专利名称：新的人钙调磷酸化酶调节亚基、其编码序列及制备方法
技术领域：
本发明涉及一种新的多核苷酸。更具体地，本发明涉及人的钙调磷酸化酶(Calcineurin，简称“CN”)调节亚基(Calcineurin B，简称“CNB”)家族中的一个新成员CNBII的编码序列，该序列编码的多肽被鉴定为人CNB基因的同系物。本发明还涉及由该多核苷酸编码的多肽，这些多核苷酸和多肽的应用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生产。
已知CNB基因与生物体内的免疫调节功能有关。CNB家族中最早的成员是在牛脑中发现的一种蛋白。而该家族中最早被克隆的基因则是Guerini.D等人于1989年从小鼠精母细胞cDNA文库中克隆得到的一个CNB基因。同时被克隆的还有人的CNB基因(DNA，1989，8(9)，675-682)，经比较发现它们的同源度很高。随后，Cyert.M.S.等人于1991年克隆了酵母的CNB基因(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88，7376-7380)；Guerini.D等人于1992年克隆得到了果蝇的CNB基因(J.Biol.Chem.267，22542-22549)。所有这些CNB基因都有着高度的同源性(Biochem Biophys Res Commun 1997，235，271-275)。
在本发明之前，没有发现或发表过本发明的人钙调磷酸化酶调节基因。
本发明的一个目的是提供一种新的多核苷酸，该多核苷酸是编码人CNB基因的一个同源基因，本发明的人CNB的同系物命名为CNBII。
本发明的另一个目的是提供一种新的人CNB同源蛋白，命名为CNBII蛋白。
本发明的再一个目的是提供一种利用重组技术生产所述的CNBII蛋白的方法。
本发明还涉及该CNBII核酸序列和多肽的应用。
在本发明的一个方面，提供了一种分离出的DNA分子，它包括编码具有人CNBII蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸1-513位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸1-513位的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。更佳地，该序列具有SEQ ID NO.3中核苷酸1-513位的序列。
在本发明的另一方面，提供了一种分离的CNBII蛋白多肽，它包括具有SEQID NO.4氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
在本发明的另一方面，提供了一种载体，它含有上述分离出的DNA。
在本发明的另一方面，提供了一种所述载体转化的宿主细胞。
在本发明的另一方面，提供了一种产生具有CNBII蛋白活性的多肽的方法，该方法包括(a)将编码具有CNBII蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成CNBII蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸1-513位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成CNBII蛋白的重组细胞；(c)在适合表达CNBII蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；(d)分离出具有CNBII蛋白活性的多肽。
在本发明的一个具体实施方案中，本发明的分离的多核苷酸全长为517个核苷酸，其详细序列见SEQ ID NO.3，其中开放读框位于1-513位核苷酸。
在本发明中，“分离的”、“纯化的”或“基本纯的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。
在本发明中，术语“CNBII蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有CNBII蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中1-513位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的编码框1-513位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.3中1-513位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.4所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下与SEQ IDNO.3中从核苷酸1-513位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。更佳地，还包括在高度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸1-513位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。此外，该术语还包括与SEQ ID NO.3中从核苷酸1-513位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
该术语还包括能编码具有与人CNBII相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.3中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。
在本发明中，“基本纯的”蛋白质或多肽是指其至少占样品总物质的至少20％，较佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或湿重计)。纯度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层析、PAGE或HPLC法测量多肽的纯度。基本纯的多肽基本上不含天然状态下的伴随其的组分。
在本发明中，术语“CNBII蛋白多肽”指具有CNBII蛋白活性的SEQ ID NO.4序列的多肽。该术语还包括具有与人钙调磷酸化酶调节亚基相同功能的、SEQ IDNO.4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括CNBII蛋白的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括同源序列、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨度条件下能与CNBII DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗CNBII多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含CNBII多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括CNBII多肽的可溶性片段。通常，该片段具有CNBII多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
发明还提供CNBII蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然CNBII多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
本发明还包括CNBII多肽编码序列的反义序列。这种反义序列可用于抑制细胞内CNBII的表达。
本发明还包括一种可用作探针的核酸分子，该分子通常具有CNBII多肽编码序列的8-100个，较佳地15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码CNBII的核酸分子。
本发明还包括检测CNBII核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于CNBII多肽的编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为20-50个核苷酸。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。
在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。
另一方面，本发明还包括对CNBII cDNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于CNBII基因产物或片段。较佳地，指那些能与CNBII基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制CNBII蛋白的分子，也包括那些并不影响CNBII蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的CNBII基因产物结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab＇或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的CNBII基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达CNBII或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断CNBII功能的抗体以及不影响CNBII功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用CNBII基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与CNBII基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
本发明的人CNBII核苷酸序列全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按已知方法制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
在本发明的一个实施方案中，本发明的CNBII多核苷酸全长为517核苷酸，其详细序列见SEQ ID NO3，其中开放读框位于1-513位核苷酸。该多核苷酸是如此获得的，以人脑λgt11cDNA文库(购自Clontech公司)为模板，合成正向引物A15＇-ATGGGAAACGAGGCCAGTTACC-3＇，反向引物A25＇-AGGCTCATACGATGAGGACCAG-3＇，进行PCR获得520bp(A1/A2)的目的片段。测序后得到SEQ ID NO3的全长cDNA序列。
生物的免疫功能主要由钙调磷酸化酶来催化完成，而钙调磷酸化酶的催化活性则是由其调节亚基(CNB)与催化亚基(CNA)共同完成。其中，调节亚基起着更为重要的作用。本发明的cDNA序列被确认为人的CNBII基因，属于钙调磷酸化酶调节亚基CNB基因家族。其在调节钙调磷酸化酶的催化活性中起着重要的作用。CNB在淋巴系统中高表达(Guerini.D 1997 Biochem.Biophys.Res.Commun 235，271-275)，是生物抵抗外来毒素侵入并保护自身的一种重要的蛋白。尤其在高等生物中，其起着更为重要的作用。CNB可能与催化亚基CNA的稳定性有关；CNB结合于Ca2+，可有效地提高钙调磷酸化酶另一调节蛋白钙调蛋白(CaM)的调节活性；该同源基因还被认为可能是介导Ca2+，提高免疫系统活性方面的重要因子(Merat.D.L 1985，J.Biolog.Chem，260(20)Sep.15，11053-11059)。进一步的报道显示了CNB不仅对免疫系统具调节功能，还可能与细胞内转运有关(Aitken.A 1982，FEBSLett 150(2)314-318)。本发明的CNBII基因具有与CNB基因相似或相同的功能。
在本发明附图中，
图1本发明的人CNBII蛋白与人CNB蛋白(HCNB)的氨基酸序列的同源比较图。其中，相同的氨基酸在两个序列之间用“|”标出，相似的氨基酸用“·”标出。相似的氨基酸是A，S，T；D，E；N，Q；R，K；I，L，M，V；F，Y，W。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1CNBII的cDNA序列的克隆和测定1.引物扩增以人脑λgt11cDNA文库(购自Clontech公司)为模板，用一对寡核苷酸为引物——A15＇-ATGGGAAACGAGGCCAGTTACC-3＇(SEQ ID NO1)为正向引物，寡核苷酸A25＇-AGGCTCATACGATGAGGACCAG-3’(SEQ ID NO2)为反向引物，进行PCR。A1/A2的PCR条件为93℃4分钟，随之以93℃1分钟、68℃1分钟和72℃1分钟进行35个循环，最后72℃延伸5分钟；电泳检测得到的PCR片段，A1/A2，为520bp的目的片段。
2.PCR产物的测序将如上获得的PCR扩增产物A1/A2与pGEM-TTM载体(Promega)连接，转化大肠杆菌JM103，用QIAprep Plasmid试剂盒(QIAGEN)提取质粒，用双链嵌套式缺失试剂盒(Pharmacia)对插入片段进行定向系列缺失，然后用PCR对缺失子进行快速鉴定及排序。用SequiTherm EXCELTMDNA测序试剂盒(Epicentre Technologies)对依次截短的缺失子进行测序，最后用电脑软件拼接顺序，获得全长cDNA序列，共517bp，详细序列见SEQ ID NO3，其中开放读框位于1-513位核苷酸。
根据得到的全长cDNA序列推导出CNBII的氨基酸序列，共170个氨基酸残基，其氨基酸序列详见SEQ ID NO4。
实施例2同源比较用CNBII的全长cDNA序列及其编码蛋白在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库中用BLAST进行同源检索。结果发现它们与人CNB基因及其编码蛋白具有很高的同源性，尤其在蛋白水平上的同一性(identity，又称相同性)达到了84％，相似性达到了88％(图2)。
特别是在CNBII的氨基酸序列中存在3个由13个氨基酸组成的EF手型钙结合位点的特征性序列-DX(D/N/S){ILVFYW}(D/E/N/S/T/G)(D/N/Q/G/H/R/K){GP}(L/I/V/M/C)(D/E/N/Q/S/T/A/G/C)X2(D/E)(L/I/V/M/F/Y/W)[注该序列中X为任意氨基酸，“2”等数字为氨基酸数目，“(L/I/V/F/Y/W)”表示从这6个氨基酸中任意选择一个氨基酸，{GP}表示此处不可能为G或P]。
在本发明的蛋白中符合上述模式的序列片段是DTDGDGEVDFKEF(SEQ IDNO.4中63-75位)，DMDKDGYISNGEL(SEQ ID NO.4中100-112位)，DKDGDGKISFEEF(SEQ ID NO.4中141-153位)，这进一步证实了本发明的人CNBII属于一种钙调蛋白。综上所述，可以断定人的CNBII蛋白属于钙调磷酸化酶调节亚基家族，并且具有钙调磷酸化酶调节亚基家族的相关功能。
CNB被认为与淋巴系统免疫功能有关，是生物抵抗外来影响，保护自身的一种蛋白。生物的免疫功能主要由钙调磷酸化酶来催化完成，而钙调磷酸化酶的催化活性则是由其调节亚基(CNB)与催化亚基(CNA)共同完成。其中，调节亚基起着更为重要的作用(Guerini.D 1997 Biochem.Biophys.Res.Commun 235，271-275)。
钙调磷酸化酶调节亚基(CNB)主要通过协同钙调蛋白(CaM)调节钙调磷酸化酶催化亚基(CNA)的催化活性来调节人及动物的免疫细胞发挥正常的免疫功能，抵抗外来物质对人体的不良影响。首先，CNB被认为可能与催化亚基的稳定性有关，CNB与CNA结合后，CNA的稳定性比正常状态下高的多。其次，CNB结合于Ca2+，可有效地提高钙调磷酸化酶另一调节蛋白钙调蛋白(CaM)的调节活性。虽然，CNB与CaM的调节作用是相互独立的，但它们之间又存在着协调作用的关系。缺了任何一方，CNA的催化活性都不能最高水平的发挥出来。CNB还被认为可能是介导Ca2+，提高免疫系统活性方面的重要因子，Merat等人早已通过实验发现，Ca2+在调节钙调磷酸化酶的活性方面起着必不可少的作用，而在CNB的存在下，Ca2+的调节作用表现的更加明显(Merat.D.L1985，J.Biolog.Chem，260(20)，11053-11059)。
已表明，CNB不仅对免疫系统具调节功能，还可能与细胞内转运有关。在CNB的N末端有一段特殊的氨基酸序列，人们发现这一序列在环化AMP依赖的蛋白激酶催化亚基中也存在。本发明CNBII的N末端的多个氨基酸与CNB中的氨基酸的同一性大于85％，相似性更高达93％。并且CNBII中存在相应的这一不寻常区域，这一事实表明，CNBII也参与了细胞膜的相互作用，并参与物质的细胞跨膜转运。CNB的上述功能表明，CNBII可用于提高免疫水平或者用于治疗因CNBII缺乏而导致的其他疾病。由于在蛋白激酶和磷酸激酶蛋白中均有这一不寻常的区域，因此这一区域可能与这些蛋白与其底物的相互作用有关。另外，这一区域的存在，使得这些蛋白能与细胞膜相互作用，并参与物质的细胞内跨膜转运。更深入地对这一区域的研究认为，这一神秘的区域可能在维持CNB与CNA两个亚基的相互作用中起着重要的作用(FEBS Lett1982，150(2)，314-318)。
本发明的CNBII除了可作为该家族一员用于进一步的功能研究，还可用于与其他蛋白一起产生融合蛋白，比如与免疫球蛋白一起产生融合蛋白。此外，本发明CNBII还可以与该家族的其他成员进行融合或交换片段，以产生新的蛋白，如将本发明CNBII的C端与人CNB的C端进行交换，以产生新的活性更高或具有新特性的蛋白。
针对本发明CNBII的抗体，可用于筛选该家族的其他成员，或者用于亲和纯化相关蛋白(如该家族的其他成员)。
例如，本发明人CNBII核酸(编码序列或反义序列)可以被引入细胞，以提高人CNBII的表达水平或者抑制人CNBII的过度表达。本发明的人CNBII蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治疗或减轻因人CNBII缺失、无功能或异常而导致的有关病症。此外，还可以用基于本发明的核酸序列或抗体进行有关的诊断或预后判断。
实施例3CNBII在大肠杆菌中的表达编码CNBII的cDNA序列用对应于该DNA序列的5＇和3＇端的PCR寡核苷酸引物，用人脑λgt11cDNA文库(购自Clontech公司)为模板进行扩增，以合成插入片段。
5＇寡核苷酸引物序列为5＇-TCTGGGATCCATGGGAAACGAGGCCAGTT-3＇(SEQ ID NO.5)，该引物含有BamHI限制性内切酶的酶切位点，接之是由起始密码子开始的CNBII编码序列的19个核苷酸；3’寡核苷酸引物序列为5’-GTAGGGATCCTCATACGATGAGGACCAGC-3’(SEQ ID NO.6)，该引物含有BamHI限制性内切酶的酶切位点，一个翻译终止子和CNBII的编码序列。
限制性内切酶的酶切位点对应于细菌表达载体pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Ampr)、一个细菌复制起点(ori)、一个IPTG-可调启动子/操纵子(P/O)、一个核糖体结合位点(RBS)、一个6-组氨酸标记物(6-His)以及限制性内切酶克隆位点。
用BamHI消化pQE-9载体，随后将插入片段连接到pQE-9载体并保持开放读框在细菌RBS起始。随后用连接混合物转化购自Qiagen，商品名为M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷贝的质粒pREP4，其表达lacI阻遏物并携带卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培养皿上筛选转化子，抽提质粒，用SalI酶切鉴定插入片段大小及方向，测序验证结果表明CNBII的cDNA插入片段已正确装入载体。
在补加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的阳性转化子克隆。过夜(O/N)培养物以1∶100-1∶250的稀释率稀释，然后接种到大体积培养基中，培养细胞至600光密度(OD600)为0.4-0.6，随后加入IPTG(“异丙基硫代-B-D-半乳糖苷”)至终浓度为1mM。通过使lacI阻遏物失活，IPTG诱导启动P/O导致基因表达水平提高。继续培养细胞3-4小时，随后离心(6000×g，20分钟)。超声裂解包涵体，收集细胞并将细胞沉淀溶于6M的盐酸胍中。澄清后，通过在能使含6-His标记物蛋白紧密结合的条件下，用镍-螯合柱层析从溶液中纯化溶解的CNBII。用6M盐酸胍(pH5.0)从柱中洗脱CNBII。可用几种方法从盐酸胍中变性沉淀蛋白。或者，使用透析步骤除去盐酸胍，或者从镍-螯合柱中分离出纯化蛋白。纯化了的蛋白可以结合到第二个柱中，该柱中具有递减的线性盐酸胍梯度。在结合到该柱时蛋白质变性，随后用盐酸胍(pH5.0)洗脱。最后，将可溶的蛋白质对含PBS进行透析，然后将蛋白质保存在终浓度为10％(w/v)甘油的贮存液中。
用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小约为20KDa。
此外，用常规方法对表达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO4的序列一致。
实施例4CNBII在真核细胞(CHO细胞株)中的表达在该实施例中，将编码CNBII的cDNA序列用对应于该DNA序列的5＇和3＇端的PCR寡核苷酸引物，以人脑λgt11eDNA文库为模板进行扩增，从而获得合成的插入片段。
PCR反应中使用的5＇寡核苷酸引物序列为5＇-TCTGAAGCTTATGGGAAACGAGGCCAGTT-3＇(SEQ ID NO.7)，该引物含有HindIII限制性内切酶的酶切位点，接之是由起始密码子开始的CNBII编码序列的19个核苷酸；3＇端引物序列为5’-GTAGGGATCCTCATACGATGAGGACCAGC-3’(SEQ ID NO.8)该引物含有BamHI限制性内切酶的酶切位点、一个翻译终止子和CNBII的编码序列。
引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于CHO细胞表达载体pcDNA3上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Ampr和Neor)、一个噬菌体复制起点(fl ori)、一个病毒复制起点(SV40 ori)、一个T7启动子、一个病毒启动子(P-CMV)、一个Sp6启动子、一个SV40启动子、一个SV40加尾信号和相应的polyA顺序、一个BGH加尾信号和相应的polyA顺序。
用HindIII、BamHI消化pcDNA3载体，随后将插入片段连接到pcDNA3载体。随后用连接混合物转化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培养皿上筛选转化子，在补加Amp(100g/μml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的克隆。抽提质粒，用EcoRV酶切鉴定插入片段大小及方向，测序验证结果表明CNBII的cDNA插入片段已正确装入载体。
质粒转染CHO细胞是用脂转染法，采用Lipofectin试剂盒(GiBcolife)进行。转染48小时后，经2-3周的持续G418加压筛选，收集细胞及细胞上清测定表达蛋白酶活力。去G418，连续传代培养；对混合克隆细胞极限稀释，选择具有较高蛋白活性的细胞亚克隆。按常规方法大量培养上述阳性亚克隆。48小时后，开始收集细胞及上清，用超声裂解方法破碎细胞。以含0.05％Triton的50mMTris·HCl(pH7.6)溶液为平衡液及洗脱液，用经预平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mMTris·HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mMTris·HCl(pH8.0)溶液为洗脱液进行梯度洗脱，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7.4)为透析液对表达蛋白溶液进行透析。最后冻干保存。
用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小约为20KDa。
此外，用常规方法对表达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO4的序列一致。
实施例5制备抗体将实施例3和4中获得的重组蛋白用来免疫动物以产生抗体，具体如下。重组蛋白用层析法进行分离备用。也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下，并用等体积的完全Freund’s佐剂乳化。用50-100μg/0.2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund’s佐剂乳化的同样抗原对小鼠以50-100μg/0.2ml的剂量进行腹膜内注射以加强免疫。每隔14天进行一次加强免疫，至少进行三次。获得的抗血清的特异反应活性用它在体外沉淀CNBII基因翻译产物的能力加以评估。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表(1)一般信息(i)申请人复旦大学(ii)发明名称新的人钙调磷酸化酶调节亚基、其编码序列及制备方法(iii)序列数目8(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度22碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO1ATGGGAAACG AGGCCAGTTA CC22(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度22碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO2AGGCTCATAC GATGAGGACC AG 22(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)长度517bp
(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO31 ATGGGAAACGAGGCCAGTTACCCGGCGGAGATGTGCTCCCACTTTAACAATGATGAAATT61 AAAAGGCTGGGCAGGAGGTTTAAGAAGTTGGACTTGGACAAATCAGGGTCTCTAAGCGTG121 GAGGAGTTCATGTCCCTGCCGGAGCTGCGCCACAACCCGTTGGTGCGGCGAGTGATCGAC181 GTCTTCGACACCGACGGTGATGGAGAAGTGGACTTCAAGGAATTCATCCTGGGGACCTCC241 CAGTTCAGCGTCAAGGGCGACGAGGAGCAGAAGTTGAGGTTTGCGTTCAGCATTTACGAC301 ATGGATAAAGATGGCTACATTTCCAACGGGGAGCTCTTCCAGGTGCTGAAGATGATGGTG361 GGCAACAACCTGACGGACTGGCAGCTCCAGCAGCTGGTCGACAAAACCATCATCATCCTG421 GACAAGGATGGCGATGGGAAGATATCCTTTGAGGAATTCAGTGCTGTGGTCAGAGACCTG481 GAGATCCACAAGAAGCTGGTCCTCATCGTATGAGCCT(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)长度170个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO41 Met Gly Asn Glu Ala Ser Tyr Pro Ala Glu Met Cys Ser His Phe16 Asn Asn Asp Glu Ile Lys Arg Leu Gly Arg Arg Phe Lys Lys Leu31 Asp Leu Asp Lys Ser Gly Ser Leu Ser Val Glu Glu Phe Met Ser46 Leu Pro Glu Leu Arg His Asn Pro Leu Val Arg Arg Val Ile Asp61 Val Phe Asp Thr Asp Gly Asp Gly Glu Val Asp Phe Lys Glu Phe76 Ile Leu Gly Thr Ser Gln Phe Ser Val Lys Gly Asp Glu Glu Gln91 Lys Leu Arg Phe Ala Phe Ser Ile Tyr Asp Met Asp Lys Asp Gly106 Tyr Ile Ser Asn Gly Glu Leu Phe Gln Val Leu Lys Met Met Val121 Gly Asn Asn Leu Thr Asp Trp Gln Leu Gln Gln Leu Val Asp Lys136 Thr Ile Ile Ile Leu Asp Lys Asp Gly Asp Gly Lys Ile Ser Phe151 Glu Glu Phe Ser Ala Val Val Arg Asp Leu Glu Ile His Lys Lys166 Leu Val Leu Ile Val(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO5TCTGGGATCC ATGGGAAACG AGGCCAGTT 29(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO6GTAGGGATCC TCATACGATG AGGACCAGC 29(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(iii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO7TCTGAAGCTT ATGGGAAACG AGGCCAGTT 29(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO8GTAGGGATCC TCATACGATG AGGACCAGC29
权利要求
1.一种分离出的DNA分子，其特征在于，它包括编码具有人CNBII蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸1-513位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸1-513位的核苷酸序列杂交。
2.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。
3.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，该序列具有SEQ ID NO.3中核苷酸1-513位的序列。
4.一种分离的CNBII蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如权利要求4所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA。
7.一种用权利要求6所述载体转化的宿主细胞。
8.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，该细胞是大肠杆菌。
9.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，该细胞是真核细胞。
10.一种产生具有CNBII蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，该方法包括(a)将编码具有CNBII蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成CNBII蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸1-513位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成CNBII蛋白的重组细胞；(c)在适合表达CNBII蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；(d)分离出具有CNBII蛋白活性的多肽。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，该序列为SEQ ID NO.3中从核苷酸1-513位。
12.一种能与权利要求4所述的CNBII蛋白多肽特异性结合的抗体。
13.一种核苷酸分子，其特征在于，它是权利要求1所述DNA分子的反义序列。
14.一种探针分子，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA分子中约8-100个连续核苷酸。
全文摘要
本发明提供了人的钙调磷酸化酶(Calcineurin,简称“CN”)调节亚基(CalcineurinB,简称“CNB”)家族中的一个新成员CNBⅡ的编码序列, 该序列编码的多肽被鉴定为人CNB基因的同系物。本发明还涉及由该多核苷酸编码的多肽,这些多核苷酸和多肽的应用,以及所述多核苷酸和所述多肽的生产。
文档编号C12P21/00GK1249347SQ9812192
公开日2000年4月5日 申请日期1998年9月30日 优先权日1998年9月30日
发明者余龙, 张宏来, 赵勇, 傅强, 赵寿元 申请人:复旦大学