一种卵磷脂和类黄酮小分子的组合物、制备方法和它们的用途的制作方法

专利名称：一种卵磷脂和类黄酮小分子的组合物、制备方法和它们的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种具有医学用途的组合物，更具体地说是由卵磷脂和类黄酮的分子组成的组合物在预防和治疗动脉粥样硬化等心血管疾病中应用。
背景技术：
急性冠状动脉综合症是死亡率极高的一类疾病。目前医学界对动脉粥样硬化心血管病的处理手段仅限于冠脉搭桥术、冠脉内装支架和导管术三种外科手术方法。
外科手术的危险性和局限性已是众所周知。所以通过将组织细胞内异常积聚的胆固醇尤其血管壁内动脉粥样硬化斑块中胆固醇转运出体外，减少血管中斑块堵塞体积从而治疗心肌梗死、心绞痛等急性冠状动脉综合症的方法是世界各大制药公司在开发新一代治疗动脉粥样硬化心血管病药上竞争的核心。而LUV是开发治疗急性冠状动脉综合症药最为重要的方向之一。黄茚甙元(CM105)是我公司应用世界先进的第三代抗心血管病药物筛选平台从中草药中筛选出来的天然小分子化合物，该小分子化合物可直接作用于细胞核受体PPAR系列及受PPAR调控的相关蛋白(如APOAI、APOCIII等的表达)来提高血浆中转运胆固醇的关键脂蛋白，高密度脂蛋白(HDL)含量，同时降低低密度脂蛋白(LDL)和总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)等含量。本发明介绍了一种用LUV和类黄酮小分子复方将人体细胞和组织中胆固醇，尤其血管壁内动脉粥样硬化斑块中胆固醇转运出体外，减少血管中斑块堵塞体积从而治疗心肌梗死、心绞痛等急性冠状动脉综合症中的应用。下面将详述LUV和CM105的复方的配比及它的作用机理。

发明内容
本发明的目的是提供一种由磷脂和类黄酮小分子-黄芹甙元组成的组合物。
本发明的另一目的是提供该类组合物的新医学用途。
本发明提供一种具有如下结构的黄岑甙元(CM105) 与卵磷酯组成组合物，该组合物的配比比例如下
黄芩甙元∶卵磷酯＝1份∶5～30份，根据制剂需要加入辅料组成组合物。
本发明提供LUV和CM105的不同比例组成的组合物对预防和治疗心血管疾病中的应用，其作用原理分述如下磷脂LUV的作用原理LUV是一种大的单层脂质体。LUV疗法是一种在不破坏肝脏胆固醇动态平衡的条件下，迫使胆固醇从身体外周部分逆向转运到肝脏的方法。胆固醇(未酯化的，酯化的和氧化的)和其他在动脉血管壁及组织细胞内外堆积的脂质在急性冠状动脉综合症形成中起到重要的作用。因此，从外周细胞、组织、器官和胞外区域移走胆固醇和其他有交换能力的物质，对治疗急性冠状动脉综合症致关重要。同时应该注意到，胆固醇主要是在肝中代谢，LUV携带胆固醇等进入肝脏一定不要破坏肝脏胆固醇代谢的动态平衡，也一定不要使血浆中引起动脉粥样硬化的载脂蛋白浓度升高。特定粒径如200nm粒径的LUV将可以完成此项功能。我们采用200nm孔径的膜挤压卵磷脂，可以得到直径大概为220nm-230nm±60nm的LUV。
LUV可以大量逆向转运多余的脂质，包括外周组织中的胆固醇和其他可交换物质和类似成分。可以从其他脂质双层膜那里接收未酯化的胆固醇，还可以携带蛋白质和随附的磷脂。其范围含盖血管壁、任何的膜、细胞、组织、器官和胞外区域和结构上可以交换的脂质，不仪包括胆固醇，还包括鞘磷脂、氧化脂质、溶血卵磷脂、蛋白质以及其它来源的磷脂。从而消除斑块，减轻严重的血管狭窄和血管成形后的再狭窄，有利于动脉粥样硬化的改善。
LUV必须限制合理的粒径。肝脏内皮细胞是圆形的开放形式，大约100-115nm，粒径小的脂质体(SUVs)，如50nm的SUV将大量胆固醇带进入肝细胞，使肝实质细胞过载甾醇，从而打乱了肝脏胆固醇动态平衡，导致CE浓度和有害的载脂蛋白(低密度脂蛋白(LDL)、VLDL-胆固醇)的浓度升高，同时启动了异常的基因调节，比如LDL受体基因(表达下降)，HMG辅酶A还原酶基因(表达下降)，胆固醇7-α羟化酶等。而这些可以加速而不是延迟血管综合症的发展。导致CE浓度升高可能涉及两个环节。其一，CE富积粒子在血浆和肝脏中的过度产生。在血浆中，LCAT可作用于SUVs，利用SUVs提供额外的磷脂和胆固醇去产生胆固醇酯和溶血卵磷脂。CE又被CETP转运给了LDL。其二，CE富积脂蛋白清除的削弱。在血浆中，SUVs将apoE从VLDL的夺走能减缓VLDL本身的清除，因此有助于其转换成LDL。在肝脏中，在胆固醇被动员过程中，胆固醇运到肝脏数量增加刺激了apoB，CE富积的脂蛋白的产生。
而特定大小的LUV(200～1000nm)可控制血浆中LDL浓度、VLDL-胆固醇的浓度。但不会引发肝脏代谢的紊乱。首先，LUVs由于直径大，不易通过肝脏实质细胞，大部分被Kupffer细胞吸收。Kupffer细胞在改变了脂质的甾醇结构后再逐步地将它运给肝实质细胞。因此说胆固醇通过肝实质细胞和Kupffer细胞进行清除的途径有截然不同的代谢产物。第二，动力学上LUVs和SUVs运输到肝脏的性质也是不同的，LUVs从血浆中转运一般比SUVs慢。第三，这两种载体吸收蛋白质的数量不同，由于它们截然不同的表面曲度，SUVs而不是LUVs，会很贪心地从VLDL上将aopE剥下来，使其在血浆中清除变慢，而有助于其向LDL转变。因此LUVs也不会影响肝脏中CETP，HMG辅酶a还原酶，LDL受体和胆固醇7-a羟化酶，LDL ChE的mRNA含量。因此，总的说来利用LUVs作为治疗急性冠状动脉综合症的药物，它可以直接朝向目标，由于它不造成肝脏脂质代谢的紊乱，因此即使使用高剂量也未发现它的毒副作用。
CM105是通过第三代抗动脉粥样硬化药物筛选平台从中草药中筛选出来的天然小分子化合物，该小分子化合物可直接作用于细胞核受体PPAR系列及受PPAR调控的相关蛋白(如APOAI、APOCIII等的表达)。该化合物可提高血浆中的高密度脂蛋白(HDL)含量，同时降低低密度脂蛋白(LDL)和总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)等含量。更为重要的是，CM105可以调控从周围细胞到血液，到肝脏的与胆固醇转运出体外相关的系列基因、受体、蛋白和酶。通过控制和调节这些基因、受体、蛋白和酶可以将血管壁细胞和动脉粥样硬化斑块细胞内的胆固醇运至细胞膜，通过升高的HDL将胆固醇转运到肝脏，在肝脏相关受体、酶的作用下，将HDL转运来的胆固醇排出体外。
主要用途及应用范围提示LUV复方的主要适应症是治疗动脉病理改变包括心绞痛(稳定型和不稳定型)、心肌梗死、心力衰竭和猝死、脑组织缺血(脑梗死)及脑部血管破裂造成的脑出血等。另外还包括动脉硬化症、静脉硬化症和相关静脉斑块沉积的各种疾病、脉管炎、充血性心力衰竭、高血压、冠心病引发的心率失常、外周血管病、一过性心肌缺血，外科手术等引起的缺血再灌注损伤、冠脉再狭窄、深静脉血栓形成、周边四肢缺血、斑块脱落和任何由于血管狭窄导致的缺血性病理改变；此药可以治疗I和II糖尿病及其引发的后遗症、糖尿病神经病变，视网膜病变等。该项目的最终研究成果将开发出一种临床上抗急性冠状动脉综合症及其相关疾病的重要药物。
制备LUV的工艺LUV提取以富含卵磷脂的大豆或鸡蛋粉为初始粗原料，用有机溶剂溶出其中的磷脂成分，然后经过硅胶柱层析去除色素和部分杂质，并浓缩、收集大豆或鸡蛋卵磷脂(phosphatidylcholine，PC)成分，再经过离子交换柱层析进一步除去杂质成分，成为可以用于LUVs制备的纯品卵磷脂(purified PC)；卵磷脂加入于圆底烧瓶中，先用N2尽量吹干，然后真空干燥，使EPC均匀的附着在瓶壁上；然后加入缓冲液或者水，振荡形成多层脂质体(multilemella visicle，MLV)，然后依次使用0.4um、0.2um聚碳酸酯滤膜，在高压下(100-450psi)，利用Extrusion技术制备LUVs。
仪器Agilent高效液相色谱仪样品(Sample EPC)自制对照品(Standard EPC)L-α-Phosphatidylcholine From Flesh Egg Yolk(SIGMA公司)蛋黄各种脂质中，卵磷脂是主要成分。我们通过高效液相色谱的方法对我们制备的蛋黄卵磷脂和国际上各实验室使用的SIGMA公司销售的蛋黄卵磷脂进行了鉴别。将卵磷脂样品与标准品的乙醇溶液分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图，样品主峰的保留时间与对照品主峰的保留时间一致。同时，样品与标准品主峰的紫外扫描图谱也一致，最大吸收波长均为204nm。这些结果表明，我们的制备品是高纯度的蛋黄卵磷脂。
CM105和LUV复方的研发LUV可以将外周细胞间质或细胞间隙的胆固醇逆向转运到肝脏，直接靶向治疗急性冠状动脉综合症；CM105全面调节基因表达整体调节机体的血脂组成，两者合用起到直接靶向作用和整体调节相互协调的效果。直径较大的大运载体LUV由于其特定的运作效果和模式，使它很难渗透到细胞间隙，因此也很难到达这种环境下的细胞表面。这样就使得外周组织中具有交换能力的物质(如胆固醇)很难被转运。因此，大直径的LUV和小直径的运载体——CM105调节内生的HDL——合用可以解决此类问题。小运载体HDL可以渗透到细胞间隙，到达细胞表面，所以可以有效转运这种物质。同时，合用后也可以解决小运载体容量有限的不足。所以，小运载体渗透到组织，从组织中得到物质，变得饱和。它们离开组织，到达血浆中的大运载体，在那里将物质转给大运载体。此后，小运载体容量得到恢复，回到组织，可以运载更多的物质。这种循环可以持续多次。另外，大运载体还可以完成对小运载体的部分改造。因此，LUVs和HDL之间存在相互作用，相互取长补短。LUVs可重塑HDL，通过给予更多磷脂使之变成更好的受体，而小运载体HDL可作为穿梭体，有效携带胆固醇到脂质体上。
此外，CM105不但可提高血浆HDL水平，还可以降低血浆LDL、TC、TG水平，起综合调节脂质代谢紊乱的作用。这种合用会产生多种有利于消除动脉粥样硬化斑块的作用，比如LUV和CM105的合用可共同搬运细胞氧化的脂质，共同减少其对内皮细胞的损坏，恢复内皮细胞分泌EDRF、CNP(C-type natrizuretic peptide)的能力。LUV和CM105的合用也可易化HDL运走可氧化脂质的相关酶的作用。LUV和CM105的合用可增加身体消除体内凝块的能力等等。因此LUV与CM105的合用各取其利而避其弊，得到了最佳的治疗效果。
CM105和LUV复方的体内药效学研究我们选用抗动脉粥样硬化最为常用和公认的试验动物，新西兰兔，制造动脉粥样硬化动物模型。分别研究空白对照组、模型对照组、单独LUVs治疗组、单独CM105治疗组、CM105联合三个不同剂量LUVs治疗组。采用隔天给药(静脉)的方式观察药物对动脉粥样硬化新西兰兔的影响。我们分别对家兔的血清、血管、肝脏、粪便中最为反应疗效的观测指标进行检测。观测指标分别为(1)血清①TC、TG、HDL-C、LDL-C、FC(2)血管①血管壁脂质生化TC、TG检测；②血管壁游离胆固醇；③胶原含量、巨嗜细胞、血管壁厚度；④斑块面积；(3)肝脏①总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)②游离胆固醇检测；③HMG-CoA还原酶；；(4)粪便胆酸值。
研究结果提示，LUV复方可以定向转运动脉粥样硬化斑块中的胆固醇，复方的作用效果远大于药物的单独使用。由于复方的匹配合理，药物具备了定向作用和全身调节的协同作用。机体在逆向转运胆固醇时，没有引发肝脏和机体代谢的紊乱，代谢后的胆固醇也快速通过肠道排除，没有影响机体的正常功能。
同时，本发明提供了一种可药用的组合物，该组合物由黄芹甙元化合物与卵磷脂(或其药用盐，或它们的药用溶剂化物)与适当的药用辅料组成。药用辅料的选择因施用途径和作用特点而异，通常是填充剂、稀释剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、乳化剂、助悬剂等。
本发明的组合物可以口服、注射(静脉、肌肉、皮下和冠状动脉内)、舌下、经颊、经直肠、经尿道、经阴道、经鼻、吸入或局部途径施用。优选的途径是口服。
本发明还提供了黄芹甙元化合物与卵磷脂可药用的组合物的制备方法。通常将黄芹甙元化合物与卵磷脂药用辅料相混合，经常规的制备方法制成适于一定途径施用的形式(剂型)。剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、软膏、膜剂、霜剂、气雾剂、注射剂、栓剂等。优选片剂和胶囊剂。
片剂和胶囊剂的组方可含有黄芹甙元化合物与卵磷脂，以及一种或多种常用辅料，例如淀粉、蔗糖、乳糖、葡萄糖、微晶纤维素、甘露糖等填充剂；羧甲基纤维素、明胶、海藻酸盐和聚乙烯吡咯烷酮等粘合剂；甘油等润湿剂；琼脂、乙基纤维素、羧甲基淀粉钠、碳酸钙等崩解剂；硬脂酸镁、滑石粉、聚乙二醇等润滑剂配制而成。
此外，本发明还提供了黄芹甙元化合物与卵磷脂或其药用盐，或它们的药用溶剂化物，或含有其中的任一个的可药用的组合物，作为人用(或动物用)药物的用途。
本发明还提供了黄芹甙元化合物与卵磷脂或其药用盐，或它们的药用溶剂化物，在制备治疗或预防任何由血管狭窄导致的缺血性病理改变的疾病的人用(或动物用)药物中的用途。
本发明特点1)在世界上首次将快速转运动脉粥样硬化斑块和组织间质中胆固醇的LUV和控制人体内整体转运血管壁细胞和动脉粥样硬化斑块细胞内胆固醇出体外的CM105类黄酮小分子化合物联用，产生了一个治疗急性冠状动脉综合症作用全面，功能强大的新方法。
2)在世界上首次采用特定粒径的LUV来消除动脉粥样硬化斑快。
3)在世界上首次以PPARα-ApoAI联用筛选平台筛选到纯天然的小分子化合物用于治疗急性冠状动脉综合症。
4)发明了制作特定粒径LUV的全新方法，方法高效、高产、低耗质量稳定。
5)发明了生产高纯度类黄酮小分子化合物CM105的最佳生产工艺。
应用本公司发明的，国际先进的体内病理动物模型、体外基因、蛋白、细胞新药高通量筛选平台，用综合评价方法筛选到全新治疗急性和慢性动脉粥样硬化心血管病药物。


以下我们将结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。
表1是动物分组与给药剂量。
图1是血浆TC(mg/dL)检测结果。
图2是血浆HDL-C(mg/dL)检测结果。
图3是血浆TG(mg/dL)检测结果。
图4是血浆L DL-C(mg/dL)检测结果。
图5是肝脏TC含量的检测结果。
图6是肝脏FC含量的检测结果。
图7是肝脏EC含量的检测结果。
图8是肝脏TG含量的检测结果。
图9是肝脏HMG-CoA活性的检测结果。
图10是血浆PAF-AH活性的检测结果。
图11是主动脉弓斑块厚度的检测结果。
图12是卵磷脂样品和标准品的主峰的保留时间比较。
图13是卵磷脂样品和标准品的主峰的紫外吸收比较。
具体实施例方式
实施例1试验材料1试剂饲料购自上海海科动物中心。
HE染色相关试剂。
血浆总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)生化检测试剂盒上海Roche。
HMG-CoA还原酶活性检测试剂(试剂名称、厂家参见附录实验Protocol)。
2器材动物饲养、麻醉、解剖相关器材；卵磷脂纯化；LUVS制备相关试剂和仪器；生化分析仪；-80℃冰箱；匀浆器，离心机；高效液相色谱仪以及相关分析柱；其他离心管等常用耗材。详见SOP。
试验动物1 动物品系新西兰兔2 来源由上海海科动物中心提供，许可证号SCXK(沪)2002-00153 体重试验开始时，1.4-1.7g之间4.数量60只5.性别雄性6.饲养条件家兔在上海凯曼生物科技有限公司普通级饲养房饲养。自由饮水，温度23℃±2，相对湿度40-70％。每天处理粪便、尿液2次，自由饮用过滤水和食用灭菌饲料。采用顶棚垂直送风，四周侧墙回风方式，使新鲜空气均匀分配到每个笼。全新风定时换气，室内形成大于大气压1毫米水柱的正压，以防止外界空气污染。每日光照12小时，黑暗12小时。
试验方法1.实验动物饲养与造模方法饲料配方基础饲料9380g中，添加胆固醇20g，椰子油300g，鲁花牌花生油(无胆固醇)300g。
饲喂方法每只兔子每天饲喂共早晚两次，早上60g，晚上80g，共计140g。饲喂过程检测动物体重并记录；定期检测血浆TC、TG量，并以此作为分组标准。采血前统一禁食12小时。
造模方法以含胆固醇的饲料饲喂5周，并检测血浆TC值。后停止饲喂胆固醇饲料，改喂基础饲料。
2.LUVS制备2.1溶解卵磷脂原料与上样液制备取出3kg蛋黄粉或者大豆原料，用5000mL丙酮，搅拌混匀，抽提3次；负压抽滤，滤饼尽量滤干，滤饼用1000mL异丙醇超声抽提3次，合并提取液(稍显黄色)，减压过滤回收异丙醇溶液，旋转蒸干，用柱层析洗脱液(异丙醇∶石油醚∶H2O＝200∶200∶25)约500mL溶解，作为卵磷脂上样液，准备进行柱层析。
2.2硅胶柱层析2.2.1浸泡取300g的300或者400目硅胶，用1000mL柱层析洗脱液浸泡过夜，准备装柱；2.2.2装柱与洗脱硅胶浸泡过夜后，湿法装柱；等待硅胶自然沉降致密后，开始用5000mL洗脱液洗柱；2.2.3上样洗柱结束后，保留大约10mL洗脱液，然后小心加入卵磷脂上样液；然后小心加入洗脱液，到一定高度后，加入足量的洗脱液，打开阀门，进行洗脱；2.2.4洗脱与收集正压洗脱。收集洗脱液，每300mL收集到一个容器中。用薄层层析(TLC)检验洗脱液中卵磷脂成分和含量，收集不见明显杂质的洗脱液部分。
2.2.5旋转蒸干将收集洗脱液旋转蒸干，并用乙醇溶解，浓度约0.1g/mL。取适量用于离子交换层析。
2.3层析2.3.1装柱取一只直径4cm的层析柱，称取200g层析用聚酰胺树脂(尼龙6)[巴陵石化有限责任公司，缓慢均匀的倒入层析柱内；然后加入无水乙醇洗柱，洗到洗脱液澄清；2.3.2上样取6-15g溶于乙醇的的卵磷脂，上样量不能超过4g/100g离子交换树脂，否则柱子会过载。上样后，打开阀门，让样本进入交换材料，然后加入乙醇洗脱。
2.3.3洗脱用无水乙醇进行洗脱。洗脱液每15mL收集一管。用薄层分析洗脱液中是否出现卵磷脂。根据检测结果，开始洗脱的第一个成分弃置不用，收集第二个成分的洗脱液，旋转蒸干，再于真空下干燥，至形成干燥的白色卵磷脂停止真空干燥，充入高纯氮气，密封保存备用。因为柱吸附的原因，得率一般可以达到60-70％。
2.4 LUVs制备实验2.4.1器材准备500(或者250)mL试剂瓶250℃除热原；Extrusion滤器下部装置2M NaOH除热原处理(室温浸泡2h)；生理盐水(医用)；布置N2钢瓶、紫外灭菌灯、正压洁净工作台的独立房间；超滤器除热原准备。聚碳酸酯滤膜2M NaOH浸泡0.5小时，除热原、备用。
2.4.2卵磷脂固体纯品卵磷脂称重，向烧瓶中加入大约20倍重量体积的millipore纯水；放在摇床上振荡，至瓶壁上的卵磷脂全部脱落，并形成均一的白色乳浊液(多层脂质体，MLVs)。温度4℃；时间约需4小时，如果需要可以延长过夜。
2.4.3 Extrusion制备LUVs在超净台上进行。0.4um、0.2um聚碳酸酯滤膜先经2M的NaOH溶液泡过后，然后置于millipore高压滤器中，组装完整并旋紧螺丝；MLV加入组装完好的滤器中，拧紧密封螺丝；过滤装置与氮气压力进气口连接，并拧紧连接螺丝；打开氮气阀门，慢慢开始加压，先加压到1Mpa(大约140psi)，此时开始Extrusion并促使MLVs转变成LUVs，流速可能会变慢，此时可以适当增加压力，但是不要超过3.0Mpa；依次更换使用0.4、0.2um膜过滤，直至所有MLV均形成均一直径(最终直径约200nm)的LUVs。LUVs为均一、半透明的乳浊液。
3.动物分组与给药方法动物分组动物预养两周，然后开始饲喂添加胆固醇的饲料，并于每周结束时检测血浆TC、TG指标。继续饲喂三周。检测此时血浆中TC、TG值。预先挑选、解剖两只动物，检测模型发展情况。如果模型建立情况良好，斑块均有形成，则停止饲喂含胆固醇的饲料，并进行分组。把三周内血浆TC值由高到低排列，连续6只一组，共分成五组。然后各组的高值与另一组的低值搭配，形成动物实验分组(如此保证每组的TC平均值基本相似)。组别和用药计划如下(包括一个模型组，一个空白对照组。空白对照组不需要进行饲喂胆固醇饲料)。
给药方式耳缘静脉给药。相对于0.9g/kg、0.6g/kg、0.3g/kg LUVS的剂量，LUVS注射液体积为7.5mL/kg、5mL/kg、2.5mL/kg体重。注射量随动物体重而做调整。模型组和空白对照组统一注射5mL/kg体重的生理盐水。
动物分组和给药方法见表1。
4.动物处死和标本处理依计划家兔连续注射LUVS七次后，耳缘取血，部分收集肝素抗凝的血浆，部分待凝固后收集血清。颈总动脉放血，处死动物。取肝脏置-80℃冻存备用。取心脏、主动脉弓(到肾的位置)，纵剖开，然后连同心脏一起用10％的中性甲醛固定一周。
检测指标1.血清TC、TG、HDL-C检测。将收集的血清，在Landmark-AGII全自动生化分析仪，用Roche试剂盒检测。
2. HE染色确定斑块厚度取动脉弓，10％甲醛水溶液固定24小时以上。然后依次用70％、80％和95％乙醇(两次)、无水ALC(三次)，进行脱水，时间分别是四个2h、三个1h、两个30min、3个1h，共11h。然后用两罐二甲苯、三罐蜡进行浸蜡。然后在温箱中，56-58℃进行石蜡包埋。石蜡凝固后，进行连续切片，然后转移到载玻片上，60℃烤片3小时，至石蜡融解，然后用两罐二甲苯、两罐95％乙醇、80％乙醇、70乙醇脱去石蜡，时间分别是3、3、5、2min。水洗之后，常规HE染色，现在苏木素中染色5min，如果发现染色过深，用酸进行分化；继续流水冲洗，然后快速进行伊红染色。经过两罐95％ALC、三罐无水ALC、一罐二甲苯处理，擦干净玻片，贴上标签，并用中性树脂封片。镜检测量斑块厚度，并拍照记录结果。
3.肝脏中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)检测分别称取每只兔子0.5g重量的肝组织，以磷酸buffer匀浆，然后在Landmark-AGII全自动生化分析仪，用Roche试剂盒检测。
4.肝脏游离胆固醇检测以上匀浆液取0.5mL，加入3.0mL乙酸乙酯，漩涡振荡30sec，然后每间隔3min混匀，以充分提取匀浆中得游离胆固醇。然后用HPLC进行检测，分析柱为C18ODS柱。用标准曲线计算游离胆固醇含量。具体步骤参见附录SOP。
5.肝脏中HMG-CoA还原酶检测方法见附录SOP。
6.血浆PAF检测家兔耳缘静脉采血，肝素抗凝，离心取血浆，-20℃保存备用。检测参照数据处理各检查指标数据录入SPSS进行统计学分析。
实验结果1. LUVs制备质量鉴定结果为了判定注射是否安全，使用前进行质量鉴定。我们已经建立的卵磷水的混合比例为1∶6(W/V)。经过多方面实验鉴定，动物实验所使用的卵磷脂和LUVS已经达到以下标准。
纯度＞98％(HPLC鉴定)。
Extrusion实验合格。
酸值0.1。日本标准为＜25。无国内标准。
皂化值196。国内医疗注射部颁标准为195~212。
过氧化值(mEq/Kg)0.25。德国产品标准为＜5。无国内标准。
无菌鉴定合格。
无热源根据药典规定的动物实验、和鲎试剂法鉴定均已合格。
澄明度鉴定合格。
pHLUVs液体pH为6.5。
毒副作用无。
LUVs粒径检测经过激光粒度测定仪进行多次测定后(以intensity统计为主)，发现粒径分布大约在200nm(±60nm)。均一性良好。
2.用药前后，实验动物血浆脂质浓度的变化2.1造模、用药期间，对新西兰兔血浆TC浓度检测指标的结果(图1)表明，用药前各组的TC在基本一致的情况下，LUVs用药组TC水平明显比非用药组要高，并且呈现明显的LUVs剂量依赖关系，这充分验证了LUVs从血管壁等外周组织夺取胆固醇的能力。但是CM105组对血浆TC含量的影响并不明显。
2.2造模、用药期间，对新西兰兔血浆HDL-C浓度检测的结果(图2)表明，向家兔注射LUVs之后，血浆HDL-C明显升高。这说明LUVs的使用促进了HDL-C对脂质的运输，这是防治动脉粥样硬化的积极因素。
2.3造模、用药期间，对新西兰兔血浆TG浓度检测的结果(图3)表明，向家兔注射LUVs之后，血浆TG含量没有显著变化。说明LUVs转运外周组织胆固醇的能力高于转运TG的能力。
2.4造模、用药期间，对新西兰兔血浆LDL-C浓度检测的结果(图4)表明，向家兔注射LUVs之后，血浆LDL-C的测量结果急遽升高，属于严重反常的结果。后来，我们制作了含有胆固醇的脂质体，用同一种试剂盒进行检测，发现该试剂盒可以检测LUVs本身含有的胆固醇，该试剂盒不能区分LDL和LUVs的胆固醇。所以在使用LUVs的家兔中，对LDL-C含量检测的结果是LDL和LUVs含有的胆固醇的含量之和。体内LDL、HDL水平是相对恒定，所以LDL使用LUVs后的检测结果的急遽升高，是由于LUVs从血管壁外周组织剥夺、转运脂质的结果，LDL-C测定结果呈现明显的剂量依赖关系也从侧面证明这一点。这也证明了LUVs转运脂质的强大能力。
3.用药以后实验动物肝脏脂质含量的变化3.1用药以后对新西兰兔肝脏TC含量的检测结果(图5)表明，和使用LUVs可以促进血浆TC升高一样，使用LUVs还可以升高肝脏中TC的含量。我们认为这是LUVs从外周组织积极的转运脂质，促进了脂质反相运输的结果。不仅如此，与对照组比较，CM105的使用明显升高了肝脏的TC水平，并且在LUVs同时使用的情况下，表现出明显的叠加效应。这也验证了LUVs以前的动物实验的结果。
3.2用药以后对新西兰兔肝脏FC含量的检测结果(图6)表明，使用LUVs还可以升高肝脏中TC的含量，与对照组比较，CM105的使用明显升高了肝脏的TC水平，并且在LUVs同时使用的情况下，同样表现出明显的叠加效应。
3.3用药以后对新西兰兔肝脏EC含量的检测结果(图7)实际上和肝脏TC的检测结果一致，因为肝脏TC的含量的主要成分还是CE，而FC只是很少一部分，约5％。
3.4用药以后对新西兰兔肝脏TG含量的检测结果(图8)表明，用药后肝脏的TG水平基本上没有明显差别。
4.用药以后实验动物肝脏HMG-CoA还原酶活性的变化(图9)表明，用药后HMG-CoA还原酶活性没有因为LUVs所引起的脂质反相运输而受到抑制。这说明LUVs在脂质代谢角度上，并不会导致肝脏代谢过载，也具有显著的优势。同时还可以看出，与对照组比较，CM105可以明显的升高肝脏HMG-CoA活性。
5.用药以后实验动物血浆PAF-AH活性的检测结果(图10)表明，LUVs和CM105的使用均能升高血浆中PAF-AH活性的水平。在原理上，这种效应可以消除血浆中过多的血小板激活因子(PAF)，从而降低炎性反应，如此可以延缓动脉板块的形成速度。
6.用药后，照组和用药组主动脉弓斑块厚度的切片实验结果(图11)作为示例说明。用药后，主动脉弓的平均斑块厚度变小，血管壁内孔径增大。这种改变的意义是可以降低各种动脉粥样硬化疾病的发生几率。
通过这次实验，我们认为现有LUVs和CM105制造工艺稳定可靠，安全性良好，疗效等检测目标基本都已经达到预期值，表现为血浆TC、HDL-C水平显著升高，肝脏TC、FC等脂质水平也显著升高，而且LDL-C的检测结果，都从很多方面证实了LUVs反相运输转运外周组织胆固醇的能力。HMG-CoA的实验结果证明LUVs没有造成肝脏胆固醇代谢过载失衡；PAF-AH活性检测结果证实了对炎症反应的良好效应；动脉粥样硬化斑块厚度的缩小则直接显示了LUVs对动脉粥样硬化的治疗效果。实验结果也与其他研究结果具有一致性。LUVs和CM105合用是一种非常理想的防治动脉粥样硬化相关疾病的药物制剂。
表1动物分组与给药剂量

权利要求
1.一种由卵磷脂与黄岑甙元配比组成的组合物，该组合物的配比为黄芩甙元∶卵磷脂1份∶5～30份，辅料组成。
2.如权利要求1所述的组合物中的卵磷脂的制备方法，由如下步骤组成a、由蛋黄粉或大豆为原料用有机溶剂提取磷脂成份，然后经硅胶柱层析流动相为异丙醇∶石油醚∶水＝200∶200∶25V/V；b、浓缩、硅胶层析和冼脱液收集大豆或鸡蛋的卵磷脂；c、粗卵磷酯经交换树脂层析进一步除去杂质，得纯卵磷酯；d、卵磷酯放入园底烧瓶中，用N2吹干，真空干燥，使EPC均匀附着在瓶壁上，加入缓冲液或水，震荡形成多层脂质体，然后依次用0.4um、0.2um聚碳酸酯滤膜，在高压下用Extrusion技术制备配方用卵磷酯。
3.根据权利要求2所述的组合物中的卵磷脂的制备方法，其特征在于卵磷酯的制备原料为大豆或蛋黄粉。
4.根据权利要求2所述的组合物中卵磷脂制备方法，其特征在于大脂质体尺寸和形状是200nm，大于上述的肝窦状小管细胞内皮层膜孔的。
5.根据权利要求2所述的组合物中卵磷脂制备方法，其特征在于脂质体在上述的治疗过程中进行阶段性给药。
6.根据权利要求2所述的组合物中卵磷脂制备方法，其特征在于大的脂质体包括单层脂质和多层脂质体。
7.根据权利要求2所述的组合物中卵磷脂制备方法，其特征在于脂质体直径大于200nm。
8.如权利要求1所述的组合物的用途在制备治疗任何由于血管狭窄导致的缺血性病理改变包括(d)的疾病药物中应用。
9.根据权利要求8所述的组合物的用途，其特征在于非肠内给药可以通过静脉给药，动脉给药，肌肉内给药，皮下给药，真皮穿刺给药，腹膜给药，胸内给药，通过淋巴腺，血管内给药包括毛细管和动静脉连接处给药，直肠给药，通过长期存在的导管给药，通过临时插入的导管给药。
10.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于非脂质体粒子包括甘油三酯-磷脂乳浊液，这种乳浊液包括不会被肝脏实质细胞很快吸收的乳浊液，大部分不被肝实质细胞吸收的乳浊液，甘油三酯-磷脂-蛋白质乳浊液，以及被肝脏缓慢吸收的乳浊液。
11.根据权利要求8所述的组合物的用途，其特征在于运载外周胆固醇和鞘磷脂进入肝脏的药物制剂主要包括大小形状比内皮细胞膜孔大的脂质体，因此这些脂质体足够大而不会渗透出来并且不会与肝脏实质细胞相互作用。
12.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于运载外周胆固醇和鞘磷脂的制药工具主要包括首先一个容器，里面有进入机体肝脏而降低动脉损伤的药物成分，该成分包括大小形状比内皮细胞膜孔大的脂质体，因此这些脂质体足够大而不会渗透出来并且不会与肝脏实质细胞相互作用；第二个容器有化合物，这些化合物包括胆固醇受体和可以促进内源HDL产生的药物。
全文摘要
本发明公开了一种用卵磷脂和类黄酮小分子组成的组合物将人体细胞和组织中胆固醇，尤其血管壁内动脉粥样硬化斑块中胆固醇转运出体外，减少血管中斑块堵塞体积从而可在制备治疗心肌梗死、心绞痛等任何由于血管狭窄导致的缺血性病理改变。包括心力衰竭和猝死、脑组织缺血及脑部血管破裂造成的脑出血等，另外还包括动脉硬化症、静脉硬化症和相关静脉斑块沉积的各种疾病、脉管炎、充血性心力衰竭、高血压、冠心病引发的心率失常等疾病中应用。
文档编号C07F9/10GK1748706SQ20041006633
公开日2006年3月22日 申请日期2004年9月13日 优先权日2004年9月13日
发明者龚邦强, 张国晶, 李勇 申请人:上海凯曼生物科技有限公司