用于改变端粒酶介导的端粒的巯基嘌呤核糖核苷类似物的制作方法
【专利说明】用于改变端粒酶介导的端粒的巯基嘌呤核糖核苷类似物
[0001] 相关申请的夺叉引用 本申请要求2013年4月8号提交的美国临时申请序列号61/809,575的权益，其内容 特此通过引用以它们的全部并入本文。
[0002] 背景 1.发明领域 相关领域的描述。本公开通常涉及包含特别通过抗增殖机理具有抗癌效果的化合物的 药物组合物和治疗方法。
[0003] 2.相关领域的描述 端粒是位于线性染色体的最末端的高度特异性结构。主要归因于末端复制问题，正常 人类体细胞随着各个细胞分裂而逐渐失去它们的端粒。虽然大部分正常人类细胞不具有端 粒酶活性，85-90%的癌细胞却具有，所述端粒酶活性稳定它们的端粒。
[0004] 端粒是在线性真核染色体的末端发现的由TTAGGG DNA重复的多拷贝构成的保 护性结构。端粒与6种蛋白相关联；TRF1、TRF2、TIN2、Rapl、TPPl和P0T1，其一起被称作 shelterin 复合体(de Lange T. , ^Shelterin: the protein complex that shapes and safeguards human telomeres," Genes & Development 2005;19:2100-10)。 shelterin 复合体贯穿细胞周期存在于端粒，并已显示覆盖染色体末端使其免于被识别为DNA损伤部 位。
[0005] 归因于末端复制问题，在所有正常体细胞中的端粒随着各个细胞分裂经历逐渐的 缩短，最终引起细胞衰老。但是，复制依赖性的端粒缩短可被核糖核蛋白酶，端粒酶所抵消。 端粒酶是将TTAGGG重复添加至线性染色体末端的细胞逆转录酶。端粒酶具有两个组分， hTERT (端粒酶催化蛋白组分）和hTR或hTERC (端粒酶功能性RNA组分或模板RNA组 分）(Greider CW和Blackburn EH, "Telomeres, telomerase and cancer, '，Scientific American. 1996; 274:92-7)。虽然大多数正常人类体细胞不具有端粒酶活性，但其几乎普 遍地在初级人类癌细胞中被检测到（~85-90%)。因此，在没有端粒酶活性的正常细胞中的 逐渐缩短为肿瘤发生提供了初始障碍。
[0006] 因此，在癌细胞中，端粒酶和端粒代表对于治疗方法具有吸引力的几乎通用的目 标。因为大多数正常体细胞不具有端粒酶活性，所以选择性地靶向端粒酶活性的治疗可能 是有益的。另外，可在端粒酶活性期间干扰端粒测序以干扰shelterin复合体的结构或功 能的治疗也可能是有益的。
[0007] 概沭 本公开涉及化合物6-巯基嘌呤核糖核苷及其类似物用于肿瘤、癌症和过度增殖疾病 的治疗的用途。具体地，本公开的化合物可在体内转化成为端粒底物并可被端粒酶识别用 于并入端粒酶活性的细胞的端粒中，导致诱导端粒酶活性的细胞的细胞死亡。虽然不希望 受限于任何具体的理论，但是所描述的化合物并入端粒中被认为是即时的端粒DNA链终止 剂和/或归因于变更的端粒结构而被识别为具有端粒的DNA损伤。
[0008] 根据本公开，可向对象给药根据下式I的化合物：
其中R可以是H、羟基、氨基、烷基氨基、氟化物、酰基、C1-C2。烷基或醚基、磷酸酯基、二 磷酸酯基、三磷酸酯基、膦酸酯基或磷酸二酯基；其中R'可以是H、羟基、氟基（fluoride group)、C1-C 2q烷基或醚基；其中R"可以是核糖（ribo)或阿拉伯糖（arabino)构型的轻 基、氟化物或氨基；其中R 3可以是氨基或烷基氨基；及其药学上可接受的盐、溶剂化物或多 晶型物。在各种实施方式中，R是H，R'是羟基，及R"是H，且此类化合物在此称作6-硫 代_2'_脱氧鸟嘌呤核苷。
[0009] 根据本公开，可向对象给药根据下式II的化合物：
其中R可以是H、酰基、C1-C2。烷基或醚基、磷酸酯基、二磷酸酯基、三磷酸酯基、膦酸酯 基或磷酸二酯基；其中R'可以是H、羟基、氟化物、C1-C2。烷基或醚基；其中R"可以是核糖或 阿拉伯糖构型的羟基、氟化物或氨基；其中R 3可以是氨基或烷基氨基；及其药学上可接受 的盐、溶剂化物或多晶型物。在各种实施方式中，R是H，R'是羟基，及R"是H。
[0010] 根据本公开，可向对象给药可包含根据下式III的化合物的药物组合物：
其中R1可以是H、-C(O) (CH2)nCH3，其中η = 6-16,且此类化合物在此称作6-硫 代_2'_脱氧鸟嘌呤核苷。
[0011] 根据本公开，可向对象给药可包含根据下式IV的化合物的药物组合物：
其中R2可以是精胺或亚精胺，且此类化合物在此称作6-硫代-2' -脱氧鸟嘌呤核苷。
[0012] 根据本公开，可向对象给药可包含根据下式V的化合物的药物组合物：
其中R2可以是精胺或亚精胺，且此类化合物在此称作6-硫代-2' -脱氧鸟嘌呤核苷。
[0013] 本公开的另外的方面是药物组合物，其包含抗癌有效量的一种或更多种式I、II、 III、IV或V的化合物，任选地与有效量的至少一种另外的抗癌剂或至少一种载体、添加剂 或赋形剂组合。
[0014] 本公开进一步的方面涉及用于治疗癌症和其它过度增殖疾病，包括肿瘤，特别是 恶性肿瘤和癌症和处理具有端粒酶过度活化的任何细胞的方法。
[0015] 本公开的其它的方面包括治疗方法，所述方法包括给药有效量的根据本公开的 6-巯基嘌呤核糖核苷类似物及给药包含另一抗癌剂的第二药物组合物。施用可同时发生、 在顺序的阶段中发生或以几个阶段给药，其中所述几个阶段在时间上至少部分重合或相隔 一定的时间间隔。多重抗癌剂治疗可提供抗癌剂一者或二者的抗癌活性的累加效应或进一 步的协同增强。
[0016] 在本公开的方法或组合物的上下文中讨论的实施方式可关于在此描述的任何其 它的方法或组合物来使用。因此，附属于一种方法或组合物的实施方式也可应用至本发明 的其它的方法和组合物。在此说明书中使用的"一"（"a"或"an"）可表示一或更多。在 此权利要求（一项或更多项）中使用的，当与词语"包含"一起使用时，词语"一"可表示一 或多于一。
[0017] 尽管本公开支持仅指替代物和"和/或"的界定，但是除非明确指出仅指替代物或 替代物互相排斥，否则在权利要求中使用术语"或"用于表示"和/或"。在此使用的"另一" 可表示至少再一或更多。
[0018] 贯穿本申请，术语"约"用于表明一个值包括对于设备、用以测定值的方法误差的 固有偏差、或存在于研究对象中的偏差。
[0019] 本发明的其它目标、特征和优势将从以下详细描述中变得显而易见。然而，应当理 解虽然详细描述和具体实施例表明本发明的优选实施方式，但是其仅通过举例说明的方式 被给出，因为从该详细描述中，在本发明的精神和范围内的各种改变和修改对于本领域技 术人员将变得显而易见。
[0020] 附图简沐 以下附图形成本说明书的一部分，并被包括以进一步展示本发明的某些方面。参照这 些附图中的一张或更多张，结合在此呈现的【具体实施方式】的详细描述，可更好地理解本发 明。
[0021 ] 图1A. 6-硫代鸟嘌呤（6-硫代-G)和6-硫代-脱氧鸟嘌呤核苷（6-硫代-dG)的 化学结构。
[0022] 图1B.展示使用6-硫代-dG (3 μ M)和6-硫代-G (3 μ M)处理HCTl 16和BJ细 胞1周（每3天）的细胞计数的图表。（对照；未处理）。
[0023] 图2.不使用药物（一）、使用6-硫代-dG (6dG)、GRN163L (Im)或6-硫代-dG和 GRN163L的组合（combo)的HCT116细胞处理方案的时间表。每周收集IxlO6个细胞/样 品用于TRF分析。用10 μ M 6-硫代-dG处理HCT116细胞12-16周。在使用10 μ M 6-硫 代-dG处理12周之后，使用10 μ M 6-硫代-dG和3 μ M GRN163L的组合处理所述细胞2-4 周或仅使用GRN163L处理所述细胞2-4周或停药2-4周。（对照；未处理）。在各个处理方 案结束时，使用TRF分析来确定端粒缩短。
[0024] 图3Α和3Β. (A)显示对于具有短端粒和长端粒的细胞，端粒酶抑制剂的给药和细 胞死亡之间的延迟期的对比线图。（B)显示对于具有短端粒和长端粒的细胞，端粒变更的 化合物的给药和细胞死亡之间的延迟期的对比线图。
[0025] 图4.每细胞的DNA损伤病灶。使用6-硫代-dG (3 μ Μ)和6-硫代-G (3 μ Μ) 处理的HCT116细胞（n=75，SD来自两个独立的实验）。在未配对的Student t检验中， **Ρ=(λ 003, *#Ρ=(λ 0005, *Ρ=(λ 0141 (6-硫代-G 相对 6-硫代-dG)。在未配对的 Student t检验中，生理盐水，无显著性差异。（对照；未处理）。
[0026] 图5. (A) γ-Η2ΑΧ在未封端的端粒上的结合。6-硫代-dG诱导γ-Η2ΑΧ的端粒 定位。代表性数据。照片通过DeltaVision获得并随后通过Autoquant Χ3去裙合。使用 DAPI (蓝色）进行DNA染色。在合并图像中，红点显示DNA损伤（γ -Η2ΑΧ)，绿点显示TRF2及 黄点显示TIF (表明端粒上的DNA损伤的端粒机能障碍诱导的病灶）。（B)使用6-硫代-dG (3 μ M)或6-硫代-G (3 μ M)处理的HCT116细胞的TIF指数（TIF阳性细胞的百分数）。 与TRF2共定位的具有四个或更多个γ-Η2ΑΧ病灶的细胞由Imaris软件记分为TIF阳性 (n=75, SD来自两个独立的实验）。在未配对的Student t检验中，*Ρ〈0. 05，#Ρ=0. 0063 (与赋形剂对照相比较）。在未配对的Student t检验中，生理盐水，无显著性差异。（对 照；未处理）。
[0027] 图6A和6B.⑷显示使用6-硫代-dG (3 μ M)和6-硫代-G (3 μ M)处理、并在72 小时之后使用各种剂量的电离辐射辐照的HCT116的存活分数的线图。处理之后，将细胞以 不同的密度接种并培养10天。（B)显示使用cell titer glow发光分析来确定的细胞活性 的线图。
[0028] 图7A和7B. (A)显示在使用HCTl 16的异种移植动物模型中的肿瘤生长速率减小 的线图。（B)显示使用A549细胞的异种移植动物模型中的肿瘤生长速率减小的线图。
[0029] 图8A和8B. (A)显示与对照相比较，在接受1. 67 mg/kg的6-硫代-dG或6-硫 代-G的WT小鼠模型中的重量减轻的线图。⑶显示与对照相比较，在