专利名称：检测伴有溶血磷脂浓度改变的癌症的方法
I.相互参照有关的申请本申请是1997年3月21日递交的共同待审的美国专利申请序号08/822,128的部分继续申请。
II.引言本发明涉及通过检测受试者体液样品中的溶血磷脂或它们的成分脂肪酸(constituent fatty acids)的浓度来筛选患有癌症的受试者的方法，尤其是与溶血磷脂和它们的成分脂肪酸的浓度改变有关的妇科癌症和乳腺癌。
III.本发明背景对于人类各种癌症的早期检测，无时不需要癌症的标记物。乳腺癌和妇科癌症已成为妇女的重要死亡因素并对先前的干预治疗(intervention)提出了挑战。例如，在妇女中卵巢癌是第四位导致死亡的恶性肿瘤(American Cancer Society，Cancer J.Clin.，437-26(1993))。卵巢癌患者在早期、更易治疗的阶段作出诊断可带来较高的存活率，而目前70％的患者在确诊时已处于癌症晚期。最适用的血清标记物CA125并没有足够的灵敏性或特异性来保证其在卵巢癌的筛查中作为唯一的标记物使用(Einhom等，Obstet.Gynecol.8014-18(1992))。具体地说，在高达50％的早期卵巢癌患者的血清中未检测到CA125(Schapira等，Ann.Intern.Med.，118838-843(1993))。没有可靠的用于检测宫颈或子宫癌的血浆或血清标记物存在。而且，也没有有效的血清筛选试验用于检测乳腺癌的存在。CA125作为标记物使用的假阳性率结果，大约2％，导致每次早期癌症检测的大约100例假阳性结果(Jacobs等，BMJ，313(7069)1355-1358(1996)；Dorum等，E.J.Cancer 32A(10)1645-1651(1996)；Muto等，Gynecologic Oncol.51(1)12-20(1993)；Jacobs等，Lancet 1(8580)268-271(1988))。
为了早期检测癌症尤其是妇科癌症和乳腺癌、确定受试者的预后和监测受试者对这些癌症治疗的反应，需要更可靠的标记物来经济、快速地筛查受试者，以改善这些疾病患者的预后。
磷脂酰胆碱(PC)是多不饱和脂肪酸如花生四烯酸和亚油酸的主要来源之一。前者是具有多种生物活性的类花生酸的前体。PC水解产生溶血磷脂酰胆碱(LysoPC)和成分脂肪酸，其与信号转导有联系(Asaoka等，Proc.Natl.Acad.Sic.USA，904917-4921(1993)；Yoshida等，Proc.Natl.Acad.Sic.USA，896443-6446(1992))。不断增加的大量证据表明，以高浓度存在于氧化的低密度脂蛋白中的LysoPC (参见Steinberg等，Eng.J.Med.320915-924(1989))，可能在动脉粥样化形成和其他炎性疾病中起着重要的作用。例如，已报道LysoPC在培养的内皮细胞中增加基团编码血小板衍生生长因子A和B链以及肝素结合表皮生长因子-类蛋白(HB-EGF)的转录(Kume和Gimbrone，J.Clin.Invest.93907-911(1994))，并且在人单核细胞中增加mRNA编码HB-EGF(Nakano等，Proc.Natl.Acad.Sic.USA 911069-1073(1994))。这两种基因产物都是有效的平滑肌细胞和成纤维细胞的促有丝分裂剂(Higashiyama等，Science 251936-939(1991)；Ross，Nature(Lond.)362801-809(1993))。也已报道LysoPC在体外激活蛋白激酶C(Sasaki等，FEBS Letter 32047-51(1993))、增强人类T淋巴细胞的活化(Asaoka等，Proc.Natl.Acad.Sic.USA 896447-6451(1992))并且增强由膜渗透的二酰甘油或佛波酯诱导的HL-60细胞向巨噬细胞的分化(Asaoka等，Proc.Natl.Acad.Sic.USA 904917-4921(1993))。
LysoPC也可通过由溶血磷脂酶D水解(Tokumura等，Biochim.Biophys.Acta 87531-38(1986))提供生物活性溶血磷脂酸(LPA)的来源(参见Moolenaar等，Rev.Physiol.Biochem.Pharmacol.11947-65(1992))。卵巢癌激活因子(OCAF)已从卵巢癌腹水中分离出(Mills等，Cancer Res.481066(1988)Mills等，J.Clin.Invest.86851(1990)和美国专利号5,326,690及5,277,917)并且已证明是由LysoPA的多种形式组成(Xu等，Clin.Cancer Res.11223-1232(1995))。已证明LysoPA在卵巢癌患者的腹水中充当有效的肿瘤生长因子(Id.)。先前的研究集中在癌症患者的红细胞和血清中的总溶血磷脂酰胆碱(LysoPC)水平上，导致在乳腺癌患者中LysoPC没有改变的结论(Kal’nova，Vopr.Onkol.35(7)795-801(1989))。在关注于红细胞和全血的研究中观察到转移性乳腺癌患者的总溶血磷脂相对于总磷脂的比率是增高的。Damanskii，Vopr.Onkol.38(10)1194-202(1992)。这些研究没有评价特殊的溶血磷脂的水平，也没有进行脂肪酸成分的研究。进一步说，在乳腺癌患者或其他形式的癌症患者中，除了在未分离的血液和红细胞中之外，他们没有评价在血清、血浆、尿液或任何其它体液中的溶血磷脂。因此，从这些研究中不能得出癌症患者血浆/血清中特殊的溶血磷脂变化的结论或预言。
IV.本发明概述因此，本发明包含了诊断、判定癌症预后和监测癌症的方法，包括妇科癌症，如卵巢癌、子宫癌、输卵管癌和宫颈癌，以及其它癌症如乳腺癌，相对于未患癌症的正常受试者的溶血磷脂水平，这些癌症与受试者的某些溶血磷脂的浓度的改变有关。
所述方法通过检测得自受试者的体液样品中溶血磷脂的浓度来进行。这种检测方法可视为检测1)选择的特殊的溶血磷脂的浓度，如存在于受试者样品中的LysoPC或LysoPA；2)具有特殊的饱和或不饱和度脂肪酸和/或脂肪酸链长度(如棕榈酰-LysoPC或亚油酰(linoleoyl)-LysoPC)的选择的溶血磷脂亚型的浓度，或具有与甘油主链相连接的特殊的长链醇的亚型的浓度；3)存在于样品中的总溶血磷脂的浓度；4)得自受试者的单一样品中的第一种溶血磷脂的浓度，如LysoPC，随后检测另一种溶血磷脂的浓度，如LysoPA。采用本发明的方法同时或依次由单一样品进行不同的溶血磷脂的检测能改善癌症检测的灵敏性和/或特异性，减少假阴性或假阳性结果的发生。
此外，在得自受试者和正常人的样品中可以测定并比较构成特殊的溶血磷脂的脂肪酸的特殊成分的浓度比。
本发明是基于，至少部分基于这一发现，即在患有妇科癌症如卵巢癌和其他癌症的受试者的体液中，溶血磷脂，如LysoPC和LysoPA有改变。在本发明的方法中采用的优选的溶血磷脂具有甘油主链，其在sn-3位有磷酸酯或衍生的磷酸酯，如胆碱、肌醇、乙醇胺、甘油或丝氨酸，并且一条脂肪酸单链位于sn-1或sn-2位，通过酰基键与甘油主链连接，在其它的sn-1或sn-2位连有羟基。
或者，一条长链醇在sn-1位通过烷基或链烯基键与甘油主链连接，在sn-2位连有羟基。这些化合物具有下列通式结构sn-1溶血磷脂
sn-2溶血磷脂
其中X是任何脂肪酸或长链醇，包括但不限于180、160、181、182、204n-6和226n-3，通过酰基、烷基或链烯基键连接；R1是任何脂肪酸，包括但不限于棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、花生四烯酸和二十二碳六烯酸(docasahexanoic)，经由酰基键与所述磷脂的甘油主链连接。
R2可以是任何衍生的磷酸酯，包括但不限于氢、胆碱、肌醇、乙醇胺、甘油和丝氨酸。
使用本发明方法检测的溶血磷脂包括但不限于LysoPA、LysoPC、LysoPS、LysoPE、LysoPI和LysopG。
在关于受试者癌症预后的本发明的另一实施方案中，在患有癌症的受试者中以连续的时间间隔检测溶血磷脂的浓度，并比较不同时期这些化合物的浓度以判定所述癌症的预后以及治疗是否成功。对于某些癌症，在近期得自受试者的样品中溶血磷脂浓度的增加表明存活的肿瘤细胞数量的增加，而溶血磷脂浓度的减低表明存活的肿瘤细胞数量的下降。
在本发明方法的另一实施方案中，既可同时，也可依次对得自受试者的样品检测第一种类型的溶血磷脂和至少一种其它类型的溶血磷脂的浓度，以改进受试者中癌症检测的灵敏性和/或特异性。
在本发明的另一实施方案中，测定另外的癌细胞标记物如CA125的浓度，以进一步改进癌症检测的灵敏性和/或特异性。
在本发明的特别实施方案中，从得自受试者的血浆样品中检测LysoPC和/或LysoPA的浓度以诊断受试者中妇科肿瘤的存在。也可通过测定不同时间受试者样品中溶血磷脂浓度的变化率来进行诊断。
在本发明的另一实施方案中，通过首先测定受试者体液样品中特殊脂肪酸在溶血磷脂如LysoPC中的比率，并将这些脂肪酸的比率与未患癌症的正常受试者样品中的同样脂肪酸在溶血磷脂中的比率进行比较来诊断癌症。相对于正常样品中的脂肪酸在溶血磷脂中的比值，受试者样品中的脂肪酸在溶血磷脂中的比值的改变表明癌症的存在。如果受试者样品中的脂肪酸在溶血磷脂中的比值在一个特别范围内下降，则测定受试者样品中的不同脂肪酸在溶血磷脂中的比率并与正常样品中的同样脂肪酸在溶血磷脂中的比率比较。该第二个比值的改变也表明癌症的存在。在下述实施例中，使用测试样品中的脂肪酸在LysoPC中的比率来诊断乳腺癌。
另一个实施方案是诊断试剂盒，其包含检测溶血磷脂浓度的试剂并且任选包括抗-溶血磷脂抗体。
本发明的优点在于其能在早期检测与某些溶血磷脂存在有关的癌症，并且增加了检测的特异性和灵敏性，因此使改善受试者预后的早期介入变得容易。而且，本发明的方法能够减少检测乳腺癌的假阴性和阳性结果的数量。
V.图的简述
图1A-1C.图形描绘了对照受试者和癌症患者血浆中磷脂酰胆碱(PC)(1A)和LysoPC(1B)的浓度以及LysoPC/PC的比率(1C)。7例对照和17例卵巢癌患者的数据以均数±SE表示。与对照组相比，可观察到卵巢癌患者血浆的LysoPC浓度(**p＜0.01)和LysoPC/PC摩尔比(**p＜0.01)均有显著性差异。
图2.图形描绘了对照受试者和卵巢癌患者中血浆PC的脂肪酸成分(总脂肪酸的mol％)。(160＝棕榈酸；180＝硬脂酸；181＝油酸；182n-6＝亚油酸；204n-6＝花生四烯酸)。
图3.图形描绘了对照受试者和卵巢癌患者中血浆LysoPC的脂肪酸成分(总脂肪酸的mol％)。与对照组相比，卵巢癌患者的棕榈酸(160)(**p＜0.01)和硬脂酸(180)(***p＜0.001)浓度显著增高，而油酸(181)(*p＜0.05)和亚油酸(182n-6)(***p＜0.001)浓度较低。
图4.图形描绘了对照受试者和卵巢癌患者的血浆PC和LysoPC中的160(棕榈酸)/182n-6(亚油酸)的摩尔比。7例对照和17例卵巢癌患者的数据以均数±SE表示。可观察到病例中血浆LysoPC与血浆PC相比具有显著性差异(***p＜0.001)。
图5.图形显示了卵巢癌患者和对照者(“正常人”)中[LysoPC/PC]×[棕榈酰-LysoPC(160)/亚油酰-LysoPC(182n-6)]的值。垂直线表示7例对照和17例卵巢癌患者的均数±SE。与对照组相比，可观察到卵巢癌患者血浆中的值显著增高(***p＜0.001)。
图6.图形显示了卵巢癌患者和对照受试者血浆中的LysoPA的浓度。垂直线表示9例对照和52例卵巢癌患者的均数±SE。与对照组相比，可观察到卵巢癌患者血浆中的LysoPA的浓度显著增高(***p＜0.001)。
图7.图形描绘了与对照组相比，活动期疾病患者和静止期疾病患者血浆中LysoPA的浓度。左边3个直方条表示总LysoPA，右边3个直方条表示仅有多不饱和脂肪酸的LysoPA。直方条表示9例对照和52例卵巢癌患者的均数±SE。与静止期疾病患者相比或与对照组相比，可发现活动期疾病患者的LysoPA和含有饱和脂肪酸的LysoPA的浓度显著增高。
VI.本发明详述本发明提供筛查癌症的方法，所述癌症与受试者体液样品中的溶血磷脂的浓度改变有关，包括但不限于溶血磷脂酸(LysoPA)、溶血磷脂酰胆碱(LysoPC)、溶血磷脂酰丝氨酸(LysoPS)、溶血磷脂酰肌醇(LysoPI)、溶血磷脂酰乙醇胺(LysoPE)和溶血磷脂酰甘油(LysoPG)。该方法也包括筛查乳腺癌，通过比较受试者与正常人的溶血磷脂如LysoPC的脂肪酸成分的比率来确定乳腺癌的存在。所述受试者可以是非人类的动物，优选人类。
与这些溶血磷脂的浓度增加有关的癌症包括但不限于妇科肿瘤，包括卵巢、宫颈和子宫的肿瘤，以及其它癌症。某些癌症如白血病与这些溶血磷脂的浓度增加无关。因此，优选使本发明的方法用于癌症的检测，相对于在未患癌症的受试者(“正常受试者”)体液中所测到的浓度，这些癌症已知或已显示出与受试者体液中增高的溶血磷脂的浓度有关。
用于本发明方法中的化合物是具有甘油主链的溶血磷脂，其在sn-3位有磷酸酯或衍生的磷酸酯，如胆碱、肌醇、乙醇胺、甘油或丝氨酸，并且一条脂肪酸单链位于sn-1或sn-2位，通过酰基键与甘油主链连接，在其它的sn-1或sn-2位连有羟基。或者，一条长链醇在sn-1位通过烷基或链烯基键与甘油主链连接，在sn-2位连有羟基。
这些化合物具有下列通式结构sn-1溶血磷脂
sn-2溶血磷脂
其中X是任何脂肪酸或长链醇，包括但不限于180、160、181、182、204n-6和226n-3，通过酰基、烷基或链烯基键连接；R1是任何脂肪酸，包括但不限于棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、花生四烯酸和二十二碳六烯酸，经由酰基键与所述磷脂的甘油主链连接。
R2可以是任何衍生的磷酸酯，包括但不限于氢、胆碱、肌醇、乙醇胺、甘油和丝氨酸。
这些溶血磷脂在体外和体内同样具有对癌细胞促生长或信号活动的特性。例如，这种活动伴有胞质游离钙增加(Xu等，Clin.Cancer.Res.11223-1232(1995))，或其它信号通道的激活(Moolenaar，CurrentOpinion in Cell Biol.7(2)203-210(1995)；Moolenaar，J.Biol.Chem.270(22)12949-12952(1995)；Jalink等，Biochim.Biophys.Acta1198(2-3)186-196(1994)；和Xu等，Biochem.J.309933-940(1995)。
A.本发明的应用本发明的方法能够提供许多好处。首先，本方法为大量的受试者提供了一种快速和经济的筛查方法，有利于癌症的早期诊断并能导致癌症患者生活质量的改善和更好的存活率。
使用本发明的方法判断预后，医务人员能够决定患有早期癌症的受试者是否需要治疗或不需要治疗。这也能确定受试者可能不宜于特殊形式的治疗，如手术、化疗、放射或生物学治疗。这种信息能导致治疗方案的改善以获得更好的治疗反应，改善癌症患者的生活质量和存活率。
本发明的方法也可用于确定患者的治疗是否应由一种药剂改为另一种药剂。这就避免了需要“第二步查看(second look)”的侵害过程来决定患者对治疗的反应，并使特殊形式的治疗是否继续、终止或改变的决定变得容易。
因为在相当多数的进展期癌症患者中癌症将要复发，使用本发明的方法早期检测和定期连续监测，能在它们出现症状以前确定早期潜在的(即“隐藏的”)复发。本发明的方法对于这些目的的使用也能导致癌症患者治疗反应的改善、生活质量的改善以及存活率的改善。
此外，本发明的方法将使良性及恶性肿瘤的区分变得容易。使用如超声的方法或通过体检能最初查到位于器官如卵巢中的肿块。此后，可采用本发明的方法诊断癌症的存在。这就避免了外科干预的需要，并且/或者确定了连续的监测是合适的患者，导致癌症患者早期检测和存活的改善。
本发明方法的另一种应用是确定未知的原发肿瘤的来源。使用常规技术通常不能确定在腹腔和身体其它部分中的恶性肿瘤的起源组织。这种信息对指导医务工作者对肿瘤进行最合适的治疗是有用的。采用本发明的方法测定溶血磷脂和/或某些类型的溶血磷脂的浓度能提供关于肿瘤组织来源的信息。例如，升高的溶血磷脂浓度能够区别淋巴瘤和肠道肿瘤，这两种肿瘤具有比妇科肿瘤低的溶血磷脂浓度。
除了采用本发明的方法测定与癌症有关的溶血磷脂的浓度，也可检测其它的癌细胞标记物，包括但不限于CA125、Tac、可溶性IL2α受体、mCSF、OVX1、CEA、PSA、CA15-3、CA19.9，以改善癌症检测的灵敏性和/或特异性。
对增加灵敏性特别有用的检测方法是进行不同时间的溶血磷脂和其它癌症标记物浓度的检测，或以不同时间溶血磷脂的变化率为单位检测，以减少假阳性的结果。
而且，通过本发明方法测定的溶血磷脂浓度的信息，可为设立另外的方法提供建议，如超声、活组织检查、腹腔镜或外科手术、乳房X线照相、活组织检查或MRI(磁共振成像)的应用，以改善早期癌症的检测和大规模筛查受试人群癌症的存在。
就乳腺癌而言，本发明提供了一种预筛查的方法，在此方法中最初的阴性结果(即表示没有癌症)可以减少需要进一步侵入检查或需要如乳房X线照相或活组织检查的妇女的数量。
B.检测溶血磷脂和/或它们的成分脂肪酸以诊断癌症的方法本发明为诊断受试者癌症的存在提供了方法。在特别的实施方案中，本发明提供了一种检测受试者体液样品中增高的溶血磷脂酰胆碱(LysoPC)和溶血磷脂酸(LysoPA)浓度的方法。所述体液可以是血浆、血清、尿液、唾液、腹水、脑脊液或胸水。
本发明的方法进行如下。在脂质萃取和分析以后，测定如上述定义的溶血磷脂的浓度，或者通过如以下进一步描述的以抗体为基础的检测来测定溶血磷脂的浓度。所述检测方法可视为检测1)选择的特殊的溶血磷脂的浓度，如存在于受试者样品中的LysoPC或LysoPA；2)具有特殊的饱和或不饱和度脂肪酸和/或脂肪酸链长度(如棕榈酰-LysoPC或亚油酰-LysoPC)的选择的溶血磷脂亚型的浓度，或具有与甘油主链相连接的特殊的长链醇的亚型的浓度；3)存在于样品中的总溶血磷脂的浓度；4)得自受试者的单一样品中的第一种溶血磷脂的浓度，如LysoPC，随后检测另一种溶血磷脂的浓度，如LysoPA。采用本发明的方法同时或依次由单一样品进行不同的溶血磷脂的检测能改善癌症检测的灵敏性和/或特异性，减少假阴性或阳性结果的发生。
溶血磷脂的检测能作为浓度(即相对于样品液体体积而存在的溶血磷脂的量，如μmol/ml)来测定，或在标准化为受试者样品中其它化合物(包括其它的溶血磷脂、磷脂、白蛋白和肌酐)的浓度以后使用。
例如，检测具有特殊类型的饱和脂肪酸链(如硬脂酸或棕榈酸)的溶血磷脂如LysoPC的浓度，并与具有不同类型的脂肪酸链的溶血磷脂(如具有不饱和脂肪酸链如油酸和亚油酸的LysoPC)的浓度比较。然后采用样品中一种成分如磷脂酰胆碱(PC)的总量来标准化这些值。这种检测方法比仅测定总溶血磷脂如LysoPC而不考虑脂肪酸链类型的检测方法能提供更加特异或敏感的癌症存在的指标。然而，溶血磷脂的浓度能与相应的磷脂浓度比较，如样品中LysoPC的浓度能与PC的浓度相比较(参见以下实例和图1-5)。
起初，在没有癌症的受试者中测定溶血磷脂和/或特殊类型溶血磷脂的生理学(“正常”)浓度。随后，在受试者体液样品中检测溶血磷脂的浓度以筛查癌症并与已建立的正常受试者的浓度相比较。其中相对于正常浓度升高的溶血磷脂浓度，即可诊断为癌症存在。此外，如以上所详述的，所述浓度在标准化以后可与其它化合物的浓度相比较。
如以下所详述的，通过第一步萃取脂质可以检测受试者样品中溶血磷脂的浓度。然后采用标准方法，如气相层析HPLC、ELISA、NMR、使用酶的生化检测或其它方法来定量溶血磷脂的量。或者，也如以下所描述的，在以抗体为基础的检测中采用抗-溶血磷脂抗体来定量样品中存在的溶血磷脂。溶血磷脂的浓度相对于正常对照明显增高，如在正常以上一个或多个标准偏差，表示存在癌症。
作为另外的诊断工具，如以上所描述的，测定并标准化所选择的溶血磷脂类型的浓度。这些类型的浓度增高表示癌症的存在。这可增加检测的灵敏性和特异性。
采用本发明的方法测定溶血磷脂的浓度，可用于诊断和筛查患有癌症的受试者，以及判定患有癌症的受试者的预后。而且，通过测定不同时间受试者样品中溶血磷脂的浓度，可以监测癌症对治疗的反应。
此外，也可测定不同时间溶血磷脂浓度的变化率，并可提供更敏感或特异的癌症存在的指标。
能用多种方法进行癌症的诊断和预后评估。例如，本发明的体外诊断检测方法包括生物学样品中磷脂的检测，并因此可作为诊断或预后技术的部分使用，借此患者可测试出异常的溶血磷脂浓度。这种检测方法包括本领域中已熟知的技术，如气相层析、NMR和HPLC。例如，可使用萃取方法从测试的体液样品中萃取脂质，如通过引用结合到本文中的由Bligh和Dyer在Can.J.Biochem.Physiol.37911-917(1959)中所描述的那些方法。可使用薄层层析法分离各种磷脂，如通过引用结合到本文中的由Thomas和Holub在Biochim.Biophys.Acta，108192-98(1991)中所描述的。然后在平板上用紫外线使磷脂和溶血磷脂显影，如通过引用结合到本文中的由Gaudette等在J.Biol.Chem.26813773-13776(1993)中所描述的。通过从显影的磷脂中萃取来测定脂肪酸，并且可采用如气相层析(参见Skeaff和Holub，In M.Lagarde(ed.)，Biology ofEicosanoids，152卷，63-76页，Inserm，Paris(1987)，通过引用结合到本文中)、HPLC或NMR方法来定量脂肪酸。含有脂肪酸的溶血磷脂的浓度能够从由气相层析评估的脂肪酸含量中获得，并用内标如十七烷酸校准。或者，在从磷脂分离以后或作为磷脂的一部分，通过NMR或HPLC测定溶血磷脂浓度。
除了通过萃取直接测定溶血磷脂的浓度以外，在检测中也能采用抗体，如与溶血磷脂反应的单克隆抗体，以测定受试样品中溶血磷脂的浓度。例如，抗-磷脂抗体可使用标准方法标记并在检测中应用，检测方法包括固相和液相两种放射免疫测定(RIA)、荧光联接测定或酶联免疫吸附测定(ELISA)，其中抗体用于测定液体样品中溶血磷脂的存在(参见Uotila等，J.Immunol Methods 4211(1981))以及荧光技术(Sikora等，单克隆抗体，32-52页，Blackwell Scientific出版，1984年)。
在检测中用于测定溶血磷脂的针对溶血磷脂培育的单克隆抗体可按照已建立的方法生产，例如通过使用溶血磷脂、其碎片或其功能等同物免疫各种宿主动物来生产。该宿主动物包括但不限于兔、小鼠、大鼠、山羊等。根据宿主种类，可使用多种佐剂来增加宿主动物体内的免疫反应，包括但不限于弗氏(完全和不完全佐剂)、无机凝胶如氢氧化铝、表面活性物质如多聚醇、聚阴离子、肽、油乳剂、匙孔血蓝蛋白、二硝基苯酚以及有可能用于人类的佐剂如BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌。多克隆抗体是得自免疫动物血清的异源性抗体分子种群。
单克隆抗体，其是针对特殊抗原的同源性抗体种群，可以通过培养传代细胞系或应用噬菌体表型文库(display libraries)来提供抗体分子产生的任何技术获得。这些包括但不限于Kohler和Milstein的杂交瘤技术(Nature 356495-497(1975))、人类B-细胞杂交瘤技术(Kosbor等，Immunology Today 472(1983)；Cole等，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 802026-2030(1983))和EBV-杂交瘤技术(Cole等，单克隆抗体和癌症治疗，Alan R.Liss，Inc.，77-96页，1985年)。这种抗体可以是任何类型的免疫球蛋白包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD以及其任何亚型。杂交瘤产生的mAB可以在体外或体内培养。
可采用并通过已知技术生产识别特殊溶血磷脂的抗体片段。例如，这种片段包括但不限于能通过胃蛋白酶消化所述抗体分子产生的F(ab’)2片段，以及能通过还原F(ab’)2片段的二硫键产生的Fab片段。或者，构建Fab表达文库(Science 2461275-1281(1989))以便快速和方便地鉴别具有所需特异性的单克隆Fab片段。
用于上述检测的抗溶血磷脂抗体的制备方法已有描述，例如，产生磷脂酰肌醇和磷脂酸抗体的方法(参见Keating等，Biochem.J.317(Pt.3)643-646(1996)；Fukami等，Proc.Nat’l.Acad.Sic.USA859057-9061(1988)；Fukami等，Proc.Nat’l.Acad.Sic.USA85(23)9057-9061(1988)和Matuoka等，Science，239(4840)640-643(1988))。
在本发明的另一实施方案中，预先筛查受试者以检测癌症如乳腺癌。在受试者血清或其它体液样品中测定特殊溶血磷脂如LysoPC的脂肪酸成分。将溶血磷脂中特殊脂肪酸的比率如棕榈酸亚油酸(160/182n-6)与得自正常受试者(即未患乳腺癌)样品的同样脂肪酸的比率相比较。受试者的比率与正常受试者比率的比值明显改变表明癌症的存在。优选确定一个测试样品比率的“截断值”，在该值以上的样品定为癌症阳性。在以下特殊实施方案中，从数据建立了至少3.5的截断值。更优选确定一个测试样品比率的较低值，以使在这一低值和高值之间限定的范围构成“需要进一步测试”的结果。如果在特殊溶血磷脂如LysoPC中脂肪酸的比率降低至该范围内，则需进行第二项测试，即在原测试样品中测定同样的溶血磷脂中不同脂肪酸的比率与同样的溶血磷脂中这些脂肪酸的比率的比值。如果测试样品的第二个比率的比值超过了第二个截断值，那末该受试者就定为患有癌症(并且，例如需要进一步筛查如乳房X线照相)。在以下特殊实施例中，采用1.00的截断值指示乳腺癌的存在。这种溶血磷脂如LysoPC中脂肪酸比率的两步分析提供了较高的灵敏性和较低的假阴性和假阳性结果。具体地说，本方法可减少需要如乳房X线照相等方法来确定乳腺癌存在的人数，节约开支，方便可行。
C.监测患有癌症的受试者的方法本方法也提供了随访癌症患者的方法。例如，测定癌症患者体液样品中溶血磷脂如LysoPC的浓度。在较后时间，测定溶血磷脂的浓度并与该患者较早时期测定的浓度比较。如果溶血磷脂的浓度随时间增加，则可能表明存活的肿瘤细胞的数量增加，因此存在于患者体内的癌症也增加。相反，如果溶血磷脂的浓度降低，则可能表明癌症存在的减少。
此外，每个样品可进行多个类型的溶血磷脂如LysoPA的测定。这些检测能为医务工作者提供信息以调整治疗，改变、停止或开始使用某种治疗药剂或方法，以改善患者的预后和存活。
D.诊断试剂盒此处描述的用于检测受试者体液样品中溶血磷脂浓度的方法也可通过，例如，采用预先包装的诊断试剂盒进行。这种试剂盒包括测评溶血磷脂浓度的试剂，例如，从多种液体样品中萃取脂质的试剂。该试剂包括辅助试剂如缓冲剂，以及在转运或储存样品时抑制随后溶血磷脂生成或水解的试剂如EDTA。或者，该诊断试剂盒包括标记的抗体试剂如抗-溶血磷脂抗体，或抗体组合物，其可在比如临床检测中方便地使用，以诊断癌症患者。该试剂盒也可包括实施本发明方法和/或将样品转送到诊断实验室处理的装置或容器，以及进行本发明方法的合适的指示。
给出以下实施例来演示本发明的方法并帮助普通技术人员采用这些方法。所述实施例并不意味着以任何方式限制本说明书的范围或由Letters Patent授予的保护。
VII.实施例卵巢癌患者血浆中LYSOPC和其成分脂肪酸的检测A.实验对象本实施例包括允许进入多伦多综合医院的17例诊断患有卵巢上皮癌的受试者，年龄为36到74岁(平均55岁)。这些受试者中有7例诊断为活动期疾病。9例受试者在测试期间接受以顺铂为基础的化疗。也包括用于对比的6例患有活动期白血病的受试者，他们在M.D.Anderson癌症中心(Houston，Texas)处于化疗的周期之间。对照受试者是7例健康妇女，年龄为46到63岁(平均52岁)。
B.血浆样品血液(7ml)被抽进含有EDTA的真空容器(vacutainers)(BectonDickinson和Company，Rutherford，New Jersey)中并分离血浆(1，600xg，15分钟)。该血浆在-20℃保存并在7天内测试。
C.脂质萃取和磷脂分析通过有某些修改的Bligh和Dyer在Can.J.Biochem.Physiol.37911-917(1959)中的方法(通过引用结合到本文中)来萃取血浆脂质。向每个0.5ml的血浆样品中加入3.75ml氯仿/甲醇(1∶2v/v)，并将该内容物涡流1分钟。在大部分血浆蛋白离心成团以后，将氯仿/甲醇萃取物转移到新的试管中并用1.25ml氯仿完全混合。加入1.75ml H2O，将该内容物短暂涡流，通过离心完成各层的分离。在除去较低的氯仿层(第一份萃取物)以后，将2.5mI氯仿和63μl浓HCl加入到余下的含水相中。离心以后收集氯仿层(第二份萃取物)。在氮气下浓缩第一份和第二份(酸化的)氯仿萃取物并在硅胶板(硅胶60)(EM Science，Gibbstown，New Jersey)上点样。按照Thomas和Holub(Biochim.Biophys.Acta，108192-98(1991)，通过引用结合到本文中)的方法，通过双相TLC分离磷脂[相1氯仿/甲醇/14.8N氢氧化铵65∶35∶5.5(v/v/v)和相2氯仿/甲醇/88％甲酸/水55∶28∶5∶1(v/v/v/v)]。在两次层析步骤之间，于氮气下将TLC板在40℃干燥30分钟。通过用0.1％8-苯胺基-1-萘-磺酸(ANS)(Sigma，St.Louis，Missouri)水溶液喷洒该板并在紫外线下观察来检测磷脂(Gaudette等，J.Biol.Chem.，26813773-13776(1993))。将相对于PC和LysoPC的斑点从板上刮下，并使用2ml乙酰氯/甲醇5∶50(v/v)于85℃在硅胶存在下甲基转移2小时。采用已知量的十七烷酸(17∶0)作为内标。在甲基转移作用以后，用石油醚萃取脂肪酸甲酯，并如前所述采用5890A型气相层析仪(Hewlett Packard，Wilmington，Delaware)定量(Skeaff和Holub，In M.Lagarde，(ed)，Biology of Eicosanoids，152卷，63-76页，Inserm，Paris(1987)，通过引用结合到本文中)。此处给出的PC和LysoPC的浓度是通过气相层析(GC)测评由脂肪酸内容物获得，并用十七烷酸校准。
通过Student’st-检验分析数据，当p＜0.05时表示显著性差异。
D.结果1.血浆PC和LysoPC浓度尽管卵巢癌受试者的血浆PC浓度(1.08±0.07μmol/ml，均数±SE)比正常对照(1.26±0.17μmol/ml)平均低14％，但差异并不显著(p＜0.2)(图1A)。相反，卵巢癌受试者的血浆LysoPC浓度比对照组明显增高(平均43％；p＜001)(图1B)。对照组和卵巢癌受试者的对应的值是125.6±7.1nmol/ml(均数±SE)和179.7±10.0nmol/ml。卵巢癌患者的LysopC对PC的摩尔比率(0.17±0.01，均数±SE)与对照受试者(0.11±0.02)相比也显著增高(图1C)。
在对照和卵巢癌受试者两组中有分别超过98％和88％的由本方法获得的总血浆PC和LysoPC被萃取到第一次氯仿中(中性萃取物)。尽管在总血浆PC中仅占很少量，但是可观察到卵巢癌受试者血浆的酸化萃取物比正常对照者显著增多(21.6对14.4nmol/ml；p＜0.05)。
2.血浆PC和LysoPC的脂肪酸成分血浆PC的脂肪酸成分在对照组和卵巢癌患者之间没有显著性差异(图2)。相反，按照总脂肪酸的mol％，卵巢癌受试者的血浆LysoPC含有比对照组显著增高的棕榈酰-和硬脂酰-LysoPC浓度以及较低的油酰-及特别是亚油酰-LysoPC浓度(图3)。卵巢癌受试者中血浆棕榈酰-对亚油酰-LysoPC的摩尔比率(5.3±0.3，均数±SE)比对照组(3.0±0.4)显著增高(图4)。
3.血浆棕榈酰-LysoPC对亚油酰-LysoPC浓度摩尔比率的比较作为卵巢癌指标的可能性与正常对照组相比，尽管卵巢癌受试者中血浆LysoPC浓度(图1B)和LysoPC(图1C)及棕榈酰-LysoPC/亚油酰-LysoPC(图4)的摩尔比率显著增高；分别为p＜0.01，p＜0.01和p＜0.001，但是某些从受试者获得的数据与对照组仍有重叠。因此，计算[LysoPC/PC摩尔比率]×[棕榈酰-LysoPC/亚油酰-LysoPC摩尔比率]的值。对照组的值(0.324±0.054，均数±SE)与卵巢癌受试者(0.928±0.092，均数±SE)相比较。如图5所示，卵巢癌受试者的平均值比对照组显著增高(p＜0.001)。进一步说，17例受试者中有15例具有比对照组的均数±1SD(0.0450)高的值，以及17例受试者中有13例具有比对照组的均数±2SD(0.596)高的值。
VIII.实施例卵巢癌患者血浆中LYSOPA和其成分脂肪酸的检测A.实验对象和血浆样品从Toronto医院妇科肿瘤门诊部连续收集52例卵巢癌患者的血样。血样被收集在含有EDTA的试管中以减少溶血磷脂或磷脂的代谢或产生。从9例健康志愿者获取正常样品作为对照。如上所述离心样品除去血小板和其它血液成分，并在-20℃冷冻血浆。如以下所述，测试血浆的LysoPA和其它的溶血磷脂。以临床发现为基础评估患者存在活动期或静止期疾病。
B.LysoPA纯化如以上关于LysoPC所描述的方法纯化LysoPA，但是仅测试酸化的氯仿萃取物或第二次酸化的氯仿萃取物。
C.LysoPA脂肪酸分析使用2ml乙酰氯/甲醇5∶50(v/v)在85℃于硅胶存在下将由TLC溶解的LysopA甲基转移2.5小时。采用十七烷酸(17∶0)作为内标。如Skeaff和Holub(Skeaff和Holub，InM.Lagarde(ed.)，血液和血管细胞中类二十烷酸及相关物质的生物学，152卷，63-76页，Inserm，Paris(1987)，通过引用结合到本文中)所描述的，在甲基转移作用以后，用石油醚萃取脂肪酸甲酯，该脂肪酸甲酯得自LysoPA中包含的脂肪酸，并通过在5890A型气相层析仅(Hewlett Packard，Wilmington，Delaware)上气相层析(GC)定量。此处给出的所有LysoPA的浓度是通过GC测评由脂肪酸内容物获得，并用十七烷酸校准。
D.结果本实施例表明，与正常受试者相比卵巢癌患者的总LysoPA浓度显著升高(如图6所示)。然而，当评定得自图6所示的患者的血浆样品是否存在活动期或静止期疾病时，总LysoPA和具有多不饱和脂肪酸的LysoPA的量比正常受试者血浆中这些化合物的相同物质浓度明显增高。如图7所示，在某些静止期疾病患者中具有多不饱和脂肪酸链的LysoPA的浓度是增加的。由于卵巢癌常常复发，这些结果可以反映患者通过临床分析所不能检测到的潜藏的肿瘤的存在。
E.讨论溶血磷脂(LPAs)，如LysoPC和LysoPA是人类血浆的正常成分。血浆中大部分的LysoPC与白蛋白结合(Skipski等，Biochem.J.104(2)340-52(1967))。健康个体的血浆中LysoPC的绝对浓度在各研究之间有相当大的变化(Skipski等，supra；Philips和Dodge，J.LipidRes.8676-681(1967)；Gillet和Besterman，Atherosclerosis 22111-124(1975)；Kriat等，J.Lipid Res.341009-1019(1993))。这种可变性似乎反映了研究人群之间总的血浆脂质含量的不同，因为当以总的血浆磷脂的百分比来表示时，始终观察到LysoPC以大约6.5％的比率存在。在健康对照者中血浆LysoPC的估计值(假定PC占总血浆磷脂的68％；Skipski等，supra；Gillett和Besterman，supra)是总磷脂的7.5±1.0％(均数±S.E.)，该值通常与以前文献报道的值相一致。在本研究中适度升高的值反映了第二个酸化萃取步骤的应用，在该步骤中获得大约总LysoPC的12％。相比而言，LysoPC以总磷脂的11.8±0.8％存在于卵巢癌患者的血浆中。并且，LysoPA以总磷脂的0.05％存在于卵巢癌患者的血浆中。在相应的LysoPC的基础上，与健康对照相比，卵巢癌患者血浆中棕榈酰和硬脂酰-LysoPC种类增加，油酰和亚油酰-LysoPC种类降低，而花生四烯酰-LysoPC不变。
从这些实施例的结果明显看出，与正常对照的血浆相比，卵巢癌患者血浆中LysoPA，特别是具有多不饱和脂肪酸的LysoPA的浓度是升高的。LysoPA，特别是具有多不饱和脂肪酸的LysoPA的浓度的升高，在患有活动期疾病的个体中更显著，该活动期疾病既可通过腹水的存在、疾病的X线照片证据也可通过体检来确定。在显著比例的卵巢癌患者中，从显示LysoPA浓度升高的散布区域(图6)可看出这种增高是明显的。当患者被分为当前活动期疾病和当前非活动期疾病时，这种增高更明显(图7)。显著比例(大约50％)的那些患有非活动期或静止期疾病的受试者将在两年内复发。这可通过图7中所示的增高的LysoPA浓度，特别是具有多不饱和脂肪酸的LysoPA的浓度来表明。因此，检测血浆中LysoPA的浓度，特别是具有多不饱和脂肪酸的LysoPA的浓度可为指示治疗反应以及复发的早期检测提供一种方法。假定在进行治疗的患者或静止期疾病患者中检测CA125的浓度能被推断为诊断前患者的研究项目，这些结果表明，检测LysoPA的浓度，特别是具有多不饱和脂肪酸的LysoPA的浓度将提供足够的灵敏性和特异性，可用于早期筛查患有卵巢癌受试者的本发明的方法中。
LysoPA浓度，特别是具有多不饱和脂肪酸的LysoPA的浓度的检测，既可单独使用，也可与研究的多种标记物结合使用，包括但不限于LysoPC、其它溶血磷脂、CA125、mCSF、TAC、可溶性IL2α受体和其它已知和未知的标记物，为早期卵巢癌的检测提供高度的灵敏性和/或特异性。
上述结果表明溶血磷脂水平的检测能在早期、可治愈阶段鉴别癌症患者。溶血磷脂的水平也能提供一种诊断标记物或确定患者对特殊形式治疗的可能的反应。而且，这种测定有助于为个体患者制定治疗方案，并能在以前治疗的患者中鉴别疾病的复发。
然而并不希望受任何特别的理论束缚，可能是在某些癌症中LysoPC和LysoPA产生的增加引起这些脂质的血浆和血清浓度的升高。然而引起卵巢癌患者血浆中LysoPC和LysoPA升高的来源和机制并不清楚，申请人则认为卵巢癌细胞可能是增加的溶血磷脂的来源。增高的磷脂酶A1(PLA1)或PLA2或PLD活性与本实施例中所观察到的LysoPC和LysoPA的血浆浓度的升高相一致。由于PLA2从PC的sn-2位上解离脂肪酸生成主要含有饱和脂肪酸的LysoPC，这就可以解释饱和型的LysoPC(棕榈酰和硬脂酰)增加。由于PLA1从sn-1位上解离脂肪酸，这就可以解释LysoPA主要具有不饱和脂肪酸(亚油酰、花生四烯酸、DHA)。这暗示了磷脂酶的作用，即，当主要含有饱和脂肪酸的LysoPC增加时，是磷脂酶A2(PLA2)的作用，而当含有不饱和脂肪酸的LysoPA增加时，则是PLA1的作用。PLD可能在LysoPC、LysoPS、LysoPI、LysoPE和LysoPG向LysoPA的转化中起作用。PLD的功能活性有可能改变存在于血清或血浆中的LysoPC的水平。在卵巢癌患者中，PLD活性的降低能导致LysoPC水平的增高。
已提出LysoPC和LysoPA能从许多细胞系中激活细胞。以上实施例证明，相对于正常对照来说，卵巢癌患者血浆中LysoPC和LysoPA浓度显著增高。这种现象似乎并非是所有癌症所共有的，比如6例测试的白血病患者中有5例的血浆LysoPC水平比正常对照样品明显降低(低于正常的一半)。在卵巢癌患者的血浆中，棕榈酰-和硬脂酰-LysoPC种类的百分比显著升高，而油酰，特别是亚油酰-LysoPC比对照受试者显著降低。与对照受试者相比，卵巢癌患者血浆中LysoPC/PC和棕榈酰-LysoPC/亚油酰-LysoPC的摩尔比率也显著升高。此外，与对照组相比，患者血浆[LysoPC/PC]×[棕榈酰-LysoPC/亚油酰-LysoPC]的计算值也显著升高。最后，卵巢癌患者血浆中LysoPA和具有多不饱和脂肪酸的LysoPA的浓度也较高。这些值可作为指标用于卵巢癌患者的早期诊断、预后判断和治疗监测。
IX.实施例确诊患有乳腺癌疾病的患者血清中LYSOPC的脂肪酸成分的变化A.实验对象在MD Anderson癌症中心(Houston，Texas)就诊的23例确诊患有乳腺癌的患者(采血样前平均已确诊6.9年)提供了分析用的血样。采用在Guelph大学(Guelph，Ontario，加拿大)进行营养/锻炼研究的24例健康妇女作为对照受试者。乳腺癌患者的平均年龄为59岁(范围30-77)，而对照受试者为36岁(范围27-55)。
B.血清样品将血液(7ml)抽进不含抗凝剂的真空容器中，并在室温放置20分钟使其发生凝结。通过离心(1600xg，15分钟)分离血清并储存在-20℃直至分析。
C.脂质萃取和磷脂分析如上述实施例中所描述的进行脂质萃取和磷脂分析，但是按照Holub和Skeaff在Methods Enzymol.141234-244(1987)中描述的方法(通过引用结合到本文中)，通过单相层析使用氯仿/甲醇/冰乙酸/水50∶37.5∶3.5∶2 v/v/v/v溶剂系统来分离磷脂。
从板上刮下对应于PC和LysoPC的带，并在甲醇中使用2ml浓硫酸于85℃在硅胶存在下甲基转移3小时。
D.结果
LysoPC/PC的比率在对照组和乳腺癌组之间非常相似(分别为0.093±0.004和0.106±0.005)。两组间LysoPC的脂肪酸成分不同。特别是，160与182n-6(棕榈酸与亚油酸)的比率在对照组(2.32±0.13)和乳腺癌组(5.48±0.30)之间有显著性差异(p＜0.01)。设定3.50的值作为该比率的“截断点”，这样如果测试的受试者的样品提供了一个至少3.50的160/182n-6的值，则认为他们患有乳腺癌。如果测试的受试者的样品提供了一个低于3.5的该比率的值，则认为她没有乳腺癌。在本实施例中，2/23或8.7％的受试者为假阴性(即患有乳腺癌但不超过截断点，并因此归为没有乳腺癌的一类)。未发现有假阳性。
在本实施例中，通过建立一个从3.00到3.50的160/182n-6比率值的范围，可进一步精拣这些结果。具有降低到这一范围的值的测试样品可受益于第二个试验，该试验测定受试样品中的LysoPC中不同的脂肪酸成分的比率，并与得自对照受试者的值相比较。在本实施例中，对一例癌症患者和四例对照受试者进行了脂肪酸181/182n-6(油酸/亚油酸)的比率值的测定，这些样品所得到的脂肪酸160/182n-6的值均降至所述范围内。对于第二个比率，则建立了1.0的截断值(即至少1.0的比率才表示乳腺癌的存在)。使用这一试验，假阴性的数量减至1或4.3％，而假阳性率仍为0。
这些结果证明，通过分析血清溶血磷脂如LysoPC的脂肪酸成分并将得自该受试者的值与得自对照受试者的值相比较，在确诊患有疾病的受试者中检测乳腺癌的存在是可能的。附加的第二个试验(即从脂肪酸成分的不同组合得到的第二个比率)增加了本方法的整体检测能力。
X.实施例新近诊断患有乳腺癌的妇女血清中LYSOPC的脂肪酸成分的变化A.实验对象最近诊断患有乳腺癌的15例妇女在外科手术前采取血样，并将血清送到Sante Publique du Quebec中心(Beauport Quebec)。15例没有癌症的年龄相当的女性对照受试者同样采集血清样品送往该中心。受试者的平均年龄为54岁(范围32-73)。
如上述实施例8所描述的进行血清样品和脂质萃取以及磷脂分析。
B.结果尽管有关LysoPC的量在癌症受试者和正常受试者之间未观察到不同，但血清LysoPC的脂放酸成分则不同。癌症受试者中160/182n-6的比率(4.62±0.35)与对照组(2.94±0.32)相比显著增大(p＜0.05)。采用LysoPC中的160/182n-6为3.50的截断值(即需要至少3.5的值来表示乳腺癌的存在)，通过本试验15例乳腺癌受试者中有4例被错误确定为没有乳腺癌(假阴性率＝26.7％)。15例中有2例被错误确定为患有乳腺癌(假阳性率＝13.3％)。对于160/182n-6的值降至3.00到3.50范围内的样品采用第二个试验，测定LysoPC中181/182n-6的值，并确定截断点为至少1.00，假阴性率则减少至0(所有LysoPC的160/182n-6比率在3.00至3.50的范围内的四例受试者，其LysoPC的181/182n-6比率均大于1.00)。假阳性的数量增至十五分之三或20％。
这些结果表明，本发明的方法在新近诊断患有疾病的患者(即转移前的大部分病例)中能检测出乳腺癌的存在。这就允许在进一步采用侵入性方法以前，筛查可能有乳腺癌存在的妇女人群。
在这些检测乳腺癌的实施例中，采用乳腺癌受试者和正常受试者可获得的数据建立截断点和脂肪酸的比率值的范围，据此进一步测试样品以确定另外的患有癌症的受试者。溶血磷脂如LysoPC中脂肪酸的特殊组合的截断点可以由得自正常受试者和那些新近诊断患有乳腺癌的受试者的另外的数据建立。选择所述截断点以使假阴性结果减至最少(例如低于10％)而不产生不能接受的水平的假阳性结果(例如大于30％)。也即，测定所述截断点，以使降至截断点以下并因此鉴定为没有癌症的癌症患者的数量减至最少，并且也使在截断点以上但却没有癌症的受试者的数量减至最少。除了将受试者的LysoPC中两种脂肪酸的比值与正常受试者的LysoPC中这些脂肪酸的比值相比较，还能将脂肪酸的一种组合的比值与脂肪酸的第二种组合的比值相比较。此外，在本实施例中采用LysoPC中脂肪酸的特殊组合形成用于比较的比率，即160/182n-6和181/182n-6，其它脂肪酸的组合也可用于该比率。可通过测定脂肪酸来选择另外的脂肪酸组合，与正常样品中这些同样的脂肪酸的量相比，该脂肪酸在乳腺癌样品中是以变化的量存在。
此处引用的各种出版物通过全篇参考结合到本文中。
如本领域中从事本发明的技术人员所理解的，本发明可以以不同于以上那些特别公开的而又不违反本发明的精神或潜在特性的形式来表达。因此，以上所述的本发明的具体实施方案无论从那一方面来看均认为是说明性的而不是限制性的。本发明的范围显示在所附的权利要求和其等同条款中，而不限于前述中所包含的实施例。
权利要求
1.在受试者中检测与溶血磷脂浓度改变有关的癌症存在的方法，包含测定得自所述受试者的体液样品中溶血磷脂的浓度，并且将该溶血磷脂浓度与没有癌症的正常受试者样品中的溶血磷脂浓度相比较，凭借所述受试者样品中溶血磷脂的浓度相对于正常受试者样品中溶血磷脂浓度的改变来指示癌症的存在。
2.权利要求1的方法，该方法进一步包括测定样品中至少一种其它类型的溶血磷脂浓度的步骤。
3.权利要求1的方法，该方法进一步包括测定样品中所述溶血磷脂亚型浓度的步骤。
4.权利要求3的方法，其中所述方法进一步包括在受试者样品中检测棕榈酰-X、硬脂酰-X、油酰-X、亚油酰-X、花生四烯酰-X和二十二碳六烯酰-X酯肪酸浓度的步骤，此处X选自LysoPC、LysoPA、LysoPS、LysoPI、LysoPE和LysoPG溶血磷脂，并将所述浓度与对照浓度比较。
5.权利要求4的方法，该方法进一步包括测定样品中棕榈酰-X对亚油酰-X的摩尔比值，并将所述比率与对照比率比较。
6.权利要求4的方法，该方法进一步包括测定受试者样品中[X/PC]×[棕榈酰-X/亚油酰-X]的值，并将所述值与对照值比较。
7.权利要求1的方法，该方法进一步包括测定受试者样品中其它的癌细胞标记物浓度的步骤。
8.权利要求7的方法，其中所述其它的癌细胞标记物选自CA125、Tac、可溶性IL2α受体、mCSF、OVX1、CEA、PSA、CA15-3和CA19.9。
9.权利要求1的方法，其中所述癌症是选自卵巢癌、输卵管癌、子宫癌、腹膜内癌(intraperitoneal carcinomatosis)和宫颈癌的妇科癌症。
10.权利要求1的方法，其中所述测定溶血磷脂浓度的步骤包含将所述样品与抗-溶血磷脂抗体接触以结合溶血磷脂，并检测所述结合的抗体。
11.权利要求1的方法，该方法进一步包括测定样品中所述溶血磷脂的脂肪酸成分和溶血磷脂的所述脂肪酸浓度的步骤。
12.权利要求1的方法，其中所述溶血磷脂是具有甘油主链的sn-1或sn-2溶血磷脂，其在sn-3位有磷酸酯或衍生的磷酸酯，并于sn-1或sn-2位有一条通过酰基键连接的脂肪酸单链，而且有一个羟基位于其它的sn-1或sn-2位。
13.权利要求1的方法，其中所述溶血磷脂是具有甘油主链的sn-1溶血磷脂，其在sn-3位有磷酸酯或衍生的磷酸酯，并于sn-1位有一条通过烷基或链烯基键连接的长链醇位，而且有一个羟基位于sn-2位。
14.权利要求12或13的方法，其中所述溶血磷脂具有下列通式结构.sn-1溶血磷脂
sn-2溶血磷脂
其中X是一条单链脂肪酸或长链醇，R1是一条单链脂肪酸，并且其中R2是衍生的磷酸酯。
15.权利要求14的方法，其中X选自180、160、181、182、204n-6和226n-3。
16.权利要求14的方法，其中R1选自棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、花生四烯酸和二十二碳六烯酸。
17.权利要求14的方法，其中R2选自氢、胆碱、肌醇、乙醇胺、甘油和丝氨酸。
18.权利要求1的方法，其中所述溶血磷脂选自LysoPC、LysoPA、LysoPS、LysoPE、LysoPI和LysoPG溶血磷脂。
19.权利要求1的方法，该方法进一步包括测定具有特殊的饱和或不饱和度脂肪酸和/或脂肪酸链长度的溶血磷脂的浓度的步骤。
20.权利要求1的方法，该方法进一步包括测定具有特殊的长链醇的溶血磷脂的浓度的步骤。
21.权利要求1的方法，其中所述样品选自血浆、血清、尿液、唾液、腹水、脑脊液和胸水。
22.权利要求1的方法，其中相对于没有癌症的正常受试者的样品而言，所述癌症伴有受试者中增高的溶血磷脂浓度的存在。
23.在得自受试者的体液样品中检测癌症存在的方法，该方法包括含以下步骤(a)测定所述受试者体液样品中的溶血磷脂的浓度；(b)测定所述受试者样品中的所述溶血磷脂的脂肪酸浓度；和(c)将步骤a和b中获得的值与得自对照组的值相比较，凭借步骤a和b中获得的值相对于得自对照组的值的改变来指示癌症的存在。
24.权利要求23的方法，其中所述浓度被标准化为选自其它溶血磷脂、磷脂、白蛋白和肌酐的化合物的浓度。
25.权利要求23的方法，其中所述溶血磷脂选自LysoPC、LysoPA、LysoPS、LysoPE、LysoPI和LysoPG溶血磷脂。
26.权利要求23的方法，其中所述癌症是妇科癌症。
27.权利要求23的方法，其中所述癌症是乳腺癌。
28.权利要求1的方法，其中所述溶血磷脂的浓度以连续的时间间隔测定，以确立溶血磷脂浓度随时间而改变的比率。
29.监测受试者中不同时期癌症存在的方法，包括a)首次测定得自所述受试者的体液样品中的溶血磷脂的浓度；b)在以后时间测定得自所述受试者的体液样品中的溶血磷脂的浓度；和c)比较步骤a和b中获得的浓度，以决定在以后时间得自所述受试者的样品中溶血磷脂的浓度相对于首次得自所述受试者的样品中溶血磷脂的浓度是否增高或降低，来检测癌症的存在。凭借在所述以后时间的样品中溶血磷脂浓度的增高来指示存活肿瘤细胞的数量的增加，而该溶血磷脂浓度的降低则指示存活肿瘤细胞的数量的减少。
30.权利要求29的方法，其中所述肿瘤是选自卵巢癌、输卵管癌、子宫癌、腹膜内癌和宫颈癌的妇科癌症。
31.权利要求29的方法，其中所述肿瘤是乳腺癌。
32.权利要求29的方法，其中所述测定溶血磷脂浓度的步骤包括将所述样品与抗-溶血磷脂抗体接触。
33.权利要求29的方法，该方法进一步包括测定样品中所述溶血磷脂的脂肪酸成分和溶血磷脂的所述脂肪酸浓度的步骤。
34.权利要求29的方法，该方法进一步包括测定具有特殊的长链醇的溶血磷脂的浓度的步骤。
35.权利要求29的方法，其中所述溶血磷脂是具有甘油主链的sn-1或sn-2溶血磷脂，其在sn-3位有磷酸酯或衍生的磷酸酯，并于sn-1或sn-2位有一条通过酰基键连接的脂肪酸单链，而且有一个羟基位于其它的sn-1或sn-2位。
36.权利要求29的方法，其中所述溶血磷脂是具有甘油主链的sn-1溶血磷脂，其在sn-3位有磷酸酯或衍生的磷酸酯，并于sn-1位有一条通过烷基或链烯基键连接的长链醇，而且有一个羟基位于sn-2位。
37.权利要求29的方法，其中所述溶血磷脂选自LysoPC、LysoPA、LysoPS、LysoPE、LysoPI和LysoPG溶血磷脂。
38.在受试者中检测妇科癌症的方法，包括测定得自所述受试者的体液样品中溶血磷脂的浓度，并且将该溶血磷脂浓度与没有癌症的正常受试者样品中的溶血磷脂浓度相比较，凭借所述受试者样品中溶血磷脂的浓度相对于正常受试者样品中溶血磷脂浓度的增加来指示妇科癌症的存在。
39.在受试者中检测癌症的方法，包括在得自受试者的体液样品中测定溶血磷脂中的脂肪酸的浓度比值，并与得自没有癌症的正常受试者样品中的溶血磷脂中相同脂肪酸的浓度比值相比较，凭借受试者样品中的比值相对于正常受试者样品中的比值的改变来指示癌症的存在。
40.权利要求39的方法，其中所述改变是增高。
41.权利要求40的方法，其中所述癌症是乳腺癌，并且所述溶血磷脂是LysoPC。
42.权利要求40的方法，其中在所述受试者样品中的LysoPC中脂肪酸的所述浓度比值至少是3.4。
43.权利要求41的方法，其中所述LysoPC中的所述脂肪酸是棕榈酸和亚油酸。
44.权利要求41的方法，其中当所述受试者样品中的LysoPC中脂肪酸的所述浓度比值小于3.4而大于3时，测定所述体液样品中的LysoPC中不同脂肪酸的比值，凭借至少1个所述不同脂肪酸的比值来指示乳腺癌的存在。
45.权利要求44的方法，其中所述脂肪酸是油酸和亚油酸。
46.权利要求39的方法，其中所述癌症是选自卵巢癌、输卵管癌、子宫癌、腹膜内癌和宫颈癌的妇科癌症。
47.权利要求39的方法，其中所述溶血磷脂选自LysoPC、LysoPA、LysoPS、LysoPE、LysoPI和LysoPG溶血磷脂。
48.权利要求38的方法，其中所述溶血磷脂的浓度以连续的时间间隔测定，以在所述受试者中确立溶血磷脂浓度随时间而改变的比率。
49.在得自受试者的体液样品中测定溶血磷脂浓度的诊断试剂盒，以检测受试者相对于没有癌症的正常受试者，其与溶血磷脂浓度改变有关的癌症，所述试剂盒包含检测得自受试者的体液样品中的溶血磷脂浓度的试剂。
50.权利要求49的诊断试剂盒，其中所述试剂包括抗-溶血磷脂抗体。
51.权利要求49的诊断试剂盒，其进一步包括在转运或储存期间抑制样品中溶血磷脂的产生或水解的试剂。
全文摘要
本发明是在受试者中检测癌症存在的方法,通过测定得自受试者的体液样品中溶血磷脂的浓度,并将这些浓度与得自没有癌症的正常受试者的样品中存在的浓度相比较,观察溶血磷脂水平的改变来指示癌症是否存在。该方法可用于受试者中癌症如妇科癌症和乳腺癌的诊断和预后判断,并能监测不同时期的治疗效果。
文档编号G01N33/574GK1269014SQ98805125
公开日2000年10月4日 申请日期1998年3月23日 优先权日1997年3月21日
发明者G·B·米尔斯, B·J·霍勒布, D·C·高德特 申请人:阿泰尔金生物技术公司, 圭尔夫大学