人类的端粒酶催化亚单位的制作方法

专利名称：人类的端粒酶催化亚单位的制作方法
技术领域：
本发明涉及编码端粒酶和相关的多肽的催化亚单位的新的核酸。特别是，本发 明涉及人类端粒酶的催化亚单位。本发明提供了涉及医药，分子生物学，化学，药理 学，和医学诊断和预测技术的方法和组合物。
背景技术：
下面的讨论是打算将本发明领域介绍给读者。长期以来人们认为真核染色体末端的完全复制需要特异性的细胞成分(Watson， 1972，自然，新生物学，239: 197 ； Olovnikov, 1973，理论生物学杂志，41: 181)。由 常规DNA聚合酶进行的线性DNA链的复制需要RNA引物，并且能够仅引导从5’到3’ 进行复制。当结合在真核染色体DNA链的极端的5’末端的RNA被去除时，导入了一 个缺口，导致随着复制的各轮的进行，子链逐渐缩短。据认为端粒，物理结构定位于染 色体末端的蛋白质-DNA结构的缩短与由于正常人类的体细胞在体外和体内的细胞的衰 老或老化现象相关(参见，例如Goldstein，1990，科学249 1129 ； Mrtin等人，1979， 实验室调研23: 86; Goldstein,等人，1969，美国科学院年报64: 155 ；和Schneider禾口 Mitsui, 1976，美国科学院年报73: 3584)。因此端粒酶的长度和完整与细胞入老化期有关(即丧失增殖能力)。但是，细胞 保持(或增加)端粒长度的能力允许细胞逃脱老化，即变成永生。已经在许多系统中调研了端粒酶和端粒DNA的结构(参见，例如Harley和 Villeponteau, 1995, Curr.Opin.Genet.Dev.5 249) 在大多数生物体，端粒 DNA 由串 联排列的非常简单的序列组成；对于人类和其它脊椎动物端粒DNA由成百上千的串联 重复的序列TTAGGG组成。用于测定和调节细胞的端粒长度的方法描述于PCT公开 W093/23572 和 W096/41016。端粒的维持是已知为端粒酶的端粒特异性DNA聚合酶的作用。端粒酶是核糖 核蛋白质(RNP)，它利用其RNA成分的一部分作为端粒重复DNA合成的模板(Morin， 1997，欧洲癌症杂志 33 750 ； Yu 等人，1990，自然 344 126 ； Singer 和 Gottschl ing，1994，科学 266: 404 ； Autexier 和 Grei der，1994，基因发展，8: 563 ； Gil ley 等 人类，1995，基因发展，9 2214 ； McEachern 和 Blackburn，1995，自然 367 403 ； Blackburn, 1992，生物化学分析和综述，61 113 ； Greider, 1996，生物化学分析和综 述，65:337)。人类和其它端粒酶的RNA成分已经被克隆和定性(参见，PCT公开 W096/01835和Feng等人，1995，科学269 1236)。但是，端粒酶的蛋白质成分的定性 已经是困难。部分原因是因为纯化端粒酶RNP证明是困难的，在其被表达的细胞中RNP 以非常低的水平存在。例如已经估测已知表达高水平的端粒酶活性的人类细胞每个细胞 仅仅具有约100个酶分子。
与端粒和端粒酶与细胞的增殖能力(即细胞不定期分裂的能力)的关系相一 致，在永生的细胞系和非常多样化的肿瘤组织组中检测到端粒酶活性，但是在正常的体 细胞培养物或与肿瘤邻接的正常的组织没有检测到(即，没有或低于测试的界限)(参 见，例如美国专利 5,629,154 ； 5,489,508 ； 5,648,215 ；和 5,639,613 ；参见例如，Morin, 1989，细胞，59: 521 ； Shay 和 Bacchetti 1997，欧洲癌症杂志 33: 787 ； Kim 等人， 1994，科学 266: 2011 ； Counter 等人，1992，EMBO J. 11 1921 ； Counter 等人，1994， 美国科学院年报91，2900 ； Counter等人，1994，病毒学杂志68 : 3410)。但是，肿瘤 中端粒酶活性的水平和患者的可能的临床结果之间的关系已经有人报道(例如，美国专 利5,639,613，见上文；Langford等人类+，1997，人类病理学28 416)。在人类的生 殖细胞，增殖的茎干或祖先细胞和失活的淋巴细胞中也已经检测到端粒酶活性。在体 细胞茎干或祖先细胞，和在活化的淋巴细胞中，通常端粒酶活性是非常低的或仅仅瞬间 表达(参见，Chiu等人类，1996，茎干细胞14 239 ； Bodnar等人类，1996，Exp.Cell Res.228 58; Taylor 等人类，1996，皮肤研究杂志 106 759)。人类端粒酶是诊断和治疗与细胞增殖和老化相关的疾病，例如癌症的理想 的靶。用于诊断和治疗癌症和其它端粒酶相关的人类疾病的方法描述于美国专利 5,489,508，5,639,613，和5,645,986。通过监测端粒酶预测肿瘤进展的方法描述于美国专 利5,639,613。人类端粒酶的催化蛋白质亚单位的发现和定性提供了额外的用于端粒酶和 用于疾病诊断和治疗的有用的测试。但是，催化蛋白质亚单位的一级序列的克隆和测定 允许更有效地治疗人类癌症和与细胞增殖能力和老化相关的其他疾病。

发明简述本发明提供了端粒酶逆转录酶蛋白质或其变异体，或其片段的分离的，基本上 纯化的，或重组蛋白质制剂。在一个实施方案中，蛋白质的特征在于具有包括下列氨基 酸序列的限定的基序Trp-RfX7-R1-R1-R2-X-Phe-Phe-Tyr-X-Thr-Glu-X8_9-R3-R3-Arg-R4- X2-Trp其中X是任何氨基酸和下方角标是指连续的残基的数目，Rl是亮氨酸或异亮氨 酸，R2是谷氨酸或精氨酸，R3是苯丙氨酸或酪氨酸，和R4是赖氨酸或组氨酸。在一个 实施方案中，该蛋白质具有人类TRT的序列。在其它实施方案中，本发明涉及与这样的 蛋白质的亚序列共享基本的序列等同性的肽和多肽。在相关的实施方案中，本发明提供了编码端粒酶逆转录酶蛋白质的分离的，基 本上纯化的或重组的核酸。在一个实施方案中，该核酸编码包括氨基酸序列的蛋白质Trp-R1-X7-R1-R1-R2-X-Phe-Phe-Tyr-X-Thr-Glu-X8-9-R3-R3-Arg-R4-X2-Trp。
在另一个实施方案中，该核酸具有编码人类TRT蛋白质的序列。在其它实施方案中，本 发明提供了与这样的核酸序列共享基本序列等同性的寡聚核苷酸和多聚核苷酸。在一个实施方案中，本发明涉及人类端粒酶逆转录酶ChTRT)蛋白质。因此， 在一个实施方案中，本发明提供了 hTRT蛋白质或其变异体，或其片段的分离的，基本 上纯化的，或重组蛋白质制剂。在一个实施方案中，该蛋白质的特征在于具有与附图 17 (SEQUENCE ID NO 2)的hTRT蛋白质或其变异体，或其片段具有至少约75%或至 少约80%序列等同性的氨基酸序列。在相关的方面，hTRT蛋白质具有SEQUENCE ID NO 2的序列。在一些实施方案中，该蛋白质具有一个或多个端粒酶活性，例如催化活性。在一个实施方案中，hTRT蛋白质片段具有至少6个氨基酸残基。在其它实施方案 中，hTRT蛋白质片段具有天然存在的hTRT多肽的至少约8个，至少约10个，至少约12 个，至少约15个或至少约20个邻接的氨基酸残基。仍然在其它实施方案中，hTRT蛋白 质片段具有至少约50或至少约100个氨基酸残基。本发明也提供了包括hTRT蛋白质和RNA的组合物。该RNA可以是端粒酶 RNA,例如人类端粒酶RNA。在一个实施方案中，hTRT蛋白质和人类端粒酶RNA ChTR) 形成具有端粒酶活性的核糖核蛋白复合物。 在一个实施方案中，本发明提供了包括hTRT蛋白质的分离的人类端粒酶，例如 包括hTRT蛋白质和包括hTR的基本上纯化的人类端粒酶。在一个实施方案中，，端粒 酶是至少约95%纯化的。该端粒酶是从表达端粒酶活性的细胞，例如重组宿主细胞中分 离的。在另一个方面，本发明提供了包括编码hTRT蛋白质的核酸序列的分离的，合成 的基本上纯化的或重组的多核苷酸。在一个实施方案中，该多聚核苷酸具有编码具有附

图17 (SEQUENCE ID NO 2)列出的氨基酸序列或在所述氨基酸序列中包括一个或多个 保守的氨基酸(或密码子)替代或一个或多活性改变的氨基酸(或密码子)替代的序列的 hTRT蛋白质的核苷酸序列。在相关的方面，该多聚核苷酸在严格条件下与具有附图16 列出序列(SEQUENCE ID NO: 1)的多聚核苷酸杂交。在另一个相关的方面，当与附图 16列出核苷酸序列(SEQUENCE ID NO: 1)相比时，利用具有缺席参数的BLAST算法， 该多聚核苷酸的核苷酸序列具有低于约0.5的最小的总数的可能性。在另一个方面，本发明提供了具有可操作连接到编码hTRT蛋白质的序列的启动 子序列的多聚核苷酸。该启动子可以是除了天然存在的hTRT启动子以外的启动子。在 相关的方面，本发明提供了包括hTRT启动子的表达载体。本发明也提供了长度至少为10个核苷酸的分离的，合成的，基本上纯化的或重 组的多核苷酸，它包括与天然存在的hTRT基因或hTRT mRNA的邻接序列相同或精确互 补的至少10个核苷酸的邻接序列。在一些实施方案中，该多聚核苷酸是RNA，DNA, 或含有一个或多个非天然存在的，合成的核苷酸。在一个方面，该多聚核苷酸与天然存 在的hTRT基因或hTRT mRNA的至少10个邻接核苷酸的邻接序列相同或精确互补。例 如，该多聚核苷酸可以是反义多聚核苷酸。在一个实施方案中，反义的多聚核苷酸包括 至少约20个核苷酸。本发明进一步提供了通过将重组hTRT蛋白质与端粒酶成分在一定的条件下接触 制备重组端粒酶的方法，所述条件是便于所述的重组蛋白质和所述的端粒酶RNA成分结 合以形成能够纯化核苷酸加入到端粒酶底物的端粒酶。在一个实施方案中，hTRT蛋白 质具有附图17列出的序列(SEQUENCE ID NO 2)。该hTRT蛋白质可以是在体外表达 系统产生的并且与端粒酶RNA混合，或在另一个实施方案中，该端粒酶RNA可以是在体 外表达系统中共表达。在一个实施方案中，该端粒酶RNA是hTR。在另一个可选择的 实施方案中，所述的接触出现于细胞中，例如人类细胞。在一个实施方案中，该细胞在 hTRT和该RNA接触之前或在导入，例如通过转染hTRT多聚核苷酸之前不具有端粒酶活 性。在一个实施方案中，端粒酶RNA由所述的细胞天然地表达。本发明也提供了含有本发明的重组多聚核苷酸例如具有可操作连接到一个启动子上的hTRT蛋白质编码序列的多核苷酸的细胞，例如人类细胞，鼠，或酵母细胞。在 特定的方面，细胞是脊椎动物细胞，例如来自于哺乳动物，例如人类的细胞，并且相对 于其它方面相同但是不具有所述的重组多聚核苷酸的细胞而言具有增加的增殖能力，或 相对于其它方面相同但是不具有所述的重组多聚核苷酸的细胞而言具有增加的端粒酶活 性。在一些实施方案中，所述细胞是永生的细胞。 在相关的实施方案中，本发明提供了包括编码人类端粒酶逆转录酶多肽的多聚 核苷酸的生物体和细胞，例如转基因非人类生物体例如酵母，植物，细菌或非人类动 物，例如小鼠。本发明也提供了转基因动物和细胞，其中已经缺失(敲出)了 hTRT基 因或进行了突变以致于该基因不表达天然存在的hTRT基因产物。因此，在另一种可选 的实施方案中，转基因非人类动物具有突变的端粒酶基因，是端粒酶活性缺陷的动物， 是一种其TRT缺陷是由于编码TRT的突变基因引起的动物，所述TRT与野生型的TRT相 比，具有降低的端粒酶活性水平的并且是具有携带一个或多个突变包括错义突变，无义 突变，插入或缺失的突变TRT基因的动物。本发明也提供了特异性地与hTRT蛋白质结合的分离或重组抗体，或其片段。在 一个实施方案中，该抗体与以至少IO8M-1的亲和力结合。该抗体可以是单克隆或可以是 多克隆组合物，例如多克隆抗血清。在相关的方面，本发明提供了能够分泌该抗体的细 胞，例如杂交瘤。本发明也提供了测定化合物或治疗剂是否是端粒酶逆转录酶活性或hTRT表达的 调节剂的方法。该方法涉及检测或监测在该化合物或治疗剂给药之后，在细胞，动物或 包括hTRT蛋白质或多聚核苷酸的组合物中活性或表达的变化。在一个实施方案中，该方 法包括步骤提供了 TRT组合物，将TRT与测试化合物接触，测量TRT的活性，其中在 测试化合物存在下TRT活性的变化是所述测试化合物调节TRT活性的指示剂。在一些实 施方案中，所述组合物是细胞，生物体，转基因生物体或体外系统，例如表达系统，它 含有编码hTRT多肽的重组多聚核苷酸。因此，该方法的hTRT可以是体外表达产物。在 各种实施方案中，可以通过检测hTRT基因产物的丰度的变化，监测核苷酸标记物掺入到 端粒酶的底物，监测探针与延伸的端粒酶底物的杂交，监测延伸的端粒酶底物的扩增， 监测与测试化合物接触的细胞的端粒长度，监测端粒酶与染色体结合能力的丧失，或测 量端粒结构的积累或丧失而进行端粒酶活性或表达的检测。在一个方面，本发明提供了通过将生物学样品与特异性地与基因产物结合的探 针接触而检测生物学样品中hTRT基因产物的方法，其中该探针与基因产物形成复合物， 和检测该复合物，其中该复合物的存在与生物学样品中的hTRT基因产物的存在相关。该 基因产物可以是RNA，DNA或多肽。可以用于检测的探针的例子包括，但不限于核酸 和抗体。在一个实施方案中，基因产物是通过扩增该基因和检测扩增产物而检测的核 酸，其中复合物或扩增产物的存在与生物学样品中的hTRT基因产物的存在相关。在一个实施方案中，生物学样品是来自于患者，例如人类患者。在另一个实施 方案，生物学样品包括至少来自于体外细胞培养物例如人类细胞培养物的细胞。本发明进一步提供了检测包括人类细胞的生物学样品中至少一种永生或端粒酶 阳性人类细胞的存在的方法，包括获得包括人类细胞的生物学样品；和检测该样品中具有高水平的hTRT基因产物的细胞的存在，其中具有高水平的hTRT基因产物的细胞的存 在与生物学样品中一种永生或端粒酶阳性细胞的存在相关。本发明也提供了用于诊断端粒酶相关状况的方法，该方法包括从患者获得的细 胞或组织样品；测定细胞或组织中hTRT基因产物的量；和将细胞或组织中hTRT基因产 物的量与健康细胞或相同类型的组织的量进行比较，其中来自于患者和健康细胞或组织 的样品的hTRT基因产物的不同量可以诊断端粒酶相关的状况。在一个实施方案中，端 粒酶相关的状况是癌症和在该样品中检测到较大的hTRT基因产物的量。本发明进一步提供了诊断癌症患者的方法，该方法包括从患者获得生物学样 品；检测患者样品中hTRT基因产物，其中样品检测到的hTRT基因产物与癌症的诊断相 关。本发明进一步提供了诊断患癌症者的方法，该方法包括获得生物学样品；检测 患者样品中hTRT基因产物的量，和将hTRT基因产物的量与正常或对照值的量进行比 较，其中大于正常或对照值的患者的hTRT基因产物的量可以诊断为癌症。本发明也提供了诊断癌症患者的方法，该方法包括获得含有至少一个细胞的生 物学样品；测定样品中细胞的hTRT基因产物的量，和将细胞的hTRT基因产物的量与细 胞的正常值进行比较，其中大于正常值的hTRT基因产物的量可以诊断为癌症。在一个 实施方案中，据信该样品含有至少一个恶性细胞。本发明也提供了预测癌症患者的方法，包括测定从患者获得的癌症细胞中hTRT 基因产物的量，和将癌症细胞的hTRT基因产物的量与预测的与癌症的预测一致的hTRT 的值进行比较；其中作为预测值的样品的hTRT的量提供了特定的预测。本发明也提供了监测降低患者的癌症细胞的增殖能力的抗癌症治疗能力的方 法，该方法包括从患者的至少一个癌症细胞中第一次测量hTRT基因产物的量；从患者的 至少一个癌症细胞中第二次测量hTRT基因产物的量，其中在第二次测量之前该患者以抗 癌症治疗剂给药；和将第一次测量和第二次测量进行比较，其中第二次测量的较低水平 的hTRT基因产物与降低患者的癌症细胞的增殖能力的抗癌症治疗相关。本发明也提供了用于检测hTRT基因或基因产物的试剂盒。在一个实施方案中， 该试剂盒包括含有选自于hTRT核酸或其亚序列，hTRT多肽或其亚序列的分子，和抗 hTRT抗体的容器。本发明也提供了治疗人类疾病的方法。在一个实施方案中，本发明提供了用于 增加脊椎动物细胞的增殖能力的方法，该方法包括将重组多核苷酸导入到细胞，其中所 述的多核苷酸包括编码hTRT多肽的序列。在一个实施方案中，hTRT多肽具有显示于附 图17的序列。在一个实施方案中，该序列可操作连接到一个启动子上。在一个实施方 案中，该hTRT具有端粒酶的催化活性。在一个实施方案中，细胞是人类细胞，例如人 类患者的细胞。在另一种可选的实施方案中，将细胞进行体外培养。在相关的实施方案 中，将该细胞导入到人类患者。 本发明进一步提供了用于治疗人类疾病的方法，该方法包括将重组hTRT多核苷 酸导入到患者的至少一个细胞。在一个实施方案中，使用了基因治疗载体。在一个相关 的实施方案中，该方法进一步由将包括编码hTR序列的多核苷酸，例如可操作连接到启 动子的hTR多核苷酸导入到细胞组成。
本发明也提供了用于增加脊椎动物细胞的增殖能力的方法，所述方法包括将有效量的hTRT多肽导入到细胞。在一个实施方案中，hTRT多肽具有端粒酶 催化活性。本发明进一步提供了具有增加的增殖能力的细胞和细胞子代。

本发明也提供了用于治疗与细胞内增高水平的端粒酶活性相关的状况的方法， 包括将治疗有效量的所述端粒酶活性的抑制剂导入到细胞，其中所述的抑制剂是hTRT多 肽或hTRT多核苷酸。在一个实施方案中，抑制剂是多肽或多核苷酸，包括至少例如显示 于附图16，17或20的序列的亚序列。在其他实施方案中，多肽或多核苷酸抑制了 TRT 活性，例如将内源性TRT与端粒酶RNA结合。本发明也提供了包括hTRT多肽和佐剂的疫苗。本发明也提供了含有药物学可 接受载体和选自于hTRT多肽，编码hTRT多肽的多核苷酸，和hTRT核酸或其亚序列 的分子的药物组合物。附图简述附图1显示来自于人类，粟洒裂殖酵母(tezl)，啤酒酵母(EST2)和Euplotes aediculatus(pl23)的TRT基序中的高度保守的残基。用星号(*)(稍微上抬)表示相同的 氨基酸，而类似的氨基酸用点(·)表示。附图的基序“0”也被称之为基序T ；基序
“3”也被称之为基序A。附图2显示端粒酶特异性的和RT特异性的端粒酶蛋白质和其它逆转录酶的序列 基序的定位。盒子表示端粒酶特异性的基序T和保守的RT基序1，2和A-E的定位。 开口的长方形标记的HIV-IRT描述了显示于附图3的蛋白质的部分。附图3显示了 Hiv-I逆转录酶的p66亚单位的晶体结构CBrookhaven密码 1HNV)。该观点是根据右手的背部以便能够显示所有的基序。附图4显示了端粒酶RTs(Sp-Trtlp，粟洒裂殖酵母TRT (本文也称之为 “tezlp” ) ； hTRT,人类 TRT ； Ea_pl23，Euplotesp 123 ； Sc_Est2p，啤酒酵母 Est2p)和
其它RT家族成员(Sc-al，来自于啤酒酵母线粒体的细胞色素氧化酶组II内含子1-编码 的蛋白质，Dm-TART，来自于Drosophila melanogasterTART非-LTR可反相转座的元件 的逆转录酶；HIV-1，人类免疫缺陷病毒逆转录酶)的多个序列的排列。TRT con和RT con代表用于端粒酶RTs和非端粒酶RTs的共有序列。用h，疏水；p，极性；c，带电， 命名氨基酸。三角表示在端粒酶蛋白质之间保守的，但是在其它RTs中不同的残基。基 序E下面的实体线突出该引物控制区域。附图5显示了 hTRT RNA在如实施例2描述的端粒酶阴性的可灭细胞株和端粒酶 阳性的不灭细胞株中的表达。附图6显示了端粒酶的系统树和以RNA依赖性RNA聚合酶为根部的逆转录因子。附图7显示λ克隆GO5的限制性图谱。附图8显示具有标明了 STS标记物D5S678 (定位于hTRT基因附近)定位的染 色体5p的图谱。附图9显示hTRT启动子报道质粒的构建。附图10，在2页上，显示hTRT和hTR在体外共表达以产生具有催化活性的人
端粒酶。
附图11，在2页上，显示来自于4个TRT蛋白质的序列的比较和鉴别需要的基 序。TRTcon显示TRT共有序列。RTcon显示其它逆转录酶的共有残基。对于上面的情 况，表示共有残基在TRT蛋白质中绝对的保守。附图12显示hTRT内含子的拓扑异构酶II裂解位点和NFkB结合位点基序，并 且显示了对应于SEQUENCE ID NO 7的序列。附图13，在2页上，显示编码Euplotesl23千道尔顿端粒酶蛋白质亚单位 (EuplotesTRT)的 DNA 的序列。附图14显示Euplotesl23千道尔顿端粒酶蛋白质亚单位(EuplotespTRT蛋白质)
的氨基酸的序列。

附图15，在5页上，显示粟洒裂殖酵母端粒酶催化亚单位(粟洒裂殖酵母TRT) 的DNA和氨基酸序列。附图16，在2页上，显示hTRT c DNA的序列，并且显示了对应于SEQUENCE ID NO 1的序列。附图17显示由附图16的cDNA编码的hTRT蛋白质，所显示的蛋白质序列对应 于 SEQUENCE ID NO 2。附图18显示克隆712562的序列，并且显示了对应于SEQUENCE IDNO 3的序列。附图19显示由克隆712562的序列编码的259个残基蛋白质，所显示的序列对应 于 SEQUENCE ID NO 10。附图20，在7页上，显示具有编码Δ 182变异体多肽的开放读框的核酸序列，所 显示的序列对应于SEQUENCE ID NO 4。该附图也显示Δ 182变异体多肽的氨基酸序 列，所显示的氨基酸序列对应于SEQUENCE IDNO 5。附图21，在6页上，显示来自于hTRT基因组克隆的序列，所显示的序列对应于 SEQUENCE ID NO 6。指明了共有基序和元件，包括拓扑异构酶II裂解位点，NFkB结 合位点，和Alu序列和其它序列元件序列特性。附图22显示TRT基因的突变在酵母中的作用，如实施例1描述的。附图23 显示 EST AA281296 的序列，对应于 SEQUENCE ID NO 8。附图24显示缺失182碱基对的克隆712562的序列，所显示的序列对应于 SEQUENCE ID NO 9。附图25显示用于来自于BJ细胞的端粒酶活性的测试结果，所述的细胞用编码 hTRT蛋白质的表达载体(pGRN133)或对照质粒(pBBS212)转染，如实施例13描述的。附图26是显示结合和替代洗脱步骤的端粒酶的亲和纯化示意图。附图27是在如实施例1描述的纯化方案中获得的端粒酶制剂的Northern印迹的 照片。泳道1含有1.5ftnol的端粒酶RNA，泳道2含有4.6fmol的端粒酶RNA，泳道3含 有14fmol的端粒酶RNA，泳道4含有41fmol的端粒酶RNA，泳道5含有核提取物(42ftnol 的端粒酶)，泳道6含有Affi-Gel-肝素-纯化的端粒酶(47fmol的端粒酶)，泳道7含有 亲和纯化的端粒酶(68fmol)，和泳道8含有甘油梯度纯化的端粒酶(35ftnol)。附图28显示经过纯化方案后的端粒酶活性。附图29是SDS-PAGE凝胶的照片，显示来自于Euplotesaediculatus的约123千道尔顿多肽和约43千道尔顿成对物的存在。附图30显示Euplotes aediculatus端粒酶的沉淀系数的图。附图31是具有36%的甲酰胺的聚丙烯酰胺/脲凝胶的照片，显示Euplotes端粒 酶底物的应用。附图32显示假设的 端粒酶RNA模板，和具有端粒酶RNA的肝素引物的序列比较。附图33是显示于附图31的凝胶的泳道25-30的照片，以较亮的曝光水平显示。附图34显示编码来自于Euplotes的43千道尔顿端粒酶蛋白质亚单位的基因的 DNA序列。附图35在4页上，显示来自于Euplotes的43千道尔顿端粒酶蛋白质亚单位的所 有的开放读框的DNA序列，以及氨基酸序列。附图36显示来自于Euplotes的123千道尔顿端粒酶蛋白质亚单位(上面序列) 和T.thermophila的80千道尔顿多肽的亚单位(底下序列)的序列比较。附图37显示来自于Euplotes aediculatus的123千道尔顿端粒酶蛋白质亚单位(上 面序列)和T.thermophi Ia的端粒酶多肽的95千道尔顿(底下序列)的序列比较。附图38显示来自于Euplotes aediculatus的43千道尔顿端粒酶蛋白质亚单位的 "La-区域”的一部分(上面序列)和T.thermophila的95千道尔顿亚单位的一部分(底
下序列)的最适合的配合序列对比。附图39显示来自于Euplotes aediculatus的43千道尔顿端粒酶蛋白质亚单位的 "La-区域”的一部分(上面序列)和T.thermophila的80千道尔顿亚单位的一部分(底
下序列)的最适合的配合的序列对比。附图40显示来自于Euplotes aediculatus的123千道尔顿端粒酶蛋白质亚单位的 聚合酶区域和包括来自于啤酒酵母线粒体的细胞色素氧化酶组II内含子1编码的蛋白质 (alS.c.(组II))，Dong (LINE)，和酵母ESTp (L8543.12)的各种逆转录酶的聚合酶区域的
序列对比和基序。附图41显示具有各种La蛋白质的43千道尔顿端粒酶蛋白质亚单位的区域的序 列对比。附图42显示编码T.thermophila的80千道尔顿蛋白质亚单位的核苷酸序列。附图43显示T.thermophila的80千道尔顿蛋白质亚单位的氨基酸序列。附图44显示编码T.thermophila的95千道尔顿蛋白质亚单位的核苷酸序列。附图45显示T.thermophila的95千道尔顿蛋白质亚单位的氨基酸序列。附图铋显示L8543.l2( ‘‘EstZp”)的氨基酸序列。附图47显示由Oxytricha PCR产物编码的氨基酸序列与Euplotesp 123序列的的序
列对比。附图48显示Est2的DNA序列。附图49显示来自于编码人类端粒酶肽基序的CDNA克隆的部分氨基酸序列。附图50显示来自于编码人类端粒酶肽基序的CDNA克隆的部分DNA序列。附图51显示tezl，也称之为粟洒裂殖酵母trt的氨基酸序列。附图52，在2页上，显示tezl的DNA序列，内含子和其它非编码区域显示于底下框子和外显子(即编码区域)显示于上面框子。附图53显示EST2p，Euplotes和Tetrahymena序列，以及共有序列的序列对比。附图54显示用于生产抗hTRT抗体的肽的序列。附图55是tezl+测序实验的概括示意图。附图56显示用于PCR的两个简并引物以便鉴别Euplotesaediculatus pl23序列的
粟洒裂殖酵母同系物。附图57显示利用鉴别Euplotes aediculatus pl23序列的粟洒裂殖酵母同系物的两
个简并引物进行PCR产生四个主要的谱带。

附图58 显示 M2PCR 产物与 Euplotes aediculatus pl23,啤酒酵母，禾Π Oxytricha
端粒酶蛋白质序列对比。附图59是显示用于鉴别Euplotes aediculatus pl23序列的粟洒裂殖酵母同系物的 3’ RT PCR方案的示意图。附图60显示用于筛选粟洒裂殖酵母端粒酶蛋白质序列的文库的特性和显示筛选 粟洒裂殖酵母端粒酶蛋白质序列的文库的结果。附图61显示用HindIII消化含有粟洒裂殖酵母端粒酶序列的阳性基因组克隆获得 的阳性结果。附图62是用于获得全长粟洒裂殖酵母TRT克隆的5’ RT PCR方案的示意图。附图63显示来自于粟洒裂殖酵母(S.p.)，啤酒酵母(S.c.)和Euplotes aediculatus(E.a.)的端粒酶催化亚单位的RT区域的序列对比。附图64 显示来自于 Euplotes ( “Ea_pl23”)，啤酒酵母(“Sc-Est2p”)，禾口 粟洒裂殖酵母(“Sp-Tezlp”)的序列对比。在A组，有阴影部分的区域指示两个序列 之间共享的残基。在B组，有阴影部分的区域指示所有三个序列之间共享的残基。附图65显示端粒酶基因一起用于粟洒裂殖酵母破碎的方案。附图66显示证实tezl的破碎的实验结果。附图67显示由于tezl破碎的粟洒裂殖酵母的端粒的逐渐缩短。附图68，在4页上，显示编码由EcoRI-NotI插入的克隆712562编码的约63千 道尔顿的端粒酶蛋白质的ORF的DNA和氨基酸序列。附图69显示来自于各种来源的逆转录酶基序的序列对比。附图70提供了质粒pGRN121的限制性和功能图谱。附图71，在2页上，显示hTRT cDNA序列的初步核酸测序分析结果。附图72，在10页上，显示hTRT的初步核酸测序和推测的三个开放读框的ORF 序列。附图73提供了质粒pGRN121的限制性和功能图谱。附图74，在8页上，显示hTRT的提纯的核酸序列和推测hTRT的ORF序列。附图75显示λ克隆25-1.1的限制性图谱。发明详述导言端粒酶是包括RNA成分和催化蛋白质成分的核糖核蛋白质复合物(RNP)。本发 明涉及端粒酶催化蛋白质成分，下文称之为“TRT”(端粒酶逆转录酶)的克隆和定性。对TRT这样命名是因为该蛋白质具有RNA-依赖性DNA聚合酶(逆转录酶)的作用，它 利用该端粒酶RNA成分(下文称之为“TR”)以指导端粒DNA重复序列的合成。而 且，TRT在进化上与其它逆转录酶相关(参见实施例12).在一个方面，本发明涉及人类端粒酶催化蛋白质成分的克隆和定性，下文称之 为“hTRT”。人类TRT是特别有兴趣和价值，如上文说明的，人类(和其它哺乳动物 细胞)的端粒酶活性与细胞增殖能力，细胞不灭性，和瘤形成表现型相关。例如，与可 灭的细胞相比(例如大多数人类体细胞)，端粒酶活性和如在下文实施例2中证明的，人 类TRT基因产物的水平在不灭的人类细 胞中增高(例如恶性肿瘤细胞和不灭细胞系)。本发明进一步提供了可用于人类疾病和疾病状态的诊断，预测和治疗的方法和 组合物，如下文的详细描述。也提供了可用于使细胞不灭(体内和体外)，产生具有所需 的特性的转基因动物和许多其它用途的方法和试剂，许多在下文中描述。本发明也提供 了用于制备，克隆，或再克隆来自于纤毛虫，真菌，脊椎动物，例如哺乳动物和其它生 物体的TRT基因和蛋白质的方法和试剂。如在下文详细描述的，从纤毛虫Euplotes aediculatus纯化端粒酶之后首先对TRT
定性。利用RNA亲和层析和其它方法充分地纯化Euplotes aediculatus端粒酶产生蛋白质 “pl23”。令人惊奇地，pl23与以前认为构成端粒酶全酶(即T.thermophila的p80禾口 p95蛋白质)的蛋白质亚单位的蛋白质不相关。pl23DNA和蛋白质序列(GenBank入藏 号U95964 ；附图13和14)的分析显示与pl23的作用一致的逆转录酶(RT)的基序作为 端粒酶的催化亚单位(参见，例如附图1，4和11)。但是，pl23与啤酒酵母(酵母)蛋 白质，Est2p相关，已知它具有在啤酒酵母中维持端粒的作用(GenBank入藏号S5396)， 但是在本发明之前，它被认作为编码端粒酶催化的亚单位蛋白质(参见，例如Lendvay等 人，1996，遗传学，144 1399)。在一个方面，本发明提供了用于鉴别和克隆新的TRTs的方法和试剂，其中利 用从所公开(例如从克隆TRT基因和cDNAs)的TRT多核苷酸产生或衍生的核酸探针 和引物；特异性地识别基序或基序序列或其它TRT抗原决定基(例如表达克隆TRT基因 或纯化TRT蛋白质)的抗体；通过筛选计算计数据库；或其它手段。例如，如在实施例 1中描述的，用从Euplotes pi23RT基序B’和C设计的简并序列引物实施粟洒裂殖酵母的 DNA的PCR扩增(聚合酶链反应)。所产生的四个主要产物，一个编码与Euplotes pl23和 啤酒酵母Est2p同源的肽序列。利用该PCR产物作为探针，通过筛选粟洒裂殖酵母cDNA 和基因组文库和通过逆转录和PCR(RT-PCR)扩增粟酒裂殖酵母RNA获得粟洒裂殖酵母 TRT同系物的整个序列。粟洒裂殖酵母基因(“trtl” ； GenBank入藏号AF015783 ；附 图15)的整个序列显示与pl23和Est2p的同源性在逆转录酶基序中尤其高。粟洒裂殖酵 母trtl也称之为tezl。利用来源于端粒酶RT基序的简并引物的扩增也用于在Oxytrichatrifalhx和 T.thermophila中获得TRT基因序列，如实施例1描述的。本发明的Euplotes pl23，粟洒裂殖酵母trtl和啤酒酵母Est2p核酸的序列用于 利用程序BLAST (Altschul等人，1990，分子生物学杂志，215 403)在人类表达的序 列标签(ESTs)的计算计化数据库中检索。用Est2p序列检索数据库没有显示匹配， 但是用pl23和trtl序列进行检索识别假设编码同源蛋白质的人类EST (GenBank入藏号AA281296 ；参见SEQUENCE ID NO 8)，如在实施例1中描述的。含有EST(下文 称之为“克隆712562”，参见SEQUENCE ID NO 3)的cDNA克隆的整个测序显示存 在7个RT基序。但是，该克隆不编码具有所有7个基序的邻接的人类TRT。因为基 序B’，C，D和E包含于与多个NH2末端基序不同的开放读框(ORF)。另外，基序 A和B’之间的距离基本上短于三个前面定性的TRTs之间的距离。克隆712562是从 I.M.A.G.E.Consortium ； Lennon 等人，1996，基因组 33 151 获得。 从如实施例1描述的来源于人293细胞系的cDNA文库分离的编码功能hTRT (参 见附图 16，SEQUENCE ID NO 1)的 cDNA 克隆，pGRN121。将克隆 712562 和 PGRN121比较显示克隆712562在基序A和B，之间具有182碱基对的缺失(参见附图 24，SEQUENCE ID NO 9)。存在于pGRN121的另外的182个碱基对在单个开放读框 放置所有的TRT基序，并且将基序A和B’区域之间的间隔增加到与其它已知的TRTs 一致的距离。如在下文实施例(例如实施例7)中描述的，SEQUENCE ID NO 1编码纯 化活性的端粒酶蛋白质，该蛋白质具有SEQUENCE ID NO 2的序列。SEQUENCE ID NO 2多肽具有1132个残基和约127千道尔顿(kD)的计算的分子量。如在下文讨论的，和在下文实施例9中描述的，在从端粒酶阳性细胞(例如， testis和293细胞)的RNA逆转录后检测到具有克隆712562的182个碱基缺失特性的TRT cDNAs。失去该182碱基对序列的hTRT RNAs通常称之为“ Δ 182变异体”和可以代 表一个，两个或几个种类。虽然失去存在于pGRN121 cDNA的182碱基对序列的hTRT RNAs变异体不可能编码完全有活性的端粒酶催化酶，但是它们在端粒酶调节起作用，如 下文讨论的，和/或具有部分端粒酶活性，例如端粒结合或hTRT结合活性，如在下文讨 论的。因此，在一个方面，本发明提供了具有天然存在的人类TRT基因或mRNA的序 列的分离的多核苷酸，包括但不限于具有附图16 (SEQ VENCE IDNO : 1)列出的序列的 多核苷酸。在相关的方面，本发明提供了编码hTRT蛋白质，片段，变异体或衍生物的 多核苷酸。在另一个相关的方面，本发明提供了结合到hTRT基因或mRNA的有意义和 反义核酸。本发明进一步提供了合成的或从天然来源的纯化的hTRT蛋白质，以及特异 性地与hTRT蛋白质或其片段结合的抗体和其它试剂。本发明也提供了许多新的方法， 包括例如通过提供用于人类疾病的诊断和预测的测试，使用前面提到的组合物的方法， 用于研制治疗剂和治疗方法，鉴别端粒酶结合的蛋白质的方法，用于筛选能够激活或抑 制端粒酶活性的试剂的方法。下文提供了本发明的许多其它的方面和实施方案。本发明的一个方面是使用至少10个核苷酸到约10千碱基对或更多的长度的多核 苷酸并且包括与天然存在的hTRT基因或hTRT mRNA的邻接序列相同或正确互补的至少 10个核苷酸邻接序列，以便用于测试或筛选hTRT基因序列或hTRT mRNA，或制备重组 宿主细胞。本发明的另一个方面是增加hTRT在制备用于治疗疾病状态的药物中的表达的药 剂的应用，非强制性地该药物用于抑制老化作用，所述的状态是由于增加脊椎动物细胞 的增殖能力引起的。本发明的另一个方面是端粒酶活性抑制剂在制备用于治疗与人类细胞内的端粒 酶活性的增高的水平相关的状态的药物中的应用。
本发明的再一方面也是提供了用作为药物的本发明的蛋白质，变异体和片段， 和编码多核苷酸或片段。本发 明进一步包括在本文定义的各种情况下蛋白质，变异体或片段，或编码其 的多核苷酸或片段在制备例如用于制备用于抑制老化作用或癌症的药物中的应用。本发明的另一个方面是选自于下列组的多核苷酸(a)具有附图16列出的序列的DNA ；(b)与前面所述的DNA杂交的并且编码hTRT蛋白质或变异体或与编码这样的变 异体的编码序列杂交的至少10个核苷酸的多核苷酸；和(c)与(a)和(b)定义的DNA序列有遗传密码简并的和编码hTRT多肽或变异体 的DNA序列。在本发明的一些实施方案中，hTRT多核苷酸是不同于SEQUENCE IDNI: 8的 389个核苷酸的多核苷酸和/或不同于克隆712562，含有插入物的质粒，插入物的序列显 示于附图 18 (SEQUENCE ID NO 3)。以主题划分来进行下面的描述。II部分进一步描述了 TRT蛋白质的氨基酸基序 特性，以及编码具有这样的基序的蛋白质的TRT基因。III-VI部分特别描述了本发明的 核酸，蛋白质，抗体和纯化的组合物，特别关注的是人类TRT相关的组合物。VII部分 特别描述了用于治疗人类疾病的本发明的方法和组合物。XIII部分描述了不灭的人细胞 系的生产和鉴定。IX部分特别描述了本发明的核酸，多核苷酸，和其它组合物用于诊断 人类疾病。X部分特别描述了用于筛选和鉴别调节(例如抑制或促进)端粒酶活性或表 达的药剂和治疗剂的本发明的方法和组合物。XI部分特别描述了转基因动物(例如端粒 酶敲出口动物和细胞)。XII部分是用于部分I-XI的术语的汇编。部分XIII描述了涉及 本发明的特定的实施方案的实施例。采用主题和亚主题方式对本发明进行描述更清晰， 和不以任何方式限制。II.TRT基因和蛋白质本发明提供了分离的和/或重组基因和具有端粒酶催化亚单位蛋白质(即端粒酶 逆转录酶)的蛋白质，包括但不限于这样的基因的天然存在形式和分离的或重组形式的 蛋白质。通常，TRTs是大的，碱性的，具有逆转录酶(RT)和端粒酶特异性(T)氨基酸 基序的蛋白质，如本文公开的。由于不同种类的生物体中这些基序是保守的，因此利用 本发明的方法可以获得许多生物体的TRT基因或利用例如特异于一个或多个基序序列的 本发明的引物，核酸探针，和抗体可以鉴别。当与存在于其它逆转录酶中的相似时，存在于TRTs中的7个RT基序具有特定 的标志。例如如附图4显示的，在TRT RT基序内，在其它RTs中许多氨基酸替代的残 基是高度保守的。例如在基序C中，与其它RTs的(F/Y)xDDh(当“h’是疏水氨基 酸和” χ “是任何氨基酸时；参见Xiong等人，1990，EMBO J 9 3353 ； Eickbush, 病毒演变生物学，(S.Morse，Ed.Raven出版社，纽约，第121页，1994))相比，端粒酶 RTs含有的hxDD(F/Y)出现了协调活性位点金属离子(参见，Kohlstaedt等人，1992， 科学 256: 1783 ； Jacobo-Molina 等人，1993，美国科学院年报，90: 6320 ； Patel 等人， 1995，生物化学34 5351)的两个天冬氨酸(DD)。在基序E中出现了另一个端粒酶亚 单位的系统性的改变特性，其中WxGxSx是保守序列或在端粒酶蛋白质之间是高度保守的，而hLGxxh的特性是其它的RTx(Xiong等人，见上文，Eickbush，见上文)。该基序 E被称之为“引物柄”，和已经报道了该区域的突变以实现RNA的启动但不是DNA的启 动(Powell等人，1997，生物化学杂志，272: 13262)。因为端粒酶需要DNA引物(例 如染色体3’末端)，但是端粒酶不同于引物柄区域的其它RTs不是令人满意的。例如， 在TRTs中基序A和B’之间的距离长于典型的其它RTs，这可以代表类似于右手的该结 构的“手指”区域内的插入(附图3;参见Kohlstaedt等人，见上文，Jacobo-Molina等 人，见上文；Patel等人，见上文)。而且，如上文所述，基序T是TRT蛋白质的另外的标志。如在附图4(W-L_X-Y-X-X-h-h-X-h-h-X-p-F-F-T-E-X-p-X-X-X-p-X-X-X-Y-X-R-K-X-X-W (X 是任何
氨基酸，h是疏水，ρ是极性))显示的该基序T包括利用通式Trp-RfX7-R1-R1-R2-X_Phe-Phe-Tyr-X-Thr-Glu-X8_9-R3-R3-Arg-R4- X2-Trp 描 述的序列，其中X是任何氨基酸和下标是指连续的残基数，Rl是亮氨酸或异亮氨酸，R2是 谷氨酸或精氨酸，R3是苯丙氨酸或酪氨酸，R4是赖氨酸或组氨酸。利用通式Trp-R1-Xq-h-h-X-h-h-R2-p-Phe-Phe-Tyr-X-Thr-Glu-X-p-X3-p-X2_3-R3-R3_Arg-R4-X2-Trp 也可 以描述T基序，其中X是任何氨基酸，下标是指连续的残基数目，R1是亮氨酸或异亮氨酸， R2是谷氨酸或精氨酸，R3是苯丙氨酸或酪氨酸，R4是赖氨酸或组氨酸，h是选自于丙 氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，色氨酸和甲硫氨酸的疏水氨基 酸，ρ是选自于甘氨酸，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸，天冬酰胺和谷氨酰胺的极 性氨基酸。在一个实施方案中，本发明提供了分离的天然存在的和重组的TRT蛋白质，它 包括一个或多个描述于附图11的基序，例如基序TW-X12-FFY-X-TE-Xichu-R-X3-W-X7-I基序T，E-X2-V-X基序1 X3-R-X2-PK-X3基序2 X-R-X-I-X基序A X4-F-X3-D-X4-YD-X2基序B，Y-X4-G-X2-QG-X3-S-X8基序C X6-DD-X-L-X3当显示的TRT蛋白质含有一个以上的TRT基序时，按照(NH2 > COOH)的顺
序显示于附图11。在一个实施方案中，本发明提供了分离的天然存在的TRT蛋白质，它包括超基 序 (NH2) -Xso^oo-W-Xu-FFY-X-TE-X.n-R-XfW-Xfl-XHo-E-X^V-X-XHo-X 3_R_X2_PK-X4-io_R_X_I_X_X60-80 _X4_F_X3_D_X4_YD_X2_X80-130_Y_X4_G-X2_QG-X3_S-X8_X5-35_X6_DD_X_L-X3-Xio-20_Xl2_K 对本领域内技术人员来说是显而易见的，利用本文提供的试剂包括本文公开的 那些试剂的TRT序列和本文提供的方法和指导(包括下文描述的特异性方法)，本领域内技术人员可以获得，分离和产生重组形式的TRT基因和蛋白质。例如，提供了与编码 TRT的RT和T基序特性的基因序列杂交的引物(例如简并的扩增引物)。例如基于靶生 物体的密码子的使用，可以制备与编码T基序，其它TRT基序(如下文讨论的)或基序 的组合的FFYXTE区域的序列或共有序列杂交的一个或多个引物或简并引物和用于扩增 来自于从靶生物体制备的基因组DNA或cDNA的TRT基因序列。简并引物的使用是本 领域内技术人员熟知的并且必须使用引物组，该引物组与潜在地编码靶基序的氨基酸的 核酸序列组杂交，其中考虑密码子优先和靶生物体的使用，和通过利用适合于在PCR退 火步骤允许碱基错配的扩增(例如PCR)条件。通常，使用两个引物组；但是单个引物 (或在这种情况下，单个简并引物组)扩增系统是本领域内技术人员熟知并且可用于获得 TRT基因。表1提供了本发明引物的示意图，所述引物可用于扩增新的TRT核酸，特别是 来自于脊椎动物的那些(例如人类和其它哺乳动物)。“N”是所有4种核苷酸的等摩尔 混合物，和括号内的核苷酸是特定的核苷酸的等摩尔混合物。表1 TRT核酸扩增的简并引物的描述基序方向 5'-序列-3’a FFYVTE 正向 TT (CT) TT (CT) TA (CT) GTNACNGA
b FFYVTE 反向 TCNGTNAC (GA) TA (GA) AA (GA) AAc RFIPKP 正向(CA) GNTT (CT) AT (ACT) CCNAA (AG) CCd RFIPKP 反向 GG (TC) TTNGG (TGA) AT (GA) AANCe AYDTI 正向 GCNTA (CT) GA (CT) ACNATf AYDTI 反向 TANGT (GA) TC (GA) TANGCg GIPOG 正向 GGNAT (ACT) CCNCA (AG) GGh GIPOGS 反向(GC) (AT) NCC (TC) TGNGG (TGA) ATNCCi LVDDFL 正向(CT) TNGTNGA (CT) GA(CT) TT (CT) (CT) Ti DDFLLVT 反向 GTNACNA (GA) NA (GA) (GA)AA(GA)TC(GA)TC优先的引物结合(y = yes，η = no)反向正向b d f h ia- η y y y yc~ η η y y ye- η η η y yg- η η η η yi- η η η η η在一个实施方案中，将扩增的TRT核酸用作为用于与从靶生物体制备的文库 (例如cDNA文库)进行菌落杂交的杂交探针，这样具有整个TRT蛋白质编码序列的核 酸，或其基本序列部分是相同的和被分离或克隆。根据本文描述的方法将例如刚才描述 的试剂和方法用于获得Oxytrichatrifallax和T.thermophila的TRT基因序列，如在下文详细 描述的。将会认识到以前未鉴定的TRT基因进行克隆后，通过常规方法测定该序列，合成编码的多肽和测试其TRT活性，例如端粒酶催化活性(如本文描述和/或通过本领域 内技术人员熟知的端粒酶测试)。利用许多的本发明克隆方法的任何一种可以克隆TRT基因对本领域内技术人员 来说是显而易见的，因为本发明的TRT基序序列和包括这样的序列的核酸可用于各种各 样的所述的方法。例如可以使用利用基于已知的TRT序列的探针与来自于靶生物体的 DNA或其它核酸文库进行杂交，如在实施例1中描述的。将会认识到可以将简并PCR 引物或其扩增产物例如上文描述的那些标记并且用作为杂交探针。在另一个实施方案 中，使用表达克隆方法。例如，将特异性地与跨越TRT基序或其它TRT抗原决定基例 如FFYXTE基序的肽结合的一个或多个抗体用于分离包括TRT蛋白质和编码它的mRNA 的核糖体复合体。为了产生本发明的这样的抗体，通常肽免疫原是6到30个氨基酸之间 的长度，更常见的是约10到20个氨基酸之间的长度。也可以将抗体用于探测来源于所 需的生物体的cDNA表达文库以鉴别编码TRT序列的克隆。在另一个实施方案中，也可 以使用计算计检索DNA数据库以寻找含有与已知的TRT保守的序列的DNA以鉴别包括 TRT序列的克隆。在一个方面，本发明提供了包括具有天然存在的TRT蛋白质的氨基酸序列的 分离的或重组的多肽的组合物。通常，天然存在的TRT具有约80,000道尔顿(D)和约 150,000D之间的，最常见的是约95,000D和130,000D之间的分子量。通常，天然存在的 TRT在pH 7.0时(通常计算的pi大于9)具有静正电荷。在一个实施方案中，多肽显示 如本文定义的端粒酶活性。在相关的实施方案，多肽具有TRT特异性区域(T区域)序 列并且显示端粒酶活性。本发明进一步提供了这样的多肽的片段。本发明也提供了具有 编码TRT蛋白质天然存在的基因的序列的分离的或重组的多聚核苷酸。本发明提供了用 于从非脊椎动物(例如酵母)和脊椎动物，例如哺乳动物(例如鼠或人)分离TRT序列的 试剂。分离的多聚核苷酸可以与其它天然存在的或重组的或合成的载体核酸序列结合。 通常，分离的核酸小于约300千碱基对，通常小于约50千碱基对，更常见的是小于约20 千碱基对，最常见的是小于约10千碱基对并且有时小于约5千碱基对或2个千碱基对的 长度。在某些实施方案中，分离的TRT多聚核苷酸甚至更小，例如小于约1千碱基对或 小于0.1千碱基对的基因片段，引物或探针。 III.核酸A)综述本发明提供了具有编码端粒酶催化亚单位蛋白质(TRT)的多聚核苷酸的分离 的和重组核酸，例如来源于Euplotes，Tetrahymena,粟酒裂殖酵母或人的重组TRT基 因。在附图13 (Euplotes)；附图15 (粟酒裂殖酵母)和附图16 (人，GenBank入藏号 AF015950)中提供了例举的多聚核苷酸。本发明提供了具有TRT基因序列，包括探针， 引物，编码TRT蛋白多聚核苷酸的质等等的有义和反义多聚核苷酸。B)人 TRT本发明提供了具有来源于人的端粒酶催化亚单位的序列的(即hTRT)核酸。在一个方面，本发明提供了具有人TRT基因或RNA的序列或亚序列的多聚核苷 酸。在一个实施方案中，本发明的多聚核苷酸具有显示于附图16的SEQUENCE IDNO :
1的序列或其亚序列。在另一个实施方案中，多聚核苷酸具有SEQUENCEIDNO: 3(附图18)，SEQUENCE ID NO 4 (附图20)的序列，或其亚序列。本发明也提供了具有基本 上等同于本文公开的hTRT核酸序列的多聚核苷酸，包括但不限于SEQUENCE ID NO 1(附图16)，4 (附图20)，6 (附图21)和7。因此，本发明提供了天然存在的人TRT基 因的等位基因和相对于本文公开的hTRT核酸序列具有一个或多个核苷酸缺失，插入或替 代的各种多聚核苷酸序列。如下文所述，利用下文描述的重组或合成方法或采用其它手 段可以产生变异的核酸。本发明也提供了具有人TRT基因的侧接区域的序列的分离的和重组的多聚核苷 酸。这 样的多聚核苷酸包括来源于hTRTmRNA的未转译的区域的基因组序列。例举的基 因组序列显示于附图21 (SEQUENCE ID NO 6)。如实施例4所述，SEQUENCE ID NO
6是通过将从人基因组文库分离的克隆λ φ5测序获得的。XGtp5含有包括约13000碱 基5’到hTRT编码序列的15千碱基对(kbp)插入物。该克隆含有hTRT启动子序列和 其它hTRT基因调节序列(例如加强子)。本发明也提供了具有来源于人TRT基因的内含子区域的序列的分离的和重组多 聚核苷酸。例举的内含子序列显示于附图21 (SEQUENCE ID NO 7 ；参见实施例3)。 在某些实施方案中，hTRT内含子包含于“微基因”以改善hTRT蛋白质在真核细胞中的 表达。在相关的方面，本发明提供了编码hTRT蛋白质或蛋白质片段，包括修饰的，改 变的和变异的hTRT多肽的多聚核苷酸。在一个实施方案中，编码的hTRT蛋白质或片段 具有如附图17提出的氨基酸序列(SEQUENCE ID NO 2)或具有保守替代的SEQUENCE ID NO: 2的序列。在一个实施方案中，编码的hTRT蛋白质或片段具有改变蛋白质的活 性(例如端粒酶催化活性)的替代。将会认识到，由于遗传密码的简并，编码hTRT蛋白质的核酸不需要具有天然存 在的hTRT基因的序列，但是，多个多聚核苷酸可以编码具有SEQUENCE ID NO: 2的氨 基酸序列的hTRT多肽。本发明提供了通过基于利用已知的三联体遗传密码制备的可能 的密码子选择性选择结合制备的各种和每一种核苷酸序列的变异，所有这样的变异是本 发明特异性的。因此，虽然在某些情况下能够与天然存在序列的核苷酸序列杂交(在合 适的选定的严格条件下)的编码hTRT多肽的核苷酸序列是优选的，但是在其它情况下产 生编码hTRT核苷酸序列是优选的，这些核苷酸使用基本上不同的密码子选择并且可能不 与具有天然存在序列的核酸杂交。在特定的实施方案中，本发明提供了 hTRT寡聚-和多聚核苷酸，它包括本文公 开hTRT核酸的亚序列(例如SEQUENCE IDNO 1和6)。本发明的核酸通常包括例举 的hTRT多聚核苷酸的至少10个，更常见的是至少约12个以上或约15的连续的碱基。 常见的是，例如当计划表达多肽或全长的hTRT蛋白质，本发明的核酸将会包括较长的序 列，例如至少约25个，约50个，约100，约200，或至少约500-3000碱基的长度。仍然在另一个实施方案中，本发明提供了具有等同于或互补于天然存在或非天 然存在hTRT多聚核苷酸例如SEQUENCE ID NO 3或SEQUENCEID NO 4的序列的
“Δ 182hTRT"多聚核苷酸，它不含有存在于pGRN121(和在克隆712562中没有)的182 个核苷酸序列(SEQUENCEIDNO: 9(附图24))。这些多聚核苷酸不是需要的，部分是 因为它们编码含有不同于在“全长” hTRT多肽(SEQUENCE ID NO: 2)例如由pGRN121编码的TRT基序的结合或排列的多肽。如在下文讨论的，涉及这些多肽在自然界中起着 生物学作用(例如，在调节细胞的端粒酶的表达中)和/或用作为治疗剂(例如作为抑制 野生型蛋白质的功能的显性阴性的产物)，或具有其它作用和用途，例如如本文描述的。例如，与由pGRN121编码的多肽相反，克隆712562编码具有计算的分子量 约为30千道尔顿的259残基的蛋白质(下文的“712562hTRT”)。712562hTRT多肽 (SEQUENCE ID NO 10 (附图19))含有基序T，1，2禾Π Α，但不含有基序B，，C，D 和E(参见附图4)。类似地，可以从类似于pGRN121cDNA的核酸表达具有治疗和其它 活性的变异的hTRT多肽，但是失去了在克隆712562中错配的182碱基对，例如具有显 示于附图20的序列(SEQUENCE ID NO 4)。该核酸(下文的“原90hTRT”)，可以 通过常规的合成或重组方法合成，如下文所述的，该核酸编码807残基的蛋白质(计算的 分子量为约90千道尔顿)，它与由SEQUENCE ID NO 1编码的hTRT蛋白质共享有类 似的氨基末端序列，但是在羧基末端区域不同(开始的763个残基是共同的，原90hTRT 的最后的44个残基不同于“全长” hTRT)。原90hTRT多肽含有基序T，1，2，和A， 但不含有基序B，C，D, E，并且所以它们具有一些，但不是全部端粒酶活性。C)人TRT核酸的生产本发明的多聚核苷酸具有许多用途，包括但不限于编码hTRT或其片段的多肽的 表达，用作为有义或反义探针或引物用于天然存在的hTRT基因或RNA(例如诊断或预防 应用)杂交和/或扩增，用作为治疗剂(例如在反义，三联体，或核酶组合物中)。如 基于公开公开的观点，这些用途将对与老化，癌症和可育性相关的人疾病的诊断和治疗 以及基于细胞的产物的生长，再生产和制备具有巨大的影响是显而易见的。如在 下面的 章节中描述的，利用本领域内技术人员已知的技术可以制备本发明的hTRT核酸(例如克 隆，合成或扩增)。1)克隆，扩增和重组生产在一个实施方案中，利用与hTRTmRNA，cDNA或基因组DNA特异性杂交的核
酸探针将hTRT基因或cDNA克隆。适用于该目的的探针是具有附图16 (SEQUENCE ID NO 1)提供的整个序列或其一部分的多聚核苷酸，例如包括其亚序列的探针。通常， 将靶hTRT基因组DNA或cDNA连接到载体(例如质粒，噬菌体，病毒，酵母人工染色 体等等)并且可以从基因组DNA或cDNA文库分离(例如人胎盘cDNA文库)。一旦 鉴别了 hTRT核酸，根据本领域内技术人员已知的标准方法可以分离。实施例1中提供 了筛选hTRT基因的人cDNA文库的说明性实施例；类似地，在实施例3和4中发现了 筛选人基因组文库的例子。克隆方法是本领域内技术人员已知的并且在例如Sambrook 等人，(1989)分子克隆实验室手册，第2版，第1-3卷，冷泉港实验室，下文称之 为“Sambrook” ； Berger和Kimmel，(1987)酶学方法，第152卷分子克隆技术的指 导，SanDieg0:学术出版社，Ausubel等人，分子生物学的现行的方案，绿色出版社和 Wiley-Interscience，纽约(1997) ； Cashion 等人，美国专利 No.5017478 和 Carr，欧洲专利 No.0246864 中描述。本发明也提供了通过扩增方法，例如聚合酶链反应(PCR)分离了 hTRT基因 组或cDNA核酸。在一个实施方案中，利用引物5’ -GTGAAGGCACTGTTCAGCG -3，( “TCP 1.1”)禾口 5，-CGCGTGGGTGAGGTGAGGTG-3，( “TCP 1.15” )从RNA或cDNA样品扩增hTRT蛋白质的编码序列(例如双链胎盘cDNA(Clontech，Palo AltoCA))。在某些实施方案中，使用了第三或第二引物对例如对于“嵌套式PCR”以 增加特异性。第二引物对的实施例是5，-CTGTGCTGGGCCTGGACGATA -3’ ( "bil 1TCP6，，)和 5，-AGCTTGTTCTCCATGTCGCCGTAG-3，( “TCP1.14”)。对本领域
内技术人员将是显而易见的是本发明提供了可用于扩增hTRT核酸的许多其它引物和引物 的结合。而且，本发明提供了用于扩增hTRT基因组DNA，cDNA或RNA的任何特定
的区域(例如编码区，启动子区域，和/或内含子)或亚序列的引物。例如，利用引物 TCP1.57和 TCP1.52(引物对1)或引物TCP1.49和 TCP1.50 (引物对2)可以扩增(例如用 于检测基因组克隆)SEQUENCE ID NO 1的274/275位置的hTRT的内含子(参见实施例 3)。(引物名称是指列于下文表2的引物)。可以单个地使用引物对或当首先使用第一 组引物时进行嵌套式PCR。另一个举例的实施例涉及特异性地扩增的引物并且可以检测 hTRTmRNA的5’末端或编码hTRT基因的5’末端的外显子(例如用于估测cDNA克隆 的大小或完整性)。下面的引物对可用于扩增hTRT的5’末端引物K320和K321(引 物对3)；引物Κ320和TCP1.61(引物对4)；引物Κ320和Κ322 (引物对5)。可将引物 组按照第5组引物，然后第4组或第3组，或第4组或第5组，然后第3组的顺序用于嵌 套式PCR。也在另一个说明性的实施例中涉及选择以扩增或特异性地检测保守的hTRT TRT基序区域的引物，该区域包括约mRNA的中间的三分之一(例如，用作为杂交探针 以便从例如非人生物体鉴别TRT克隆)。下面的引物对可用于扩增hTRT核酸的TRT基 序区域引物K304和TCP1.8(引物对6)，或引物LTl和TCP1.15 (引物对7)。按照组 6，然后组7的引物可将顺序组可用于嵌套式PCR实验。合适的PCR扩增条件是本领域内技术人员已知的并且包括(但不限于)1单位 的 Taq 聚合酶(Perkin Elmer, Norwalk CT)，各 100 微摩尔浓度的 dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), IXPCR缓冲液(50毫摩尔浓度氯化钾，10毫摩尔浓度Tris，phH8.3,
在室温下，1.5毫摩尔浓度氯化镁，0.01%明胶)和0.5微摩尔浓度引物，包括在94°C，45 秒；在55°C 45秒；在72°C 90秒的过程进行30个扩增循环。本领域内技术人员将会认 识到其它热稳定的DNA聚合酶，反应条件，和循环参数也将提供合适的扩增。用于获得 hTRT合适的其它合适的体外扩增方法包括但不限于下文描述的那些。一旦扩增，如果需 要，利用常规的分子生物学方法可以将hTRT核酸克隆到各种各样的载体或根据本发明的 方法进行检测或其它利用。本领域内技术人员将会认识到利用其它方法可以制备或繁殖如上所述获得的克 隆的或扩增的hTRT核酸，例如化学合成或通过转化到细菌系统，例如大肠杆菌(参见例 如Ausubel等人，参见上文)，或真核，例如哺乳动物表达系统复制。类似地，利用例如 含有由RNA聚合酶例如T7，T3或SP6识别的启动子的商品载体，采用体外方法，或细 菌系统例如大肠杆菌可以表达hTRT RNA,或转译利用含有RNA聚合酶启动子的引物通 过PCR扩增产生的DNA。本发明进一步提供了改变的或修饰的hTRT核酸。本领域内技术人员将会认识 到采用本领域内技术人员已知的方法(例如位点特异性诱变)可以修饰(例如，截短的， 衍生的，改变的)所获得的克隆的或扩增的hTRT核酸或如下所述简单地从头开始合成。改变的或修饰的hTRT核酸可用于各种各样的应用，包括但不限于有助于hTRT基因或基 因产物的克隆或操作，或表达变异的hTRT基因产物。例如在一个实施方案中，将hTRT 基因序列改变以致于它编码具有改变的特性或活性的hTRT多肽，如在下文详细讨论的， 例如通过在保守的hTRT基序进行突变获得的特性。在另一个说明性实施例中，可以在 hTRT核酸的蛋白质编码区域导入诱变以改变糖基化模式，以改变密码子优先，以产生拼 接变异体，去除蛋白酶敏感性位点，制备抗原区域，修饰特异性活性等等。在其它实施 方案中，将编码hTRT的核苷酸序列和其衍生物进行改变，没有改变所编码的氨基酸序 列，例如具有更令人满意的特性的RNA转录物的产生，例如与从天然存在的序列产生的 转录物相比，具有增加的转译效力或较大或较短的半寿期。也在另一个实施方案，根据 由宿主利用的特定密码子的频率，选择改变的密码子，以增加在特定的原核表达宿主或 真核表达宿主出现的肽的表达速率。可用于制备本发 明的变异的hTRT多聚核苷酸的用 于体外和体内重组技术存在于Sambrook等人，和Ausubel等人，参见上文。
如上文所解释的，本发明提供了具有hTRT基因的侧接(5’或3’)和内含子序 列的核酸。由于它们含有参与hTRT调节和用于表达hTRT和其它重组蛋白质或RNA基 因产物的启动子和其它调节元件。除了 SEQUENCEID NO 6和7提供的核酸序列，利 用常规的分子生物学技术易于获得另外的hTRT内含子和侧接序列是显而易见的。例如， 可以从AG0 5(ATCC 209024)，如上文和实施例4描述的获得其它的hTRT基因组序列。 通过利用具有SEQUENCEID NO 1的序列或亚序列的hTRT核酸探针筛选人基因组文库 可以获得仍然其它的hTRT基因组克隆和序列。通过利用来源于λΟΦ5的标记的序列 或亚克隆以探测合适的文库可以获得其它的克隆和序列(例如更进一步的上游)。用于 hTRT侧接序列的进一步的定性的其它有用的方法包括由Gobinda等人，1993，PCR方法 应用 2 318 ； Triglia 等人，I988，核酸研究 I6 8186 ； Iagerstrom 等人，1"1，PCR 方 法应用1 111，和Parker等人，1991，核酸研究19 3055描述的常规方法。
通过常规手段例如将hTRT基因组序列与hTRT cDNA序列(参见例如实施例3) 进行比较，通过Sl分析(参见Ausubel等人，见上文，第4章)，或各种其它本领域内 技术人员已知的手段可以鉴别内含子序列。内含子序列也存在于前_mRNA(即未拼接的 或不完全拼接的mRNA前体)，前-mRNA可以在细胞RNA逆转录之后，进行克隆或扩
+飽
+曰ο当需要时，利用本领域内技术人员已知的DNA测序方法可以测定或验证克隆 的，扩增的或其它的合成的hTRT或其它的TRT核酸序列(参见，例如Ausubel等人，见 上文)。有用的测序方法使用了例如DNA聚合酶I的Klen0w片段，测序酶(美国生物化 学公司，Cleveland OH)，TaqDNA 聚合酶(Perkin Elmer, Norwalk CT)，热稳定 T7 聚合 酶(Amersham，ChicagoIL)，或重组聚合酶与校对核酸外切酶的结合例如由Gibco BRL销 售的EL0NGASE扩增系统(Gaithersburg MD)这样的酶。当测序或验证寡聚核苷酸的序 列时(例如通过化学合成方法从头开始合成的寡聚核苷酸)，Maxam和Gilbert的方法是优 选的(Maxam和Gilbert，1980，酶学方法65 499 ； Ausubel等人，见上文，第7章)。通过利用标准方法例如mRNA的逆转录将“全长” hTRT或其它cDNA克隆， 随后通过将获得的cDNA克隆和测序直接测定hTRT或其它TRTmRNA的5’未转译序 列。优选地用于筛选或扩增全长cDNA的寡聚(dT)引物引导的文库是优选的，其中全长cDNA已经进行了大小筛选以包含了较大的cDNA。随机引物引导的文库也是合适的 并且经常包括含有基因的5’区域的克隆的较大部分。也可以使用获得5’ RNA序列的 其它已知的方法例如由Frohman等人，1988，美国科学院年报85 8998描述的RACE方 案。如果需要，通过利用本文提供的核酸(例如具有SEQUENCE ID NO 1的序列)， 采用常规方法可以测定hTRT或其它TRTmRNA的转译起始位点。一种方法是利用具有 SEQUENCE IDNO 1的5，区域的序列标记的DNA进行的Sl核酸外切酶分析(Ausubel 等人，见上文)。2)核酸的化学合成本发明也提供了采用直接的化学合成方法生产的hTRT多聚核苷酸(RNA，DNA 或修饰的)。通常化学合成方法优选地用于生产寡聚核苷酸或用于生产寡聚核苷酸和含有 非链的核苷酸的多聚核苷酸(例如探针，引物和反义寡聚核苷酸)。采用本领域内技术 人员已知的方法可以完成核酸的直接化学合成，例如Nanmg等人，1979，酶学方法68 : 90的磷酸三酯方法，Brown等人，敏学方法68 109(1979)的磷酸二酯方法，Beaucage 等人的亚磷酰胺二酯方法，四面体通信22: 1859(1981)；美国专利4458066的固相支撑 的合成方法。通常化学合成产生单链寡聚核苷酸，通过与互补序列杂交，或通过用DNA 聚合酶聚合和利用单链作为模板利用寡聚核苷酸引物可以将单链转变为双链DNA。本领 域内技术人员将会认识到当化学合成的DNA经常限制于约100或150碱基的序列，通过 连接较短的序列或采用更复杂的合成方法可以获得更长的序列。 将会认识到利用非标准的碱基(例如除了腺嘌呤，胞嘧啶，鸟嘌呤，胸腺嘧啶 和尿嘧啶以外)或非标准的主架结构以提供需要的特性(例如增加的核酸酶抗性，较紧的 结合，稳定性或需要的Tm)可以制备本发明的hTRT (或hTR或其它)多聚核苷酸和寡聚 核苷酸。用于呈现寡聚核苷酸核酸酶抗性的技术包括描述于PCT公开W094/12633中的 那些。可以生产各种各样的有用的修饰的寡聚核苷酸，包括具有肽-核酸(PNA)主架的 寡聚核苷酸(Nielsen等人，1991，科学254: 1497)或掺入2’ _0_甲基核糖核苷酸，硫代 磷酸酯核苷酸，甲基磷酸核苷酸，磷酸三酯核苷酸，硫代磷酸酯核苷酸，亚磷酰胺的寡 聚核苷酸。还有其它的有用的寡聚核苷酸可以含有烷基和卤原子替代的糖成分，包括在 2，位置含有下面之一 OH，SH, SCH3, F，OCN, OCH3OCH3, OCH3O (CH2)nCH3. O (CH2)nNH2或O (CH2)nCH3，其中η是从1_约10; C1到Cltl的低级烷基，取代的低级烷 基，烷芳基，或芳烷基；Cl; Br； CN; CF3 ； OCF3 ； 0_，S-，或 N-烷基；0_，S-， 或N-烯基；SOCH3，S02CH3 ； 0Ν02 ； Ν02 ； Ν3 ； ΝΗ2 ；杂环烷基；杂环烷芳基， 氨基烷基氨基；多烷基氨基；取代的甲硅烷基；RNA裂解的基团；胆留烯基；叶酸基 团；报道基团；嵌入剂；用于改善寡聚核苷酸的药物动力学特性的基团；或用于改善寡 聚核苷酸的药物动态学特性的基团和具有类似的特性的其它取代可以直接偶合到，或借 助于接头在任何核苷的2’部分或在3’末端或5’末端的核苷的3’或5’部分将有助 于寡聚核苷酸摄取的叶酸，胆留醇或其它基团例如脂类类似物。可以使用一个或多个这 样的偶合物。寡聚核苷酸也具有模拟糖例如环丁基取代戊糖呋喃糖基。其它实施方案包 括至少一个修饰的碱基形式或“通用的碱基”例如次黄苷，或包含其它的非标准碱基例 如queosine和wybutosine以及乙酰基，甲基，硫代和类似的修饰的腺嘌呤，胞嘧啶，鸟嘌 呤，胸腺嘧啶和尿嘧啶形式，这些修饰形式不易于被内源性核酸内切酶识别。本发明进一步提供了具有主架类似物例如磷酸二酯，硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，甲基磷酸酯， 氨基磷酸酯，烷基磷酸三酯，硫酸，3，-硫代乙酰，亚甲基(methylimino)，3，_N_氨基 甲酸酯，吗啉氨基甲酸酯，和手性的甲基磷酸酯，具有短链烷基或环烷基的糖间键合， 短链杂原子或杂环糖间(“主架”)键合，或CH2-NH-O-CH2, CH2-N(CH3)-OCH2, CH2-O-N (CH3) - (CH2)，CH-N (CH3) —N (CH3) -CH2，禾口 0_N (CH3) -CH2-CH2 主架(其中 磷酸二酯是O-P-O-CH2)，或类似的混合物的核苷。具有吗啉主架结构的寡聚核苷酸也 可用(美国专利5034506)。有用的参考包括寡聚核苷酸，和类似物，由REckstein编辑的，牛津大学出 版社IRL出版(1991)的实践手册；反义方案，纽约科学院年报，第600期，Baserga 禾口 Denhardt (NYAS 1992) ； Milligan 等人，1"3 年7 月 9 日，医学化学杂志 36 (14) 1923-1937 ；反义研究和应用(1993，CRC出版社)，整个文献，特别是第15章，由 Sanghvi发表的名称为“核酸中的杂环碱基修饰和在反义寡聚核苷酸中的应用”，反义治 疗，SudhirAgrawal 编辑(Humana 出版社，Totowa，新泽西州，1996)。

D)标记的核酸例如当hTRT或其它寡聚核苷酸或多聚核苷酸可用作为核酸探针，标记本发明的 核酸经常是有用的。采用本领域内技术人员已知的任何手段可用将标记物(参见下文)掺 入。在一个实施方案中，标记了未扩增的核酸(例如，mRNA，多AmRNA，cDNA)。 生产标记的核酸的手段是本领域内技术人员已知的并且包括例如缺口转译，随机引物标 记，末端标记(例如利用激酶)和化学偶合(例如光生物素化)或合成。在另一个实施方 案中，可以在制备核酸样品的扩增过程中同时掺入标记物。因此，例如用标记的引物或 标记的核苷酸进行的聚合酶链反应(PCR)或其它核酸扩增方法将提供标记的扩增产物。 在另一个实施方案中，利用标记的核苷酸(例如荧光素标记的UTP和/或CTP)的转录扩 增将标记物掺入到转录的核酸。也可以或另一种可选的方法在扩增完成之后，标记扩增 产物。E)说明性的寡聚核苷酸如上文说明的和下文详细讨论的，将寡聚核苷酸用于各种各样的用途，包括用 作为引物，探针，治疗剂或其它反义寡聚核苷酸，三联体寡聚核苷酸和许多其它的用 途，这从本文的公开是显而易见的。表2提供了可用于实施本发明的说明性的特定的寡 聚核苷酸。将会认识到通过下面提供的指导，本领域内技术人员可以合成本发明的许多 其它有用的寡聚核苷酸。表2中，“seq”是指引物已经使用，或可用于测序；“PCR”是指引物已 经被使用或可用于PCR; “AS”是指引物已经被使用或可用于反义抑制端粒酶活性；
“Cl”是指引物已经使用的，或可用于hTRT基因或RNA克隆区域，“mut”是是引物 已经使用，或可用于构建hTRT基因或基因产物的突变体。“UC”是指“上面的情况” 和“lc”是指“下面的情况”。错配和插入(相对于SEQUENCE ID NO: 1)由底下划 线处表明；缺失由“_”表示。将会认识到在表2中没有任何指示计划用于将特定的寡 聚核苷酸限制到单一的用途或几种用途。X uliDVuOWouVOVOUDOuV 9ε·δ-ι
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权利要求
1.人端粒酶逆转录酶6EQID NO:幻的分离的免疫原性肽，其可以引起对人端粒酶 逆转录酶的适应性免疫应答。
2.权利要求1的分离的免疫原性肽，其中所述肽由SEQIDNO: 2的至少8个、优选 至少10个氨基酸组成。
3.人端粒酶逆转录酶6EQIDN0:2)的分离的肽，其包含至少10个氨基酸。
4.一种组合物，其包含前述权利要求任一项的分离的肽和佐剂。
5.—种分离或重组的多核苷酸，其包含hTRT核酸序列的亚序列，所述亚序列包含与 人端粒酶逆转录酶(hTRT) (SEQ ID NO 1)相同或互补的至少12个、至少25个、优选 至少50个连续碱基，条件是所述核酸序列不是SEQ IDNO 8或SEQ ID NO 3。
6.—种分离或重组的多核苷酸，其包含hTRT核酸序列的亚序列，所述亚序列包含a)与质粒pGRN121(ATCC 209016)中第1625至M58位核苷酸的人端粒酶逆转录酶 (hTRT)插入序列的序列相同或互补的至少100个碱基，或b)与质粒pGRN121(ATCC 209016)中第782至1636位核苷酸的人端粒酶逆转录酶 (hTRT)插入序列的序列相同或互补的至少12个碱基、至少25个碱基。
7.权利要求5或6中限定的分离或重组的多核苷酸，其与启动子可操作地连接。
8.—种药物，其包含权利要求1-3任一项的肽或权利要求5-7任一项的多核苷酸以及 药物可接受的载体。
9.权利要求1-3任一项的肽或权利要求5-7任一项的多核苷酸在制备用于治疗癌症的 药物中的应用。
10.一种分离的重组细胞，其包含权利要求5-7任一项的分离的多核苷酸或权利要求 1-3任一项的肽。
全文摘要
本发明提供了与人类端粒酶逆转录酶(hTRT)，人类端粒酶的催化蛋白质亚单位相关的组合物和方法。本发明的聚核苷酸和多肽可用于人类疾病的诊断、预测和治疗，用于改变细胞和生物体的增殖能力，和用于鉴定和筛选用于治疗疾病例如癌症的化合物和治疗药物。
文档编号C12N1/19GK102021153SQ20101015049
公开日2011年4月20日 申请日期1997年10月1日 优先权日1996年10月1日
发明者卡伦·B·查普曼, 卡尔文·B·哈利, 威廉·H·安德鲁斯, 托马斯·R·切赫, 托鲁·纳卡穆拉, 格雷格·B·莫林, 约阿希姆·林纳 申请人:杰龙公司, 科罗拉多大学董事会