一种高含量磷脂酰乙醇胺的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于制药工程技术领域，具体地说，涉及一种高含量磷脂酰乙醇胺的制备 方法。
【背景技术】
[0002] 磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine简称PE)又称乙醇胺磷酸甘油醋，结 构上是由乙醇胺和磷脂酸两部分组成的一类磷脂化合物。较早时应用于食品加工及保健品 研宄等领域，随着研宄的不断深入，磷脂酰乙醇胺逐渐的被人们应用到药物制剂领域，在如 今最活跃的脂质体技术领域，不仅高纯度磷脂酰乙醇胺是脂质体制剂的重要辅料来源，也 是其他重要的脂质体辅料如合成磷脂〇)〇PE、DEPE等）的关键起始原料。目前中国药典收 载的药用磷脂主要控制指标包括甘油三酯、游离脂肪酸、过氧化值、酸值等，另外甲氧基苯 胺值是过氧化物的再次氧化产物指标，在制剂中有严格控制，因此开发注射用磷脂酰乙醇 胺需要严格控制上述关键指标。
[0003] 目前分离磷脂酰乙醇胺的方法有co2超临界萃取法、溶剂萃取法、吸附法、柱层析 法等。
[0004] C02超临界萃取法只适合制备混合磷脂，所得产品磷脂酰乙醇胺含量普遍偏低。磷 脂酰乙醇胺与其他磷脂的分子量较接近，膜分离法要得到单一磷脂酰乙醇胺仍存在困难， 其产品含量偏低不能满足药用磷脂要求。溶剂提取法是通过磷脂酰乙醇胺在两相溶剂中的 溶解度的差异达到富集纯化的目的，对理化性质非常相似的各类磷脂杂质的选择性较差。
[0005] 吸附法是一种较常用的纯化方法，通过选择不同理化特性的吸附剂对待吸附原料 液进行搅拌吸附，达到纯化的效果，常见的吸附剂有：三氧化二铝、硅胶等，该方法只对磷脂 酰胆碱、酸值等指标有一定的吸附效果，很难保证含量、溶血磷脂酰胆碱（LPC)等关键指标 符合药用标准。
[0006] 硅胶柱层析法是另一种较常用的分离纯化方法，固定相与待分离物质的比例、洗 脱溶剂种类和比例对柱层析的分离效果与除杂能力有巨大的影响，柱层析方法的溶剂及比 例选择与产品本身的性质以及杂质性质有关，该方法虽常见，但能够使产品纯度高同时又 能符合注射用要求的方法未见报道。
[0007] 采用柱层析纯化磷脂酰乙醇胺的专利较多，如中国专利CN100336818C、 CN103183705A分别公开了不同来源的磷脂酰乙醇胺粗品经柱层析硅胶过柱，利用卤代烷 烃-甲醇洗脱得到磷脂酰乙醇胺含量分别为96. 2%、91. 4%?94. 5%的产品，这两篇专利 均采用卤代烷烃-甲醇两相体系为洗脱液，所得产品含量偏低，其他指标如甘油三酯、脂肪 酸、过氧化值、甲氧基苯胺值等指标无法得到有效控制，难以满足药用辅料要求。
[0008] 中国专利CN103102366A公开了一种于醇溶性磷脂中分离磷脂酰乙醇胺的方法， 该方法以硅胶为填充剂，乙醇为洗脱剂，得到磷脂酰乙醇胺含量为86%?96. 2%的产品。 此方法采用单组分溶剂进行分离洗脱，受极性影响，很难控制产品中甘油三酯、脂肪酸、过 氧化值、甲氧基苯胺值等指标，且该方法很难实现产业化生产。
[0009] 以上三篇专利技术无论是用低碳醇洗脱，还是用卤代烷烃-甲醇洗脱，所得到磷 脂酰乙醇胺产品仍然存在缺陷，含量、杂质限度与氧化指标等不能同时满足注射药用磷脂 的要求。
[0010] 在现有专利技术纯化磷脂酰乙醇胺的应用中，其产品杂质（磷脂酰胆碱、溶血磷 脂酰胆）、氧化指标（酸值、过氧化值、甲氧基苯胺值）不能完全符合药用磷脂的要求。目前 开发药用磷脂的技术领域里，没有专门针对控制过氧化值、甲氧基苯胺值等理化指标的方 法，磷脂酰乙醇胺具有高不稳定性，开发该类产品需要过度依赖于起始原料的新鲜度。受技 术约束，目前国内药用磷脂酰乙醇胺主要依赖进口，且价格昂贵，供货周期长，导致磷脂酰 乙醇胺相关产品开发周期长、成本高，不利于市场的普及应用。
[0011] 因此，开发以脑磷脂粗品为原料，通过柱层析并对三元混合溶剂比例进行控制，经 过两次洗脱，即可以提高产品含量又可以降低甘油三酯、游离脂肪酸、酸值、过氧化值、甲氧 基苯胺值等关键指标，使得产品质量符合药用要求，对新型靶向制剂的发展具有重要意义。
【发明内容】
[0012] 本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种高含量磷脂酰乙醇胺的制备方 法。本发明通过柱层析以三元混合溶剂为洗脱剂进行两次洗脱，一步提高磷脂酰乙醇胺含 量并且有效控制产品中杂质限度（磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、游离脂肪酸、甘油三酯） 和氧化指标（酸值、过氧化值、甲氧基苯胺值）。
[0013] 方法的步骤如下：
[0014] 以脑磷脂粗品为原料，加入多卤代烷烃溶解，经过柱层析以多卤代烷烃-低碳 醇-水所组成的三元混合溶剂进行两次洗脱处理，干燥，得到高纯度磷脂酰乙醇胺产品。
[0015] 方法所用脑磷脂粗品原料为来源于大豆、蛋黄的磷脂粗品，其中磷脂酰乙醇胺含 量大于50%。
[0016] 所用填料包括硅胶或二醇基硅胶。
[0017] 所用填料与原料的比例为1:1?10:1 (kg/kg)。
[0018] 所用的多卤代烷烃包括二氯甲烷、三氯甲烷或二氯乙烷。
[0019] 所用的低碳醇包括无水乙醇、丙醇、异丙醇、正丁醇。
[0020] 第一次洗脱所用的三元混合溶剂包括多卤代烷烃，低碳醇和水。其中多卤代烷烃 占混合溶剂的比例为85. 7 %?98. 0 %，水占混合溶剂的比例为0. 1 %?0. 2 %，其余为低碳 醇。
[0021] 第二次洗脱所用的三元混合溶剂包括多卤代烷烃，低碳醇和水。其中多卤代烷烃 占混合溶剂的比例为73. 5 %?85. 0 %，水占混合溶剂的比例为0. 3 %?2. 0 %，其余为低碳 醇。
[0022] 第一次洗脱体积用量（v)与原料重量（w)比为6:1?18:1 (L/Kg)。
[0023] 第二次洗脱体积用量（v)与原料重量（w)比为10:1?45:1 (L/Kg)。
[0024] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0025] (1)本发明采用三元混合溶剂体系，结合两次洗脱，就可以保证磷脂酰乙醇胺含量 符合要求的同时达到脱色、除杂（降低磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、甘油三酯、游离脂肪 酸含量等杂质限度）、降值（降低酸值、过氧化值、甲氧基苯胺值）的效果。
[0026] (2)本发明解决了现有同类专利技术所存在的技术瓶颈，从技术层面解决了降低 过氧化值、甲氧基苯胺值等理化指标的难题，大大减少了磷脂酰乙醇胺产品对起始原料新 鲜程度的过度依赖。
[0027] (3)本发明对原料的处理量大，生产操作简便，可商业化大生产得到符合药用磷 脂要求合格产品，填补国内空白，打破国外的技术和产品垄断，有利于国内市场上的普及应 用。
【具体实施方式】
[0028] 以下实施例所得产品中磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、甘油三酯、 游离脂肪酸含量以及酸值、过氧化值等关键均按照中国药典收载的磷脂检测方法进行测 定，甲氧基苯胺值按照欧洲药典8. 0版2. 5. 36方法测定。
[0029] 实施例1 :
[0030] 取大豆脑磷脂粗品（PE彡50% )1公斤，加入二氯甲烷溶解配成原料液，填装10 公斤硅胶进行柱层析，第一次以洗脱剂（二氯甲烷85. 7%、乙醇14. 2%、水0. 1% )洗脱18 升，第二次再以洗脱剂（三氯甲烷73. 5%、丙醇24. 5、水2. 0% )洗脱45升收集洗脱液，经 过真空浓缩，冷冻干燥得到磷脂酰乙醇胺产品，PE转移率为85. 4%，磷脂酰乙醇胺含量为 99. 5%、磷脂酰胆碱含量为0. 3%、溶血磷脂酰胆碱含量为未检出，酸值为0. 8、过氧化值未 检出、甲氧基苯胺值为3. 6,甘油三酯、游离脂肪酸含量均符合规定。
[0031] 实施例2:
[0032] 取蛋黄脑磷脂粗品（PE多50% ) 1公斤，加入三氯甲烷溶解配成原料液，填装7公 斤二醇基硅胶进行柱层析，第一次以洗脱剂（三氯甲烷90. 0%、丙醇9. 8%、水0. 2% )洗脱 15升，第二次再以洗脱剂（二氯甲烷75. 0%、丙醇24. 5%、水0. 5% )洗脱30升收集洗脱 液，经过真空浓缩，冷冻干燥得到磷脂酰乙醇胺产品，PE转移率为83. 5%，磷脂酰乙醇胺含 量为99. 0%、磷脂酰胆碱含量为0. 5%、溶血磷脂酰胆碱含量未检出，酸值为0. 4、过氧化值 未检出、甲氧基苯胺值为1. 0,甘油三酯、游离脂肪酸含量均符合规定。
[0033] 实施例3 :
[0034] 取大豆脑磷脂粗品（PE彡50% ) 10公斤，加入二氯乙烷溶解配成原料液，填装50 公斤二醇基硅胶进行柱层析，第一次以洗脱剂（二氯乙烷93.0%、乙醇6.8%、水0. 2%)洗 脱460升，第二次再以洗脱剂（二氯乙烷80.0%、乙醇19.0%、水1.0% )洗脱440升收集 洗脱液，经过真空浓缩，冷冻干燥得到磷脂酰乙醇胺产品，PE转移率为82. 2%，磷脂酰乙醇 胺含量为98. 5%、磷脂酰胆碱含量为0. 2%、溶血磷脂酰胆碱含量未检出，酸值为1. 0、过氧 化值未检出、甲氧基苯胺值为3. 0,甘油三酯、游离脂肪酸含量均符合规定。
[0035] 实施例4 :
[0036] 取蛋黄脑磷脂粗品（PE彡50% ) 10公斤，加入二氯甲烷溶解配成原料液，填装30 公斤二醇基硅胶进行柱层析，第一次以洗脱剂（二氯甲烷88. 2%、丙醇11. 6%、水0. 2% ) 洗脱150升，第二次再以洗脱剂（二氯甲烷83.0%、乙醇16. 7%、水0.3% )洗脱400升收 集洗脱液，经过真空浓缩，冷冻干燥得到磷脂酰乙醇胺产品，PE转移率为77. 3%，磷脂酰乙 醇胺含量为