA还原酶源加至已优化的反应体系，检测OD340值并计算酶活性。基于该检测方法建立HMG-CoA还原酶抑制剂检测体系，计算酶活性抑制率和半数抑制浓度(IC50)，可用于筛选降血脂药物。本发明具有体系优化、安全价廉、批量筛选、结论可信等优点，可有效的筛选HMG-CoA还原酶活性抑制剂，为开发降脂药物提供了简便、快速的方法。
文档编号G01N21/33GK102221531SQ201110073398
公开日2011年10月19日 申请日期2011年3月25日 优先权日2011年3月25日
发明者平洁, 梁赅, 汪晖, 王婷婷, 郭喻 申请人:武汉大学