专利名称：人磷脂酰乙醇胺－n－甲基转移酶、其编码序列及制备方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种新的人基因核苷酸序列。更具体地说，本发明涉及人的磷脂酰乙醇胺-N-甲基转移酶(phosphotidylethanolamine N-methyltransferase homolog，简称为“PEMTH”)以及编码该酶的cDNA序列。本发明还涉及所述多核苷酸序列和所述多肽的生产方法，以及这些多核苷酸和多肽的应用。
磷脂酰胆碱(又称卵磷脂，简称PC)是真核细胞中最丰富的磷脂类，它不仅作为膜的组成成分而且是第二信使的一个来源。在生物体内卵磷脂是经过两个途径进行合成的。第一是从无到有的途径，即从磷脂酰乙醇胺(简称PE)经甲基化而来，其中是S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体；第二是补救途径，即胆碱经CDP-胆碱而合成卵磷脂。生物体内卵磷脂的主要来源是第二条途径而来的，第一条途径大部分都限制在了肝脏内部，其中磷脂酰乙醇胺-N-甲基转移酶(PEMT)的作用就是催化PE-PC的甲基化。
在生物体内，磷脂酰乙醇胺-N-甲基转移酶(phosphotidylethanolamine N-methyltransferase，简称为“PEMT”)大部分存在与肝脏中，它以两种形式存在。1PEMT1主要分布在内质网中，2PEMT1的异构形式PEMT2只在线粒体连接的膜上存在。在肝中PE-PC的甲基化转变至少要求这两种酶的存在。近年来随着大鼠cDNA、人的有关PEMT基因、小鼠基因的相继克隆，推进了对其重要生物学功能的深入研究。
现在知道，PEMT存在于Rhodibacter sphacroides、酵母、鸡肝、啮齿类动物肝脏、人类肝脏，这一事实说明了PE甲基化途径是十分重要，而且在进化上是保守的(Cui，Z.et al.Biochem.Biophys.Acta.1997，1346(1997)，10-16.)1993年，加拿大Alberta大学的脂类和脂蛋白研究室首先在大鼠肝cDNA文库中筛选到PEMT的cDNA，Northern结果显示其mRNA长1Kb(Zheng Cui et al.J.Biology.Chem.1993，268(22)，16655-16663)。之后这个小组以大鼠cDNA为探针找到了第一个人类的PEMT2的cDNA克隆。同时发现每个cDNA克隆都有不同的5′端的非翻译区，这个区域可能与组织的特异性有关(Dennis E.Vance etc BBA 1348(1997)142-150)。1996年，这个研究小组又克隆到了小鼠的PEMT2基因(Christopher J.walkey etcJournal of lipid Research V37 1996，2341-2350)。
众所周知，CDP-胆碱途径在动物细胞中起着重要的作用。体外实验及以大鼠为对象的研究证明，磷脂酰胆碱合成的PE甲基化途径与CDP-胆碱途径之间有着紧密的联系，两者之间似乎存在着负调节的关系，然而，PE甲基化途径似乎并不能取代CDP-胆碱途径(J.Biol.Chem.1995，270，16277-16282)。那么，PEMT在生物体内究竟扮演了一个什么样的角色呢？目前的研究结果表明PEMT与肝细胞的增生、抑制，以及神经元蜡样脂褐质沉淀症(neuronal ceroid lipofuscinosis，又称为Batten氏症)等诸多方面都有着密切的关系。
给大鼠喂以缺乏胆碱的食物。约三星期后PEMT2开始大量增加，直到12个星期后增加到约为先前的5倍。这暗示了PEMT在维持短期胆碱缺乏的大鼠生长方面的作用。当胆碱缺乏维持一个足够长的时间会使大鼠对癌症更加敏感，这是否与PEMT间有所联系还有待研究(Cui，Z.et al.J.Biol.Chem.1996，271，2839-2843)。
基因剔除实验对于了解基因的功能来说是具有很强说服力的。在刚断奶的PEMT剔除的小鼠中实施缺乏胆碱的饮食会造成小鼠的死亡，说明PEMT在胆碱缺乏的动物中确实起着维持动物正常生长和肝脏正常功能的作用。但令人费解的是，缺乏PEMT的小鼠直到10个月大都没有明显的病理性表型，进一步的研究正在进行(Proc.Natl.Acad.Sci.1997，94，12880-12885)。
一系列的研究模型表明了PEMT2在控制肝细胞生长方面的重要作用，这些模型包括对围生期鼠肝变化的研究(Cui，Z.et al.Biochem.Biophys.Acta.1997，1346，10-16.)；大鼠肝的部分切除后的再生(Biochem.Biophys.Acta.1997，1346，1-9)；注入硝酸铅引起肝血浆过多(Biochem.Biophys.Acta.1997，1346(1997)，10-16；Biochem.Biophys.Acta.1997，1348，142-150)。这些研究表明PEMT2的表达起着抑制肝细胞分裂的作用。这很自然使人联想起PEMT在肝癌中的作用。事实上确实际上现了PEMT2在肝癌组织中有异常表达。另一个有趣的事实是，小鼠的PEMT2基因位于11号染色体，该区域对应于人染色体5q或17p，而这两个区域都被认为是突变的热点，它们在原发性(primary)肝癌中都被删除。PEMT2与肝癌的关系确是有趣的问题(J.Lipid.Res.1996，37，2341-2350)。
然而，在本发明之前，没有公开过本申请中涉及的人类磷脂酰乙醇胺-N-甲基转移酶。
本发明的一个目的是提供一种新的多核苷酸，该多核苷酸编码磷脂酰乙醇胺-N-甲基转移酶家族的一个新成员，本发明的磷脂酰乙醇胺-N-甲基转移酶被命名为人PEMTH(GenBank Accession No.AF044214)(因申请保密一段时间，故在本申请之前该序列没有对公众公开)。
本发明的另一个目的是提供一种新的人磷脂酰乙醇胺-N-甲基转移酶家族成员，该酶被命名为人PEMTH蛋白。
本发明的再一个目的是提供一种利用重组技术生产所述的新的人磷脂酰乙醇胺-N-甲基转移酶的方法。
本发明还提供了这种人PEMTH基因序列和多肽的应用。
在本发明的一个方面，提供了一种分离出的DNA分子，它包括编码具有人PEMTH蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸84-683位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸84-683位的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。更佳地，该序列具有SEQ ID NO.3中从核苷酸84-683位的核苷酸序列。
在本发明的另一方面，提供了一种分离的人PEMTH蛋白多肽，它包括具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
在本发明的另一方面，提供了一种载体，它含有上述分离出的DNA。
在本发明的另一方面，提供了一种所述载体转化的宿主细胞。
在本发明的另一方面，提供了一种产生具有人PEMTH蛋白活性的多肽的方法，该方法包括(a)将编码具有人PEMTH蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成人PEMTH蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸84-683位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成人PEMTH蛋白的重组细胞；(c)在适合表达人PEMTH蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；(d)分离出具有人PEMTH蛋白活性的多肽。
在本发明的一个具体实施方案中，本发明的分离的多核苷酸全长为828个核苷酸，其详细序列见SEQ ID NO3，其中开放读框位于84-683位核苷酸。
在本发明中，“分离的”、“纯化的”或“基本纯的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。
在本发明中，术语“人PEMTH蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有人PEMTH蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO3中84-683位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO3序列的编码框84-683位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO3中84-683位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO4所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳地在高度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸84-683位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。此外，该术语还包括与SEQ ID NO.3中从核苷酸84-683位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
该术语还包括能编码具有与人PEMTH相同功能的蛋白的、SEQ ID NO3中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。
在本发明中，“基本纯的”蛋白质或多肽是指其至少占样品总物质的至少20％，较佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或湿重计)。纯度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层析、PAGE或HPLC法测量多肽的纯度。基本纯的多肽基本上不含天然状态下的伴随其的组分。
在本发明中，术语“人PEMTH蛋白多肽”指具有人PEMTH蛋白活性的SEQ IDNO4序列的多肽。该术语还包括具有与人高效淋巴细胞趋化因子相同功能的、SEQ ID NO4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人PEMTH蛋白的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括同源序列、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨度条件下能与人PEMTH DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗人PEMTH多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含人PEMTH多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还提供了人PEMTH多肽的可溶性片段。通常，该片段具有人PEMTH多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
发明还提供人PEMTH蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然人PEMTH多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还可以包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
本发明还包括人PEMTH多肽编码序列的反义序列。这种反义序列可用于抑制细胞内人PEMTH的表达。
本发明还包括一种可用作探针的核酸分子，该分子通常具有人PEMTH多肽编码序列的8-100个，较佳地15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码人PEMTH的核酸分子。
本发明还包括检测人PEMTH核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于人PEMTH多肽的编码序列，可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为20-50个核苷酸。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。
在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。
另一方面，本发明还包括对人PEMTH DNA或是其片段编码的多肽具有特异性抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人PEMTH基因产物或片段。较佳地，指那些能与人PEMTH基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人PEMTH蛋白的分子，也包括那些并不影响人PEMTH蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人PEMTH基因产物结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人PEMTH基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人PEMTH或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断人PEMTH功能的抗体以及不影响人PEMTH功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人PEMTH基因产物的片段或功能区，通过免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人PEMTH基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
本发明的人PEMTH核苷酸序列全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按已知方法制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。当然，通过先合成多个小片段，然后再进行连接而获得序列很长的片段。
在本发明中，人PEMTH的cDNA核苷酸序列是如此获得的，以人肝脏λgt11cDNA文库(购自Clontech公司)为模板，合成正向引物A15′-GAGGTAACGAACAGCTCGGTGGC-3′(SEQ ID NO1)，和反向引物A25′-CAAGGCAGCAGGTTCCAAGGCAC-3′(SEQ ID NO2)，进行PCR，获得828bp的目的片段。测序后得到SEQ ID NO3的全长cDNA序列。
通过同源检索发现，上述序列与大鼠的PEMT基因在核酸水平上高度同源，而在蛋白水平上则与小鼠、大鼠的PEMT都有高度同源性。
已知PEMT与肝细胞的分裂增殖相关，在个体发育的过程中其表达水平有明显的变化，而且这种成长发生在基因表达的水平上。同时发现肝癌衍生细胞系中，PEMT的活性几乎查不到，并且PE甲基化水平也比正常肝明显降低，而且没有PEMT2蛋白，在非致瘤性生长中PEMT2表达也极大的降低。这些现象表明PEMT的活动可能与肝癌的发生关系密切。因此本发明分离到的人类PEMT的cDNA及多肽(酶)为研究肝癌提供了一条途径。
另外，PEMT2蛋白的低表达与带有mnd(motor Neuron Degeneration)基因的生物体的表型有关，其表型为神经元蜡样脂褐质沉淀症(其特征是在神经元中发生缺陷性的脂类沉积)。因此本发明分离到的人类PEMT的cDNA及多肽(酶)为治疗此类疾病提供了一条途径。
在附图中，
图1为本发明的人PEMTH与大鼠PEMT的核酸序列的同源比较图。其中，相同的核苷酸用“|”标出。
图2为本发明的人PEMTH与大鼠及小鼠PEMT蛋白的氨基酸序列的同源比较图。其中，相同的氨基酸在三个序列下方用“*”标出，在3个序列中相似性较好的氨基酸用“·”标出。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1人PEMTH的cDNA序列的克隆和测定1.引物扩增以人肝脏λgt11cDNA文库(购自Clontech公司)为模板，用一对寡核苷酸为引物——A15′-GAGGTAACGAACAGCTCGGTGGC-3′(SEQ ID NO1)，寡核苷酸A25′-CAAGGCAGCAGGTTCCAAGGCAC-3′(SEQ ID NO2)为反向引物，进行PCR。PCR条件为93℃4分钟，随之以93℃1分钟、74℃1分钟和72℃1分钟进行35个循环，最后72℃延伸5分钟。电泳检测得到的PCR片断，其长度为828bp。
2.PCR产物的测序将如上获得的这段PCR扩增产物A1/A2与pGEM-T载体(Promega)连接，转化大肠杆菌JM103，用QIAprep Plasmid试剂盒(QIAGEN)提取质粒，用双链嵌套式缺失试剂盒(Pharmacia)对插入片段进行定向系列缺失，然后用PCR对缺失子进行快速鉴定及排序。用SequiTherm EXCELTMDNA测序试剂盒(Epicentre Technologies)对依次截短的缺失子进行测序，最后用电脑软件拼接顺序，获得全长cDNA序列，共828bp，详细序列见SEQ ID NO3，其中开放读框位于84-683位核苷酸。
根据得到的全长基因组序列推导出人PEMTH的氨基酸序列，共199个氨基酸残基，其氨基酸序列详见SEQ ID NO4。
实施例2同源比较和结构研究用人PEMTH的全长cDNA序列及其编码蛋白在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库及Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR数据库中用BLAST进行核酸和蛋白同源检索。结果发现其核酸序列与大鼠的PEMT基因在核酸水平上高度同源(约80％同一性)(图1)，而在蛋白水平上则与小鼠、大鼠的PEMT都有高度同源性(与小鼠的同一性为约76％，相似性约为86％；与大鼠的同一性为77％，相似性为86％)(图2)。所以，可以确定人PEMTH与它们构成了一个家族，并且可以从这些基因或蛋白的功能来推测本发明的人PEMTH的功能。
已知PEMT与肝细胞的分裂增殖相关，在围产期前后，PEMT的活性会有很大的变化。在胚胎时期肝细胞生长分裂迅速而PEMT的活性很低；出生后，PEMT的活性迅速升高，而肝细胞的生长则慢慢下降，而且这种成长发生在基因表达的水平上。同时发现在快速分裂的MCA-RH777和HepG2这些肝癌衍生细胞系中，PEMT的活性几乎查不到。在肝癌细胞中，PE甲基化水平比正常肝明显降低，而且没有PEMT2蛋白，在非致瘤性生长中PEMT2表达也极大的降低。这些现象表明PEMT的活动可能与肝癌的发生关系密切。因此本发明分离到的人类PEMT的cDNA及多肽(酶)为研究肝癌提供了一条途径。
基因剔除实验同样提供了有关PEMT功能的信息。在刚断奶的PEMT剔除的小鼠中实施缺乏胆碱的饮食会造成小鼠的死亡，说明PEMT在胆碱缺乏的动物中确实起着维持动物正常生长和肝脏正常功能的作用。
另外，PEMT2蛋白的低表达与带有mnd(motor Neuron Degeneration)基因的生物体的表型有关，其表型为神经元蜡样脂褐质沉淀症(其特征是在神经元中发生缺陷性的脂类沉积)。因此本发明分离到的人类PEMT的cDNA及多肽(酶)为治疗此类疾病提供了一条途径。
本发明的人PEMTH除了可作为该家族一员用于进一步的功能研究，还可用于与其他蛋白一起产生融合蛋白，比如与免疫球蛋白一起产生融合蛋白。此外，本发明人PEMTH还可以与该家族的其他成员进行融合或交换片段，以产生新的蛋白。例如将本发明人PEMTH的N端与大鼠或小鼠PEMT的N端进行交换，以产生新的活性更高或具有新特性的蛋白。
针对本发明人PEMTH的抗体，用于筛选该家族的其他成员，或者用于亲和纯化相关蛋白(如该家族的其他成员)。
例如，本发明人PEMTH核酸(编码序列或反义序列)可以被引入细胞，以提高人PEMTH的表达水平或者抑制人PEMTH的过度表达。本发明的人PEMTH蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治疗或减轻因人PEMTH缺失、无功能或异常而导致的有关病症。此外，还可以用基于本发明的核酸序列或抗体进行有关的诊断或预后判断。
实施例3人PEMTH在大肠杆菌中的表达在该实施例中，将编码人PEMTH的cDNA序列(GenBank Accession No.AF044214)用对应于该DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物进行扩增，获得人PEMTH cDNA作为插入片段。
PCR反应5′寡核苷酸引物序列为5′-AGAGGTCGACATGACCCGGCTGCTGGGCT-3′(SEQ ID NO.5)该引物含有SalI限制性内切酶的酶切位点，接之是由起始密码子开始的人PEMTH编码序列的19个核苷酸；3′端引物序列为5′-GAAGAAGCTTTCAGCTCCTCTTGTGGGAC-3′(SEQ ID NO.6)该引物含有HindIII限制性内切酶的酶切位点，一个终止密码子和人PEMTH编码序列的19个核苷酸；引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于细菌表达载体pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Ampr)、一个细菌复制起点(ori)、一个IPTG-可调启动子/操纵子(P/O)、一个核糖体结合位点(RBS)、一个6-组氨酸标记物(6-His)以及限制性内切酶克隆位点。
用HindIII，SalI消化pQE-9载体，随后将插入片段连接到pQE-9载体并保持开放读框在细菌RBS起始。随后用连接混合物转化购自Qiagen，商品名为M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷贝的质粒pREP4，其表达lacI阻遏物并携带卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培养皿上筛选转化子，抽提质粒，测序验证人PEMTH的cDNA片段已正确插入了载体。
在补加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的克隆。过夜(O/N)培养物以1∶100-1∶250的稀释率稀释，然后接种到大体积培养基中，培养细胞生长至600光密度(OD600)为0.4-0.6时，加入IPTG(“异丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至终浓度为1mM。通过使lacI阻遏物失活，IPTG诱导启动P/O导致基因表达水平提高。继续培养细胞3-4小时，随后离心(6000×g，20分钟)。超声裂解包涵体，收集细胞并将细胞沉淀溶于6M的盐酸胍中。澄清后，通过在能使含6-His标记物蛋白紧密结合的条件下，用镍-螯合柱层析从溶液中纯化溶解的人PEMTH。用6M盐酸胍(pH5.0)从柱中洗脱人PEMTH。可用几种方法从盐酸胍中变性沉淀蛋白。首先，使用透析步骤除去盐酸胍，或者从镍-螯合柱中分离出的纯化蛋白可以结合到第二个柱中，该柱中具有递减的线性盐酸胍梯度。在结合到该柱时蛋白质变性，随后用盐酸胍(pH5.0)洗脱。最后，将可溶的蛋白质用PBS进行透析，然后将蛋白质保存在终浓度为10％(w/v)甘油的贮存液中。
用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小约为22kDa。
此外，用常规方法对达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO4的序列一致。
实施例4人PEMTH在真核细胞(CHO细胞株)中的表达在该实施例中，将编码人PEMTH的cDNA序列(GenBank AccessionNOAF044214)用对应于该DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物进行扩增，获得人PEMTH cDNA作为插入片段。
PCR反应中使用的5′寡核苷酸引物序列为5′-AGAGAAGCTTATGACCCGGCTGCTGGGCT-3′(SEQ ID NO.7)该引物含有HindIII限制性内切酶的酶切位点，接之是由起始密码子开始的人PEMTH编码序列的19个核苷酸；3′端引物序列为5′-GAAGGAGCTCTCAGCTCCTCTTGTGGGAC-3′(SEQ ID NO.8)该引物含有SacI限制性内切酶的酶切位点、一个翻译终止子和人PEMTH的编码序列。限制性内切酶的酶切位点对应于CHO细胞表达载体pcDNA3上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Ampr和Neor)、一个噬菌体复制起点(fl ori)、一个病毒复制起点(SV40 ori)、一个T7启动子、一个病毒启动子(P-CMV)、一个Sp6启动子、一个SV40启动子、一个SV40加尾信号和相应的polyA顺序、一个BGH加尾信号和相应的polyA顺序。
用HindIII，SacI消化pcDNA3载体，随后将插入片段连接到pcDNA3载体。随后用连接混合物转化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培养皿上筛选转化子，在补加Amp(100μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的克隆。抽提质粒，用BstxI酶切鉴定插入片段大小及方向，测序验证人PEMTH的cDNA片段已正确插入了载体。
质粒转染是采用脂转染法，用Lipofectin试剂盒(GiBco Life)进行的。转染48小时后，经2-3周的持续G418加压筛选，收集细胞及细胞上清测定表达蛋白酶活力。去G418，连续传代培养；对混合克隆细胞极限稀释，选择具有较高蛋白活性的细胞亚克隆。按常规方法大量培养上述阳性亚克隆。48小时后，开始收集细胞及上清，用超声裂解方法破碎细胞。以含0.05％Triton的50mM Tris·HCl(pH7.6)溶液为平衡液及洗脱液，用经预平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mM Tris·HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mMTris·HCl(pH8.0)溶液为洗脱液进行梯度洗脱，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7.4)为透析液对表达蛋白溶液进行透析。最后冻干保存。
用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小约为22kDa。
此外，用常规方法对达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO4的序列一致。
实施例5制备抗体将实施例3和4中获得的重组蛋白用来免疫动物以产生抗体，具体如下。重组蛋白用层析法进行分离后备用。也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下，并用等体积的完全Freund’s佐剂乳化。用50-100μg/0.2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund’s佐剂乳化的同样抗原对小鼠以50-100μg/0.2ml的剂量进行腹膜内注射以加强免疫。每隔14天进行一次加强免疫，至少进行三次。获得的抗血清的特异反应活性用它在体外沉淀人PEMTH基因翻译产物的能力加以评估。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表(1)一般信息(i)申请人上海新黄浦复旦基因工程有限公司(ii)发明名称人磷脂酰乙醇胺-N-甲基转移酶、其编码序列及制备方法(iii)序列数目8(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度23碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO1GAGGTAACGA ACAGCTCGGT GGC 23(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度23碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO2CAAGGCAGCA GGTTCCAAGG CAC 23(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)长度828bp(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQIDNO31 GAGGTAACGAACAGCTCGGTGGCAGGGCTGACTGCTGCGGAGGCCTCGGCAATATTGATT61 TTAGACAGGCAGACTTCTGCGTTATGACCCGGCTGCTGGGCTACGTGGACCCCCTGGATC121 CCAGCTTTGTGGCTGCCGTCATCACCATCACCTTCAATCCGCTCTACTGGAATGTGGTTG181 CACGATGGGAACACAAGACCCGCAAGCTGAGCAGGGCCTTCGGATCCCCCTACCTGGCCT241 GCTACTCTCTAAGCGTCACCATCCTGCTCCTGAACTTCCTGCGCTCGCACTGCTTCACGC301 AGGCCATGCTGAGCCAGCCCAGGATGGAGAGCCTGGACACCCCCGCGGCCTACAGCCTGG361 GCCTCGCGCTCCTGGGACTGGGCGTCGTGCTCGTGCTCTCCAGCTTCTTTGCACTGGGGT421 TCGCTGGAACTTTCCTAGGTGATTACTTCGGGATCCTCAAGGAGGCGAGAGTGACCGTGT481 TCCCCTTCAACATCCTGGACAACCCCATGTACTGGGGAAGCACAGCCAACTACCTGGGCT541 GGGCCATCATGCACGCCACGCCCACGGGCCTGCTCCTGACGGTGCTGATGGCCCTCACCT601 ACATAGTGGCTCTCCTATACGAAGAGCCCTTCACCGCTGAGATCTACCGGCAGAAAGCCT661 CCGGGTCCCACAAGAGGAGCTGATTGAGCTGCAACAGCTTTGCTGAAGGCCTGGCCAGCC721 TTCTCATCGTCCCCAAGTGGCAGGCCCTGCGCAGGGCGAGAATGGTGCCTGCTGCTCAGG781 GCCTCCCCCGGCGTGGGCTGCCCCAGTGCCTTGGAACCTGCTGCCTTG(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)长度199个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO41 Met Thr Arg Leu Leu Gly Tyr Val Asp Pro Leu Asp Pro Ser Phe16 Val Ala Ala Val Ile Thr Ile Thr Phe Asn Pro Leu Tyr Trp Asn31 Val Val Ala Arg Trp Glu His Lys Thr Arg Lys Leu Ser Arg Ala46 Phe Gly Ser Pro Tyr Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Ser Val Thr Ile61 Leu Leu Leu Asn Phe Leu Arg Ser His Cys Phe Thr Gln Ala Met76 Leu Ser Gln Pro Arg Met Glu Ser Leu Asp Thr Pro Ala Ala Tyr91 Ser Leu Gly Leu Ala Leu Leu Gly Leu Gly Val Val Leu Val Leu106 Ser Ser Phe Phe Ala Leu Gly Phe Ala Gly Thr Phe Leu Gly Asp121 Tyr Phe Gly Ile Leu Lys Glu Ala Arg Val Thr Val Phe Pro Phe136 Asn Ile Leu Asp Asn Pro Met Tyr Trp Gly Ser Thr Ala Asn Tyr151 Leu Gly Trp Ala Ile Met His Ala Thr Pro Thr Gly Leu Leu Leu166 Thr Val Leu Met Ala Leu Thr Tyr Ile Val Ala Leu Leu Tyr Glu181 Glu Pro Phe Thr Ala Glu Ile Tyr Arg Gln Lys Ala Ser Gly Ser196 His Lys Arg Ser(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO5AGAGGTCGAC ATGACCCGGC TGCTGGGCT29(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO6GAAGAAGCTT TCAGCTCCTC TTGTGGGAC29(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO7AGAGAAGCTT ATGACCCGGC TGCTGGGCT 29(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO8GAAGGAGCTC TCAGCTCCTC TTGTGGGAC 29
权利要求
1.一种分离出的DNA分子，其特征在于，它包括编码具有人PEMTH蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸84-683位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸84-683位的核苷酸序列杂交。
2.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。
3.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，该序列具有SEQ ID NO.3中从84-683位的核苷酸序列。
4.一种分离的人PEMTH蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如权利要求4所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA。
7.一种用权利要求6所述载体转化的宿主细胞。
8.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，该细胞是大肠杆菌。
9.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，该细胞是真核细胞。
10.一种产生具有人PEMTH蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，该方法包括(a)将编码具有人PEMTH蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成人PEMTH蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸84-683位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成人PEMTH蛋白的重组细胞；(c)在适合表达人PEMTH蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；(d)分离出具有人PEMTH蛋白活性的多肽。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，该序列为SEQ ID NO.3中从核苷酸84-683位。
12.一种能与权利要求4所述的人PEMTH蛋白多肽特异性结合的抗体。
13.一种核苷酸分子，其特征在于，它是权利要求1所述DNA分子的反义序列。
14.一种探针分子，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA分子中约8-100个连续核苷酸。
全文摘要
本发明提供了人的磷脂酰乙醇胺－N－甲基转移酶(phosphotidy lethanolamine N-methyltransferase homolog,简称为“PEMTH”)以及编码该酶的cDNA序列。本发明还涉及所述多核苷酸序列和所述多肽的生产方法,以及这些多核苷酸和多肽的应用。
文档编号C12P21/00GK1249342SQ98121908
公开日2000年4月5日 申请日期1998年9月28日 优先权日1998年9月28日
发明者余龙, 张民, 毕安定, 赵勇, 赵寿元 申请人:上海新黄浦复旦基因工程有限公司