作为lpa受体拮抗剂的吡唑并吡啶酮衍生物的制作方法

专利名称：：作为lpa受体拮抗剂的吡唑并吡啶酮衍生物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及作为LPA受体拮抗剂起作用的新的吡唑并吡啶酮衍生物及其制备方法。先前技术溶血磷脂酸(LPA)为相对于主要的磷脂种类以低浓度存在于所有的真核组织和以较高浓度(亚微摩尔范围)存在于血浆中的小的甘油磷脂(分子量:430-480Da)。在1996年，LPA的第一个高亲和性、同源细胞表面受体被鉴定(LPAl)(I)。这迅速导致鉴定了两种另外的密切相关的受体(LPA2和LPA3)，并且最近鉴定了两种另外的稍微不同的受体(LPA4和LPA5)。全部5种受体为I型视紫红质样G蛋白偶联受体(GPCRs)，这些受体在其组织分布和下游信号转导通路方面存在不同(参见ChoiJffetal.,Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.2010，50:157-186)。由于受体亚型、表达模式和效应器通路的这种非均匀性，LPA的效应为多样化和广泛的，调节许多生物学过程。关于这些生物学作用的大量信息源于遗传缺失研究。迄今为止，基因敲除小鼠已被报道具有5种已知受体中的4种(LPA1-4)，以及主要的LPA生成酶，自毒素(autotaxin)(ATX)(2，3)。这些突变小鼠，除了新兴类的化学工具，已将通过使用体外研究作出的观察转换为医学相关背景。不稍稍提及结构类似的脂质1-磷酸鞘氨醇(SlP)就难以讨论LPA。当其第一个同源受体(SlPl)在1998年被去孤儿化(deorphanized)时，SlP也被发现为细胞外的信号转导脂质(4)。尽管它们代表不同的信号转导系统，这两种脂质之间的相似性扩展到其组织分布和浓度、其同源受体的同源性和效应器通路、及其广泛范围的生物学作用。然而，因为LPA和SlP信号转导近年来已经变为这种热门的研究领域，该综述具体地讲集中在LPA的生物学作用上。SlP信号转导的全面综述可见于其它文献(5，6)。自从20世纪早期就已知溶血磷脂具有生物活性，但是这些作用长期被认为是质膜的非特异性洗涤剂样破坏的结果。然而，这些研究在非常高的非生理浓度下进行。已知LPA在生理浓度下的效应经5种真正的高亲和性同源受体(LPA1-LPA5)以及或许通过另外的最近提出的或仍未鉴定的受体介导(16-18)。LPAl为对LPA鉴定的第一个高亲和性受体(I)(在16，17中综述)。哺乳动物LPARl基因(人类染色体位点9q31.3)编码由364个氨基酸组成具有7个假定的跨膜区(transmembranedomains)的约41-kDa蛋白。在小鼠，开放阅读框在具有中断跨膜区6的保守基因内区(与ZparJ和ZparJ共有)的5个外显子中的2个上被编码。可通过可供选择的外显子使用或剪接产生的/^ar7(mrecl.3)的一种报道的变体导致N末端的18-氨基酸缺失(19)。这种变体的生物学意义尚未建立。在成年小鼠观察到的广泛表达，至少明显存在于脑、子宫、睾丸、肺、小肠、心脏、胃、肾、脾、胸腺、胎盘和骨骼肌中(20，21)。也在人类中广泛表达(22)。Lparl的表达在胚胎发育期间受到更多的空间限制，但是在脑中富集(23)。特别是，正在发育的神经系统为Lparl表达的主要位点，其中其受到空间上和时间上的调节(在17，20中综述)。在胚胎形成期间，中枢神经系统(CNS)表达局限于称为脑室区(VZ)并且在包括脑膜的表面上的一层的新皮层的神经源性区域(I)。VZ在皮质神经发生的末端，刚出生之前消失，但是在出生后的脑中继续表达,其中其在正在发育的白质神经纤维束(whitemattertracts)中存在的细胞中明显并且与髓鞘形成一致(24)。原位杂交技术显示在少突胶质细胞和施旺细胞(分别为CNS和外周神经系统的成髓鞘细胞)中表达(24，25)。LPAl结合并激活3种类型的G蛋白:Gai/o,Gα^/11和Gα12/13(26，27)。LPAl激活引起一系列的细胞反应:细胞增殖与存活、细胞迁移和细胞骨架变化；通过血清反应元件激活改变细胞-细胞接触、Ca2+流动和腺苷酸环化酶抑制；和促分裂原活化蛋白激酶、磷脂酶C、Akt和Rho通路的激活(在16，17，20中综述)。Lparl在小鼠的靶向断裂显示该受体的意料之外的体内功能(28)。LpaH-/-小鼠在混合(C57B1/6JX129)遗传背景下显示50%围产期死亡率，并且在纯粹的(C57B1/6J或Balb/cByJ)遗传背景下进一步降低存活率(J.Chun,未发表的观察结果)。存活者具有减小的体格大小、伴随钝化口鼻的颅面畸形和坐骨神经施旺细胞的凋亡增加(28，29)。归因于嗅觉缺陷的缺陷乳儿很可能导致围产期死亡率。小部分的胚胎具有露脑畸形Γ5%)或前额头部出血Γ2.5%)。在胚胎成神经细胞和成纤维细胞丧失LPA反应证实的体内非冗余功能和作用(28，30)。另外，在初始序列的群体扩张期间(28)，Z/7ar7-/_次代品系自发产生，其称为“M0laga变体”并且呈现更严重的大脑发育缺陷(31)。Lpar2由于其与的60%氨基酸相似性而自孤儿GPCR基因的GenBank搜索进行确认。社类，LPAR2(染色体位点19pl2)编码具有348个残基的预测的氨基酸序列的蛋白，得到39kDa的计算出的分子质量(32)。Lpar2的表达模式与的相比较在时空上相对受限(20，22)。在小鼠，Lpar2在肾脏、子宫和睾丸中高度表达和在肺部适度表达，并且在胃、脾脏、胸腺、脑和心脏发现表达水平较低(20)。ZparJ也在胚脑中表达`，但是在出生后一周内减少(20)。在人体组织中，在睾丸和白细胞中检测到Lpar2的高度表达，在前列腺、脾脏、胸腺和胰腺中发现适度表达(22)。在癌细胞中，在几种情况下已经报道了Lpar2的异常表达，提示LPA2的肿瘤促进作用。LPA2结合于异源三聚体G蛋白的Gαi/o、Ga11/q和Gα12/13家族。这些G蛋白通过包括与LPAl类似的Ras、促分裂原活化蛋白激酶、磷脂酰肌醇3激酶、Rac、磷脂酶C、二酰甘油和Rho的下游分子传递信号(28)。LPA2为真正的高亲和性同源LPA受体(33)。LPA2信号转导的激活通常与如细胞存活(34，35)和细胞迁移(36-38)这样的过程有关。结果，LPA2信号转导作为癌症转移的潜在因素出现(参见下文)(39-41)。有趣的是，几份报告已经提供了LPA2信号转导与其它通路相互作用的证据。例如，LPA2通过与局灶性粘附分子TRIP6相互作用促进细胞迁移(42，43)，并且几种PDZ蛋白和锌指蛋白也被报道直接与LPA2的羧基末端尾部相互作用(44)。另外，LPA2介导的信号转导可提供对表皮生长因子诱导的胰腺癌细胞的迁移和通过Ga12/13/Rho通路的侵袭的抑制作用(45)。这些研究提供了LPA2信号转导在经典的G蛋白信号级联放大与其它信号转导通路之间具有交叉调节作用以调节信号转导的效率和特异性的证据。小鼠基因敲除研究证实，Lpar2-/~突变动物为能存活的，大致正常的和以正常孟德尔比率出生而没有性别偏差的，但是突变体具有在Z/7ar7-/-突变体中存在的恶化的前额血肿(28,30)。另外,来自双敲除突变株(double-nullmutants)的原代成纤维细胞和胚胎皮层细胞显示对外源性LPA的反应大大减少(30，46)。Lpar3使用退化的PCR基克隆和同源性搜索作为孤儿GPCR基因被发现(47，48)。LPAR3(人类染色体位点1ρ22.3_p31.1)编码与小鼠LPAl和LPA2氨基酸序列飞0%相同的"40-kDaGPCR。在人类心脏、睾丸、前列腺、胰腺、肺、卵巢和脑中已经观察到Z/^似的表达(47，48)，并且在小鼠睾丸、肾脏、肺、小肠、心脏、胃、脾、脑和胸腺最丰富(20)。有趣的是，已经显示，在鼠科动物子宫，mRNA专门在种植窗(windowofimplantation)的管腔子宫内膜上皮表达(49)，并且其表达受黄体酮和雌激素调节(50)。象LPAl和LPA2—样，LPA3可与Gαi/o和Gag结合以介导LPA诱导的磷脂酶C激活、Ca2+移动、腺苷酸环化酶抑制和激活以及促分裂原活化蛋白激酶激活(27)。然而，LPA3不能与Gα12/13结合，并因此不在其中包含Gα12/13和Rho的神经元细胞中介导细胞变圆(27)。而且，LPA3不象LPAl和LPA2那样对具有饱和酰基链的LPA种类有反应，但是对含有不饱和脂肪酸的2-酰基-LPA具有相对高的亲和性(47，51)。小鼠为能存活的和大致正常的，但是雌性裸鼠在生殖系统中显示突出的表型(49)(参见下文)。然而，尽管LPA3在前额皮质、海马和扁桃腺中表达(47，48)，迄今为止尚未报道与神经系统中的LPA3丧失相关的表型。LPA4起初自表达序列标签数据库的分析被鉴定为假定的GPCR(52，53)，并且通过配体筛选发现为LPA的特异性受体(54)。LPA4在结构上不同于共享有显著同源性的经典的LPA和SlP受体，并且与P2Y嘌呤受体更加密切相关。然而，其不对测试的任何核苷酸或核苷有反应(52，54)。在人类，LPAR4基因位于染色体X，ql3_q21.1区，并且含有具有42kDa的经计算的分子质量的、编码370个氨基酸的1113个碱基对的无内含子(intronless)的开放阅读框(52，53)。LPA4对18:1-LPA具有特异性的结合亲和性，心/值为44.8nM，但是对其它溶血磷脂和相关脂质例如SlP和SPC没有特异性的结合亲和性(54)。LPA4更倾向于LPA的结构类似物，等级序列为18:1->18:0->16:0->14:0->1-烷基->1-链烯基-^^(54)。在用定量实时PCR检查的16种人体组织当中，财mRNA被普遍表达，并且在卵巢中特别丰富(54)。在用蛋白质印迹(Northernblot)和实时PCR检查的小鼠组织当中，Lpar4mRNA在心脏、皮肤、胸腺、卵巢、正在发育的脑和胚胎成纤维细胞中表达(3，55)。用原位杂交技术的整体装置(Wholemount)检测肢芽、体节、面部突起(facialprocesses)和正在发育的脑中的Lpar4mRNA(23)。在过度表达LPA4的细胞中，LPA通过Ga12/13和Rho/Rho-激酶通路引起形态变化例如细胞变圆和应力纤维形成(55，56)，如在表达LPA1-、LPA2-和LPA5-的细胞观察到的那样。另外，在表达LPA4的细胞观察到Rho激酶介导的细胞聚集和N-钙粘蛋白依赖的细胞粘附(56)。LPA通过Gas诱导细胞内cAMP积聚，和通过Ga^/11和Gai诱导Ca2+移动(55，56)。尤其是，对经典的LPA受体未报道Gas偶合。最近已经报道了缺乏LPA4的小鼠，尽管它们未呈现明显异常(3)。然而，LPA4对细胞运动性具有抑制作用，在其细胞中{a)LPA4缺乏增强对成纤维细胞中LPA的迁移反应，和{b、LPA4的异源性表达抑制B103细胞的LPAl依赖的迁移和LPA-诱导的迁移及结肠癌细胞的侵袭(3)。最近，孤儿GPCR(GPR92)被鉴定为LPA受体并且重新命名为LPA5以反映这种特性(57，58)。人类似位于染色体12pl3.31，并且编码由372个氨基酸组成的41kDa蛋白。象其它的LPA受体(LPA1-4)—样，LPA5也属于视紫红质-GPCR家族，并且尽管结构上不同于LPA1-3，其与LPA4共有35%的同源性(58)。在鼠科动物组织例如胚脑、小肠、皮肤、脾脏、胃、胸腺、肺、心脏、肝脏和胚胎干细胞中广泛表达(57，58)。LPA通过结合于Ga12/13在表达LPA5的细胞中诱导神经突收缩和应力纤维形成，并且通过激活Ga增加细胞内钙水平(58)。此外，LPA在表达LPA5的细胞中增加cAMP水平和肌醇磷酸产生(57，58)。最近，两种其它的脂质衍生的分子(焦磷酸法尼酯和花生四烯酸甘油OV-arachidonylglycin))被表征为LPA5配体(59)。在该项研究中,焦磷酸法尼酯激活Ga^/ll-和Gas_介导的信号转导,而Ar-花生四烯酸甘油OV-arachidonylglycin)仅能够激活Ga/11介导的信号转导。已经表明，那些配体与LPA5的配体结合袋进行不同的相互作用(59)。然而，随后的研究证实，LPA5为也可通过相对于18:1-LPA以高得多的浓度的焦磷酸法尼酯激活的真正的LPA受体，这留下了这些可供选择的配体的生物相关性的悬而未决的问题(60,61)。最近，3种另外的孤儿GPCRs已被公布为新的假定的LPA受体:GPR87、P2Y5和P2Y10(62-64)。这些孤儿GPCRs中的每一种属于嘌呤能受体(purinergicreceptor)P2Y家族，并且比LPA1-3与LPA4和LPA5更加密切相关。在这些当中，基于近来发表和未发表的数据，P2Y5有可能作为LPA6加入LPA受体家族。P2Y5被确定为人类毛发生长的关键介质，并且为罕见家族形式的人类脱发的因果基因出3，63a)，并且这种假定的LPA6的近来研究支持该受体通过异常高浓度的LPA激活[对于一些试验EC50在低微摩尔范围内(65)]。这表明P2Y5作为相对低亲和性LPA受体的特性不同于LPA1-5(65)，可能需要不同的配体或其它解释。GPR87和P2Y10被报道使用混杂的Gα16融合系统增加细胞内Ca2+移动(62，64)。P2Y10-Ga16也可通过SlP及LPA诱导Ca2+瞬变现象(EC50分别=53和130nM)(62)。需要更详细的调查研究以证实这3个作为真正LPA受体的候选者。已经报道了非GPCRLPA受体，但是其确实性仍有待确定(66)。引用文献:1.HechtJH,WeinerJA,PostSR,ChunJ.1996.脑室区基因-1(vzg_l)编码在发育的脑皮质的神经原区域表达的溶血磷脂酸受体(Ventricularzonegene-1(vzg-1)encodesalysophosphatidicacidreceptorexpressedinneurogenicregionsofthedevelopingcerebralcortex).J.Cell.Biol.135:1071-832.ChoiJWjLeeCWjChunJ.2008.遗传裸鼠显示的溶血磷脂受体的生物学作用:最新进展(Biologicalrolesoflysophospholipidreceptorsrevealedbygeneticnullmice:anupdate).Biochim.Biophys.Acta1781:531-393.LeeZ，ChengCTjZhangH，SublerMAjWuJ，etal.2008.LPA4/p2y9/GPR23在细胞运动的负性调节中的作用(RoleofLPA4/p2y9/GPR23innegativeregulationofcellmotility).MoLBiol.Cell.19:5435-454.LeeM，VanBrooklynJ，ThangadaS，LiuC，HandA，etal.1998.作为G蛋白-偶合受体EDG-1的配体的1-憐酸鞘氨醇(Sphingosine-l-phosphateasaligandfortheGprotein-coupledreceptorEDG-1).Science279:1552-555.SpiegelS，MilstienS.2003.1_磷酸鞘氨醇:一种难以探测的信号转导脂质(Sphingosine-l-phosphate:anenigmaticsignallingLipid).Nat.Rev.MoLCell.BioL4:397-4076.ChunJ，RosenH.2006.作为组织移植和自身免疫性疾病的潜在性药物靶标的溶血憐月旨(Lysophospholipidreceptorsaspotentialdrugtargetsintissuetransplantationandautoimmunediseases).Curr.Pharm.Des.12:161-717.AokiJ.2004.溶血憐脂酸产生的机理(Mechanismsoflysophosphatidicacidproduction).Semin.Cell.Dev.Biol.15:477-898.SugiuraT，NakaneS，KishimotoS，WakuK，YoshiokaY，etal.1999.溶血磷脂酸及其烷基醚-连接的类似物在大鼠脑中的存在和它们对培养的神经元细胞的生物活性的比^较(Occurrenceoflysophosphatidicacidanditsalkylether-linkedanaloginratbrainandcomparisonoftheirbiologicalactivitiestowardculturedneuralcells).Biochim.Biophys.Acta1440:194-2049.SanoT，BakerD，ViragT，WadaA，YatomiY，etal.2002.与血小板激活有关的多重机制导致血液中的溶血磷脂酸和1-磷酸鞘氨醇生成(Multiplemechanismslinkedtoplateletactivationresultinlysophosphatidicacidandsphingosine1-phosphategenerationinblood).J.Biol.Chem.277:21197-20610.Umezu-GotoM，KishiY，TairaA，HamaK，DohmaeN，etal.2002.自毒素具有由溶血磷脂酸产生的导致肿瘤细胞生长和迀移的溶血磷脂酶活性(AutotaxinhaslysophospholipaseDactivityleadingtotumorcellgrowthandmotilitybylysophosphatidicacidproduction).J.Cell.BioL158:227-3311.TokumuraA，MajimaE，KariyaY，TominagaK，KogureK，etal.2002.人血浆溶血磷脂酶D，一种产生溶血磷脂酸的酶作为自毒素(一种多功能磷酸二酯酶)的鉴定(IdentificationofhumanplasmalysophospholipaseD，alysophosphatidicacid-producingenzyme,asautotaxin,amultifunctionalphosphodiesterase).J.BioLChem.277:39436—4212.StrackeML,KrutzschHCjUnsworthEJjArestadA，CioceV，etal.1992.自毒素，一种新的移动-剌激蛋白的鉴定、纯化和部分序列分析(Identification，purification，andpartialsequenceanalysisofautotaxin,anovelmotility-stimulatingprotein).J.Biol.Chem.267:2524-2913.MurataJ，LeeHYjClairT，KrutzschHCjArestadAAjetal.1994.人肿瘤迀移-剌激蛋白，自毒素的cDNA克隆揭示与磷酸二酯酶的同源性(cDNAcloningofthehumantumormotility-stimulatingprotein,autotaxin,revealsahomologywithphosphodiesterases).J.BioLChem.269:30479-8414.vanMeeterenLA,RuursP，StortelersC，BouwmanP，vanRooijenMAjetal.2006.自毒素，一种分泌的溶血磷脂酶D，对发育期间血管形成是必要的(Autotaxin，asecretedlysophospholipaseD，isessentialforbloodvesselformationduringdevelopment).MoLCell.BioL26:5015-2215.TanakaM，OkudairaS，KishiY，OhkawaR，IsekiS，etal.2006.自毒素通过产生溶血磷脂酸稳定血管并且为胚胎脉管系统形成所必需(Autotaxinstabilizesbloodvesselsandisrequiredforembryonicvasculaturebyproducinglysophosphatidicacid).J.Biol.Chem.281:25822-3016.FukushimaN，IshiiI，ContosJJjWeinerJAjChunJ.2001.溶血憐脂受体(Lysophospholipidreceptors).Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.41:507-3417.1shiiI，FukushimaN，YeX，ChunJ.2004.溶血憐脂受体:信号传导和生物学(Lysophospholipidreceptors:signalingandbiology).Annu.Rev.Biochem.73:321-5418.ChunJ.2007.溶血憐脂如何得到其受体(Howthelysophospholipidgotitsreceptor).Scientist21:48-5419.ContosJJjChunJ.1998.LPA受体基因的完整cDNA序列、基因组结构和染色体定位(CompletecDNAsequence,genomicstructure,andchromosomallocalizationoftheLPAreceptorgene),lpAl/vzg-l/Gpcr26.Genomics51:364-7820.ContosJJjIshiiI，ChunJ.2000.溶血憐脂酸受体(Lysophosphatidicacidreceptors).MoLPharmacol.58:1188-921.YeX.2008.生殖系统的功能和病理学中的溶血磷脂信号传导(Lysophospholipidsignalinginthefunctionandpathologyofthereproductivesystem).Hum.Reprod.Update14:519-3622.AnSjBleuT，HallmarkOGjGoetzlEJ.1998.对溶血磷脂酸的人G-蛋白偶联受体的新亚型的特征鉴定(CharacterizationofanovelsubtypeofhumanG-protein-coupledreceptorforlysophosphatidicacid).J.Biol.Chem.273:7906-1023.0huchiH，HamadaA，MatsudaH，TakagiA，TanakaM，etal.2008.溶血憐脂受体基因的表达图谱(Expressionpatternsofthelysophospholipidreceptorgenesduringmouseearlydevelopment).Dev.Dyn.237:3280-9424.WeinerJAjHechtJHjChunJ.1998.溶血憐脂酸受体基因vzg-l/lpAl/edg-2通过在产后鼠科动物脑中的成熟少突神经胶质细胞表达(Lysophosphatidicacidreceptorgenevzg-l/lpAl/edg-2isexpressedbymatureoligodendrocytesduringmyelinationinthepostnatalmurinebrain).J.Comp.Neurol.398:587-9825.WeinerJAjChunJ.1999.由发送信号的磷脂溶血磷脂酸介导的施旺细胞存活(Schwanncellsurvivalmediatedbythesignalingphospholipidlysophosphatidicacid).Proc.Natl.Acad.ScLUSA96:5233-3826.FukushimaN，KimuraY，ChunJ.1998.由vzg-l/lpAl/edg-2编码的信号受体偶联至G蛋白并介导对溶血磷脂酸的多细胞响应(Asinglereceptorencodedbyvzg-1/IpAl/edg-2couplestoGproteinsandmediatesmultiplecellularresponsestolysophosphatidicacid).Proc.Natl.Acad.ScLUSA95:6151-5627.1shiiI，ContosJJjFukushimaN，ChunJ.2000.使用逆转录病毒表达系统对神经元细胞系中的溶血磷脂酸受体，LP(Al)/VZG-l/EDG-2、LP(A2)/EDG-4和LP(A3)/EDG-7进行功會泛t匕较(Functionalcomparisonsofthelysophosphatidicacidreceptors,LP(Al)/VZG-l/EDG-2,LP(A2)/EDG-4，andLP(A3)/EDG-7inneuronalcelllinesusingaretrovirusexpressionsystem).MoLPharmacol.58:895-90228.ContosJJjFukushimaN，WeinerJAjKaushalD，ChunJ.2000.正常乳儿行为中IpAl溶血磷脂酸受体基因的必要条件(RequirementfortheIpAllysophosphatidicacidreceptorgeneinnormalsucklingbehavior).Proc.Natl.Acad.Sc!.USA97:13384-8929.WeinerJAjFukushimaN，ContosJJjSchererSSjChunJ.2001.由受体-介导的溶血磷脂酸对施旺细胞形态学和粘附的调节(RegulationofSchwanncellmorphologyandadhesionbyreceptor-mediatedlysophosphatidicacidsignaling).J.NeuroscL21:7069-7830.ContosJJjIshiiI，FukushimaN，KingsburyMAjYeX，etal.2002.1pa(2)(Edg4)和lpa(l)/lpa(2)(Edg2/Edg4)溶血磷脂酸受体敲除小鼠的特征:信号传导缺乏且无归因于lpa(2)的明显表型异常(CharacterizationofIpa(2)(Edg4)andlpa(l)/Ipa(2)(Edg2/Edg4)lysophosphatidicacidreceptorknockoutmice:signalingdeficitswithoutobviousphenotypicabnormalityattributabletoIpa(2)).MoLCell.BioL22:6921-2931.Estivill-TorrusG，Llebrez-ZayasP，Matas-RicoE，SantinL，PedrazaC，etal.2008.LPAl信号传导的缺乏导致有缺陷的皮层发育(AbsenceofLPAlsignalingresultsindefectivecorticaldevelopment).Cereb.Cortex18:938-5032.ContosJJjChunJ.2000.溶血磷脂酸受体基因Ip(A2)/Edg4的基因组表征和先前鉴定的cDNA中移码突变的鉴定(Genomiccharacterizationofthelysophosphatidicacidreceptorgene,lp(A2)/Edg4，andidentificationofaframeshiftmutationinapreviouslycharacterizedcDNA).Genomics64:155-6933.BandohK，AokiJ，TairaA，TsujimotoM，AraiH，etal.2000.EDG家族的溶血磷脂酸(LPA)受体受LPA种类的不同的激活，克隆的LPA种类的构效关系(Lysophosphatidicacid(LPA)receptorsoftheEDGfamilyaredifferentiallyactivatedbyLPAspecies.Structure-activityrelationshipofclonedLPAreceptors).FEBSLett.478:159-6534.GoetzlEJjKongY，MeiB.1999.与Bax抑制相关的细胞凋亡的T细胞的溶血憐脂酸和1-憐酸鞘氨醇的保护作用(Lysophosphatidicacidandsphingosine1-phosphateprotectionofTcellsfromapoptosisinassociationwithsuppressionofBax).J.1mmunol.162:2049-5635.DengWjBalazsL，WangDAjVanMiddlesworthL，TigyiG，etal.2002.溶血磷脂酸保护和救护受辐射-和化疗-诱导的细胞凋亡的小肠上皮细胞(Lysophosphatidicacidprotectsandrescuesintestinalepithelialcellsfromradiation-andchemotherapy-1nducedapoptosis).Gastroenterology123:206-1636.ZhengY，KongY，GoetzlEJ.2001.溶血磷脂酸受体-对JurkatT细胞迀移通过Matrigel模型基膜的作用(Lysophosphatidicacidreceptor-selectiveeffectsonJurkatTcellmigrationthroughaMatrigelmodelbasementmembrane).J.Immunol.166:2317-2237.ZhengY，VoiceJKjKongY，GoetzlEJ.2000.溶血磷脂酸受体在有丝分裂原-激活的人血T淋巴细胞中的改变的表达和功能特性(Alteredexpressionandfunctionalprofileoflysophosphatidicacidreceptorsinmitogen-activatedhumanbloodTlymphocytes).FASEBJ.14:2387-8938.PanchatcharamM，MiriyalaS，YangF，RojasM，EndC，etal.2008.溶血磷脂酸受体I和2在血管损伤应答中起作用，但对血压无作用(LysophosphatidicacidreceptorsIand2playrolesinregulationofvascularinjuryresponsesbutnotbloodpressure).Circ.Res.103:662-7039.YunCCjSunH，WangD，RusoviciR，CastleberryA，etal.2005.LPA2受体介导人结肠癌细胞中的促有丝分裂信号(LPA2receptormediatesmitogenicsignalsinhumancoloncancercells).Am.J.Physiol.Cell.Physiol.289:C2_1140.YuSjMurphMM，LuY，LiuS，HallHS，etal.2008.溶血磷脂酸受体确定卵巢癌细胞的致肿瘤性和侵袭性(Lysophosphatidicacidreceptorsdeterminetumorigenicityandaggressivenessofovariancancercells).J.Natl.CancerInst.100:1630-4241.ChenM，TowersLNj0’ConnorKL2007.LPA2(EDG4)在乳腺癌细胞中以低于LPAl(EDG2)的效果介导Rho-依赖性趋化性(LPA2(EDG4)mediatesRho-dependentchemotaxiswithlowerefficacythanLPAl(EDG2)inbreastcarcinomacells).Am.J.Physiol.Cell.Physiol.292:C1927_3342.LaiYJjChenCS，LinWCjLinFT.2005.c-Src-mediatedTRIP6的磷酸化调节其在溶血磷脂酸-诱导的细胞迀移中的功能(phosphorylationofTRIP6regulatesitsfunctioninlysophosphatidicacid-1nducedcellmigration).MoLCell.Biol.25:5859-6843.LaiYJjLinWCjLinFT.2007.PTPL1/FAP-1负性调节溶血磷脂酸-诱导的细胞迁移中的TRIP6功能(PTPL1/FAP-1negativelyregulatesTRIP6functioninlysophosphatidicacid-1nducedcellmigration).J.Biol.Chem.282:24381-8744.LinFT,LaiYJ.2008.LPA2受体信号传导通过羧基-末端尾介导的蛋白-蛋白相互作用的调节(RegulationoftheLPA2receptorsignalingthroughthecarboxyl-terminaltailmediatedprotein-proteininteractions).Biochim.Biophys.Acta1781:558-6245.KomachiM，TomuraH，MalchinkhuuE，ToboM，MogiC，etal.2009.LPAl受体介导剌激，而LPA2受体介导介导抑制响应于溶血磷脂酸和恶性腹水的胰腺癌细胞迀移(LPAIreceptorsmediatestimulation,whereasLPA2receptorsmediateinhibition,ofmigrationofpancreaticcancercellsinresponsetolysophosphatidicacidandmalignantascites).Carcinogenesis30:457-6546.KingsburyMAjRehenSKjContosJJjHigginsCM，ChunJ.2003.溶血憐脂酸促进皮质生长和折叠的非增殖作用(Non-proliferativeeffectsoflysophosphatidicacidenhancecorticalgrowthandfolding).Nat.NeuroscL6:1292-9947.BandohK，AokiJ，HosonoH，KobayashiS，KobayashiT，etal.1999.新的人G-蛋白-偶联受体EDG7对溶血磷脂酸的分子克隆和特征鉴定(MolecularcloningandcharacterizationofanovelhumanG-protein-coupledreceptor,EDG7，forlysophosphatidicacid).J.Biol.Chem.274:27776-8548.1mDSjHeiseCE，HardingMAjGeorgeSR，0，DowdBFjetal.2000.在前列腺中表达的溶血磷脂酸受体Edg-7的分子克隆和特征鉴定(Molecularcloningandcharacterizationofalysophosphatidicacidreceptor,Edg-7,expressedinprostate).MoLPharmacol.57:753-5949.YeX，HamaK，ContosJJjAnlikerB，InoueA，etal.2005.在胚胎植入和定位中LPA3-介导的溶血憐脂酸信号传导(LPA3_mediatedlysophosphatidicacidsignallinginembryoimplantationandspacing).Nature435:104-850.HamaK，AokiJ，BandohK，InoueA，EndoT，etal.2006.溶血憐脂酸受体LPA3受小鼠子宫孕酮和雌激素的正性和负性调节(Lysophosphatidicreceptor,LPA3，ispositivelyandnegativelyregulatedbyprogesteroneandestrogeninthemouseuterus).LifeScL79:1736-4051.SonodaH，AokiJ，HiramatsuT，IshidaM，BandohK，etal.2002.一种产生溶血磷脂酸的新的磷脂酸-选择性磷脂酶Al(Anovelphosphatidicacid-selectivephospholipaseAlthatproduceslysophosphatidicacid).J.Biol.Chem.277:34254-6352.JanssensR，BoeynaemsJMjGodartM，CommuniD.1997.与P2Y5受体密切相关的人的七螺旋受体的克隆(CloningofahumanheptahelicalreceptorcloselyrelatedtotheP2Y5receptor).Biochem.Biophys.Res.Conmun.236:106-1253.0，DowdBFjNguyenT，JungBPjMarcheseA，ChengR，etal.1997.四种假定的新的人G-蛋白-偶联受体基因的克隆和染色体绘图(CloningandchromosomalmappingoffourputativenovelhumanG-protein-coupledreceptorgenes).Gene187:75-8154.NoguchiK，IshiiS，ShimizuT.2003.p2y9/GPR23作为新的人G-蛋白-偶联受体对溶血磷脂酸(结构上与Edg家族相差甚远)的鉴定(Identificationofp2y9/GPR23asanovelGprotein-coupledreceptorforlysophosphatidicacid,structurallydistantfromtheEdgfamily).J.Biol.Chem.278:25600-655.LeeCWjRiveraR，DubinAEjChunJ.2007.LPA(4)/GPR23为使用G(s)-，G(q)/G(i)_介导的钙信号传导和G(12/13)_介导的Rho激活的溶血磷脂酸(LPA)受体(LPA(4)/GPR23isalysophosphatidicacid(LPA)receptorutilizingG(s)-，G(q)/G(i)-mediatedcalciumsignalingandG(12/13)-mediatedRhoactivation).J.Biol.Chem.282:4310-1756.YanagidaK，IshiiS，HamanoF，NoguchiK，ShimizuT.2007.LPA4/p2y9/GPR23在大鼠神经元细胞系中介导的riio-依赖性形态学变化(LPA4/p2y9/GPR23mediatesrho-dependentmorphologicalchangesinaratneuronalcellline).J.Biol.Chem.282:5814-2457.KotarskyK，BoketoftA，BristulfJ，NilssonNE，NorbergA，etal.2006.溶血磷脂酸结合于并激活GPR92，一种在胃肠道淋巴细胞中高度表达的G-蛋白-偶联受体(LysophosphatidicacidbindstoandactivatesGPR92，aGprotein-coupledreceptorhighlyexpressedingastrointestinallymphocytes).J.Pharmacol.Exp.Ther.318:619-2858.LeeCWjRiveraR，GardellS，DubinAEjChunJ.2006.GPR92作为一种新的增加cAMP，LPA5的G12/13-和Gq-偶联溶血磷脂酸受体(GPR92asanewG12/13-andGq-coupledlysophosphatidicacidreceptorthatincreasescAMP，LPA5).J.Biol.Chem.281:23589-9759.0hDY，YoonJMjMoonMJjHwangJIjChoeH，etal.2008.法呢基焦磷酸盐和N-花生四烯酸甘油酯作为内源性配体用于GPR92的鉴定(IdentificationoffarnesylpyrophosphateandN-arachidonyIglycineasendogenousligandsforGPR92).J.BioLChem.283:21054-6460.WilliamsJRjKhandogaAL，GoyalP，FellsJIjPeryginDHjetal.2009.GPR92/LPA5溶血磷脂酸受体的独特配体选择性表明在人血小板激活中的作用(UniqueligandselectivityoftheGPR92/LPA5lysophosphatidatereceptorindicatesroleinhumanplateletactivation).J.Biol.Chem.284:17304-1961.YinHjChuA，LiWjWangB，SheltonF，etal.2009.使用抑制蛋白PathHunterTM分析法对脂质G-蛋白-偶联受体配体的鉴定(LipidGprotein-coupledreceptorligandidentificationusing/betaZ-arrestinPathHunterTMassay).J.BioLChem.284:12328—3862.MurakamiM，ShiraishiA，TabataK，FujitaN.2008.孤儿GPCR，P2Y(10)受体作为1-磷酸鞘氨醇和溶血磷脂酸受体的鉴定(IdentificationoftheorphanGPCR,P2Y(10)receptorasthesphingosine-l-phosphateandlysophosphatidicacidreceptor).Biochem.Biophys.Res.Conmun.371:707-1263.PasternackSM，vonKugelgenI，AboudKAjLeeYAjRuschendorfF，etal.2008.G-蛋白-偶联受体P2Y5及其配体LPA涉及人毛发生长的维持(Gprotein-coupledreceptorP2Y5anditsligandLPAareinvolvedinmaintenanceofhumanhairgrowth).Nat.Genet.40:329-3463a.ShimomuraY，WajidM，IshiiY，ShapiroL，PetukhovaL，etal.2008.P2RY5，一种孤儿G-蛋白-偶联受体的裂解为常染色体隐形毛发的基础(DisruptionofP2RY5，anorphanGprotein-coupledreceptor,underliesautosomalrecessivewoollyhair).Nat.Genet.40:335—3964.TabataK，BabaK，ShiraishiA，ItoM，FujitaN.2007.孤儿GPCRGPR87去孤儿化并表现出为溶血憐脂酸受体(TheorphanGPCRGPR87wasdeorphanizedandshowntobealysophosphatidicacidreceptor).Biochem.Biophys.Res.Conmun.363:861-6665.YanagidaK，MasagoK，NakanishiH，KiharaY，HamanoF，etal.2009.—种新的溶血磷脂酸受体p2y5/LPA6的鉴定和表征(Identificationandcharacterizationofanovellysophosphatidicacidreceptor,p2y5/LPA6).J.Biol.Chem.284:17731-4166.McIntyreTM,PontslerAV,SilvaAR,StHilaireA,XuY,etal.2003.溶血磷脂酸(LPA)的细胞内受体的鉴定:LPA为一种跨细胞PPARy激动剂的鉴定(Identificationofanintracellularreceptorforlysophosphatidicacid(LPA):LPAisatranscellularPPARgammaagonist).Proc.Natl.Acad.Sc1.USA100:131-36其它先前技术如下:BalickiR(PolishJournalofChemistry1983,57:789-797)涉及4，4，4-三氟乙酰乙酸乙酯与氨基吡唑的异常环化缩合反应。该科学论文公开了本发明的化合物2(第792页，流程4，化合物14)。然而文章没有公开其中公开的化合物作为药物的应用。WO2003/062392公开了治疗与EDG受体相关的病症的方法。所公开的化合物在结构上不同于本发明的化合物。WO2009/135590描述了酰氨基取代的稠合环戊烷羧酸衍生物及其作为药物的用途。所公开的化合物结构不同于本发明的化合物。在该申请中引用的任何参考文献并不认可参考文献与该申请的先有技术相关。发明描述本发明具有提供新型LPA受体拮抗剂的目的。本发明的目的已经出人意料地在一方面通过提供以下式(I)的化合物及其生理学上可接受的盐、溶剂合物、互变异构体和立体异构体，包括其以所有比率存在的混合物得到解决:权利要求1.式(I)的化合物及其生理学上可接受的盐、溶剂合物、互变异构体和立体异构体，包括其以所有比率存在的混合物:2.依据权利要求1的化合物及其生理学上可接受的盐、溶剂合物、互变异构体和立体异构体，包括其以所有比率存在的混合物，其中:R1表示芳基、杂芳基、环烷基或芳基烷基，优选地为苯基、噻吩基、呋喃基、吡唑基、吡啶基、吲哚基或苄基，其可任选地被一个或多个选自以下的取代基取代:卤素、F、Cl、Br、1、CF3、烧基、甲基、烧氧基或甲氧基。3.依据权利要求1或2的化合物及其生理学上可接受的盐、溶剂合物、互变异构体和立体异构体，包括其以所有比率存在的混合物，其中:R2表不H、甲基或乙基。4.依据权利要求1-3中任何一项的化合物及其生理学上可接受的盐、溶剂合物、互变异构体和立体异构体，包括其以所有比率存在的混合物，其中:R3表不H、甲基或乙基。5.依据权利要求1-4中任何一项的化合物及其生理学上可接受的盐、溶剂合物、互变异构体和立体异构体，包括其以所有比率存在的混合物，其中:R4、R5相互独立地表示H、烷基、OH-烷基、烷氧基、甲基、乙基、羟基-乙基或甲氧基。6.依据权利要求1-5中任何一项的化合物及其生理学上可接受的盐、溶剂合物、互变异构体和立体异构体，包括其以所有比率存在的混合物，其中:R1表示芳基、杂芳基、环烷基或芳基烷基，优选地为苯基、噻吩基或苄基，其可任选地被一个或多个选自以下的取代基取代:卤素、F、Cl、Br、1、CF3、烷基、甲基、烷氧基或甲氧基，R2表不H、甲基或乙基，R3表不H、甲基或乙基，R4、R5相互独立地表示H、烷基``、OH-烷基、烷氧基、甲基、乙基、羟基-乙基或甲氧基，R6表示HX表示O。7.依据权利要求1-6中任何一项的选自以下的化合物及其生理学上可接受的盐、溶剂合物、互变异构体和立体异构体，包括其以所有比率存在的混合物:8.用于制备式(I)化合物的方法，所述方法包括以下步骤:(a)使以下式(II)化合物9.依据权利要求1-7中任何一项的化合物用于调节，优选地抑制LPA受体介导的生物活性，优选LPAl受体、LPA2受体、LPA3受体、LPA4受体、LPA5受体或LPA6受体介导的生物活性，最优选LPA2受体介导的生物活性的用途。10.包含至少一种依据权利要求1-7中任何一项的化合物的药物。11.包含至少一种依据权利要求1-7中任何一项的化合物的药物，所述药物用于治疗和/或预防选自以下的生理学和/或病理生理学病症:“癌症、肿瘤、恶性肿瘤、良性肿瘤、实体肿瘤、肉瘤、癌、过度增生性疾病、类癌、尤因氏肉瘤、卡波济氏肉瘤、脑肿瘤、源自脑和/或神经系统和/或脑膜的肿瘤、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、胃癌、肾癌、肾细胞癌、前列腺癌、前列腺癌、结缔组织肿瘤、软组织肉瘤、胰腺肿瘤、肝脏肿瘤、头部肿瘤、颈部肿瘤、喉癌、食道癌、甲状腺癌、骨肉瘤、视网膜母细胞瘤、胸腺瘤、睾丸癌、肺癌、肺腺癌、小细胞肺癌、支气管癌、乳腺癌、乳癌、肠癌、结肠直肠肿瘤、结肠癌、直肠癌、妇科肿瘤、卵巢肿瘤/卵巢肿瘤、子宫癌、子宫颈癌、宫颈癌、子宫体癌、宫体癌、子宫内膜癌、膀胱癌、泌尿生殖道癌症、膀胱癌、皮肤癌、上皮性肿瘤、鳞状上皮癌、基底细胞瘤、鳞状细胞癌、黑色素瘤、眼内黑色素瘤、白血病、单核细胞白血病、慢性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴性白血病、急性白血病、急性骨髓性白血病、急性淋巴性白血病、淋巴瘤、眼科疾病、脉络膜新生血管、糖尿病性视网膜病变、炎性疾病、关节炎、神经退行性变、移植排斥、转移性生长、纤维化、再狭窄、HIV感染、动脉粥样硬化、炎症、心力衰竭、心肌病、心肌梗死、心肌重塑、血管重构、高血压、周围动脉闭塞(性)疾病、再狭窄、血栓症、血管通透性障碍、炎性疾病、类风湿性关节炎、骨关节炎、肾病、肾乳头坏死、肾衰竭、肺病、慢性阻塞性肺疾病、哮喘、急性呼吸窘迫综合征、免疫性疾病、变应性疾病、肿瘤生长、转移、代谢性疾病、纤维化疾病、肺纤维化、心脏纤维化、血管纤维化、血管周围纤维化、肾脏纤维化、肝纤维化、纤维化的皮肤病症、牛皮癣、疼痛、瘙痒症、视网膜缺血/再灌注损伤、黄斑变性、精神障碍、神经退行性疾病、脑神精障碍、周围神经病症、内分泌紊乱、甲状腺机能亢进、瘢痕形成障碍或者用于心脏保护或肾脏保护和伤口愈合障碍、血管生成、心血管系统、骨骼、CNS和/或PNS”。12.依据权利要求10-11中任何一项的药物，其中在这种药物中包含至少一种另外的药理活性物质。13.依据权利要求10-11中任何一项的药物，其中在用至少一种另外的药理活性物质治疗之前和/或期间和/或之后应用所述药物。14.包含治疗有效量的至少一种依据权利要求1-7中任何一项的化合物的药用组合物，所述组合物任选地进一步包含至少一种另外的选自以下的化合物:生理学上可接受的赋形剂、辅助剂、佐剂、稀释剂、载体和/或除依据权利要求1-7中任何一项的化合物之外的另外的药用活性物质。15.试剂盒，其包含治疗有效量的至少一种依据权利要求1-7中任何一项的化合物和/或至少一种权利要求14的药用组合物和治疗有效量的至少一种其它的除依据权利要求1-7中任何一项的化合物之外的药理活性物质。全文摘要本发明涉及依据式(I)的新的吡唑并吡啶酮衍生物及其制备方法。这些吡唑并吡啶酮衍生物可用作用于治疗各种本发明公开的疾病的LPA受体拮抗剂。文档编号C07D487/04GK103189378SQ201180042323公开日2013年7月3日申请日期2011年8月5日优先权日2010年9月2日发明者K.席曼,W.施特勒,D.温克申请人:默克专利股份公司