专利名称：来自端粒酶的抗原性肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及引发T细胞介导的免疫之蛋白质类或肽类，以及癌症疫苗和包含这样的蛋白质或肽片段之用于抗癌治疗的组合物。本发明还涉及含有蛋白质或肽的药用组合物，以及用于在哺乳动物中产生能识别并破坏肿瘤细胞的T淋巴细胞的方法。
癌症的形成经历了包括数种突变性事件的多步过程。这些突变导致属于癌基因和肿瘤抑制基因这两类基因的表达/功能改变。癌基因天然地通过点突变或易位从原癌基因产生，由此导致一种带有突变的细胞之转化态。所有的癌基因编码一种蛋白质并通过它行使功能。原癌基因是细胞的正常基因，其具有成为癌基因的可能。在大多数情况下，已证实原癌基因为信号转导途径中的成分。癌基因以显性方式起作用。另一方面，肿瘤抑制基因以隐性方式，即通过功能的丧失起作用，当两个编码功能蛋白质的等位基因均被改变以产生非功能性基因产物时，促成肿瘤发生。
改变的癌基因及肿瘤抑制基因的组合之协同作用导致细胞转化及恶性表型的形成。然而，这类细胞易于老化且具有有限的寿命。在多数癌症中，肿瘤细胞的永生化需要一种称为端粒酶的酶复合体的启动。在体细胞中，该酶的催化亚基通常不表达。其它事件，如由肿瘤病毒编码的蛋白质的作用或沉默启动子位点的去甲基化可导致在肿瘤细胞中有功能的端粒酶复合体的表达。
在人类癌症免疫学领域，过去二十年中已有大量工作去表征真正的癌症特异性抗原。尤其是，致力于分析人类肿瘤抗原的抗体。现有技术提示，这类抗体可用于诊断及治疗目的，例如在抗肿瘤药剂的方面。但是，抗体仅仅能与暴露在肿瘤细胞表面的肿瘤抗原结合。因此，基于机体免疫系统的癌症治疗方面的努力始终未能如预期的那样成功。
免疫系统的基本特征是其可区分自我和非我，正常情况下不会对抗自身分子。已证实从其它个体移植的组织或器官排斥是一种针对移植的细胞表面异源抗原的免疫反应。免疫反应一般由抗体介导的体液(humeral)反应和细胞反应构成。抗体由B淋巴细胞产生并分泌，一般识别呈天然构象的游离抗原。由此，它们可能识别几乎任何暴露在抗原表面的位点。与抗体相反，介导免疫反应中细胞性反应的T细胞仅识别MHC类分子中的抗原，且仅在适当的抗原加工后。该抗原加工一般由蛋白质的蛋白质裂解片段化组成，其得到与MHC分子沟槽相适合的肽类。由此使T细胞也识别来自胞内抗原的肽类。
T细胞可识别肿瘤细胞表面MHC分子中来自肿瘤细胞中任何位置的异常肽类。T细胞随即可被活化以消除带有异常肽的肿瘤细胞。在带有鼠肿瘤的实验性模型中已显示，胞内“自身”蛋白质中的点突变可引发肿瘤排斥抗原，所述抗原由与正常肽相差单一氨基酸的肽类组成。识别肿瘤细胞表面的主要组织相容性(MHC)分子中的这些肽类的T细胞能够杀死肿瘤细胞，由此从宿主中排除肿瘤(Boon等人，1989，细胞(Cell)58,293-303)。
人类中MHC分子一般被称为HLA(人白细胞相关抗原)分子。HLA分子有两种主要类型Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型HLA分子由HLAA、B和C亚基因座(subloci)编码，主要活化CD8+细胞毒性T细胞。另一方面，Ⅱ型HLA分子主要活化CD4+T细胞，由DR、DP和DQ亚基因座编码。每一个体正常时具有6种不同的Ⅰ型HLA分子，通常为来自A、B和C三个亚组中各一个的两个等位基因，尽管有时由于相同HLA等位基因出现两次减少了不同Ⅰ型HLA分子的数目。
HLA基因产物为高度多形性的。不同个体表达与见于其他个体中的那些相异的独特HLA分子。由此解释了在移植中寻找HLA匹配的器官供体十分困难。免疫生物学中HLA分子的遗传多样性的显著程度由其作为免疫应答基因的作用可见一斑。通过其肽结合能力，特定HLA分子的存在或不存在决定了一个个体应答特定肽表位的能力。因此，HLA分子决定了对疾病的抗性或易感性。
T细胞可通过多种机制抑制癌症的发生和生长。Ⅰ型HLA限制性CD8+及Ⅱ型HLA限制性CD4+这两类细胞毒性T细胞均可直接杀死呈现适当肿瘤抗原的肿瘤细胞。通常，细胞毒性CD8+T细胞反应需要CD4+辅助T细胞，但是如果肽抗原被适当APC呈递，细胞毒性CD8+T细胞可被直接活化，导致更迅速、强烈和更为有效的反应。
虽然Ⅱ型HLA分子呈递的肽类的长度各种各样(12-25个氨基酸)，由Ⅰ型HLA分子呈递的肽类正常情况下必须为恰好9个氨基酸残基，以符合Ⅰ型HLA结合沟槽。如果较长的肽不能被APC或靶细胞(如癌细胞)在呈递至Ⅰ型HLA沟槽之前内部加工，则不结合。仅报道了有限数量的与这种9氨基酸要求的背离情形，在这些例子中呈递的肽之长度为8或10个氨基酸残基。
关于MHC如何结合肽的综述见于Hans-Georg Rammensee,Thomas Friede和Stefan Stevanovic,(1995，免疫发生(Immunogenetics),41,178-228)以及Barinaga(1992，科学(Science)257,880-881)。Male等(1987，高等免疫学(AdvancedImmunology),J.B.Lippincott Company,Philadelphia)提供了对本发明技术背景的更为全面的解释。
在我们的国际申请PCT/NO92/00032(公开为WO92/14756)中，我们描述了合成肽及癌基因蛋白质产物的片段，与其原癌基因或肿瘤抑制基因蛋白质相比，它们具有点突变或易位。这些肽相应于被癌症细胞或其他抗原呈递细胞呈递的经加工的癌基因蛋白质片段或肿瘤抑制基因片段，或者完全涵盖这样的片段，或者正是这样的片段，且在每一个体中被至少一种等位基因呈递为一种HLA-肽复合体。这些肽还显示出可诱导特定T细胞应答由细胞产生的实际的癌基因蛋白质片段，产生是通过加工并呈递于HLA分子中。特别是，我们描述的肽来源于p21-ras蛋白质，其在特定氨基酸位置即位置12、13和61具有点突变。已证实这些肽在体外有效调节癌症细胞的生长。此外，通过在免疫接种或癌症治疗方案中施用这样的肽，证实这些肽引发针对带有突变的p21-ras癌基因蛋白质的癌症细胞的CD4+T细胞免疫。后来，通过如上所述的施用，我们也证实这些肽也能引发针对带有突变的p21-ras癌基因蛋白质的癌症细胞的CD8+T细胞免疫(见M.K.Gjertsen等，国际癌症杂志(Int.J cancer),1997,72卷，784页)。
然而，上述这些肽仅在某些种类的癌症中有用，即那些涉及在原癌基因或肿瘤抑制基因中带有点突变或易位的癌基因的癌症。因此，强烈需要针对更广泛的癌症的有效的抗癌治疗或疫苗。
通常，就见于肿瘤细胞的遗传改变而言肿瘤是非常异源的。这暗示癌症疫苗的潜在的治疗作用和预防强度均可随着疫苗所能够引发T细胞免疫针对的靶标的增加而增加。多重靶疫苗也会降低由于治疗从原发肿瘤逃脱的变体形成新肿瘤的风险。
近来端粒酶因其在防止细胞衰老中的可能作用成为关注的焦点。端粒酶是一种RNA依赖性DNA聚合酶，其利用呈端粒酶全酶的一个亚基的一种RNA模板合成端粒DNA重复片段。由酶合成的DNA重复被掺入端粒，端粒是见于构成每个染色体的线性DNA分子末端的特殊的DNA-蛋白质结构。在四膜虫属(Tetrahymena)的纤毛虫中首次鉴定了端粒酶(Greider和Blackburn,1985，细胞，43,405-413)。最近由Meyerson等(1990，细胞，1197,785-795)和Nakamura等(1997,科学，277,955-959)鉴定了人端粒酶催化亚基序列，其分别命名为基因hEST2和hTRT。此外，也已鉴定了与端粒酶活性相关的三种其他蛋白质四膜虫的p80和p90(Collins等，1995,细胞，81,677-686)和TP1/TLP1，其是四膜虫p80的哺乳动物同系物(Harrington等，1997,科学，275,973-977；Nakayama等，1997,细胞，88,875-884)。
端粒酶在机体中大多数正常细胞中不表达。人类大多数体细胞谱系中不显示可检测的端粒酶活性，但是，在作为活跃细胞分裂的位点的胚系和一些干细胞成分中可检测到端粒酶活性(Harley等，1994,Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.59,307-315；Kim等，1994,科学，266,2011-2015；Broccoli等，1995，美国国家科学院院报(PNASUSA),92,9082-9086；Counter等，1995,血液(Blood),85,2315-2320；Hiyama等，1995，免疫学杂志(J.Immunol.),155,3711-3715)。人类体细胞大多数类型的端粒酶随着生物体的年龄增加而缩短，与这些细胞中端粒酶活性的缺乏相一致。培养的人类细胞也显示端粒缩短。在已经转化的培养的人类细胞中端粒的缩短持续发生，直到端粒缩短到临界值。此时，称为临界点，可观察到明显水平的细胞死亡和染色体组型不稳定性。
已获得在培养物中无限生长的能力之永生细胞从临界群体中以稀有频率出现。这些永生细胞具有高水平的端粒酶活性和稳定的端粒。在目前分析的人类肿瘤样品中的大多数中也可容易地检测到端粒酶活性(Kim等，1994,科学，266,2011-2015)，包括卵巢癌(Counter等，1994，美国国家科学院院报，91,2900-2904)。由Shay和Bachetti(1997，欧洲癌症杂志(Eur.J.Cancer),33,787-791)提供了全面的综述。因此，端粒酶的活性可克服由端粒长度强迫的持续细胞分裂的障碍。克服了正常衰老机制的细胞可通过稳定端粒长度(可能是由于端粒酶的活性)来克服正常的老化机制。
已知参与人类癌症发展的病毒如Epstein Barr病毒(EBV，涉及B细胞恶变和鼻咽癌)和人乳头瘤病毒(HPV16和18，涉及颈癌)具有永生化人类细胞的能力。现在证实端粒酶活性的诱导是这一过程的关键因素(Klingelhutz等，1996，自然，380,79-82)。
因此，端粒酶是癌症治疗的潜在靶点。已经提出端粒酶抑制剂是一类新型抗癌药物(综述见Sharma等，1997，肿瘤学年鉴(AnnOncol)8(11),1063-1074；Axelrod,1996，自然杂志医药分册(NatureMed)2(2),158-159；Huminiecki,1996,Acta Biochim Pol,43(3),531-538)。已建议人类端粒酶催化亚基的鉴定可提供用于鉴定这类药物的生化试剂(Meyerson等，1990，细胞，1197,785-795)。也已提议端粒酶可作为癌症诊断或预后的标志(Soria和Rixe,1997，癌症公告(Bull Cancer)84(10),963-970；Dahse等，1997，临床化学(ClinChem),43(5),708-714)。
然而就我们所知，此前尚未有人提出端粒酶可作为一种T细胞介导的治疗的有用靶点，或是端粒酶肽或蛋白质可用于治疗或预防癌症。
根据本发明的第一个方面，我们提供了用于癌症治疗或预防的方法中的端粒酶蛋白质或肽。
根据本发明的第二个方面，提供了用于癌症治疗或预防的方法中的核酸，该核酸能编码如本发明第一方面提供的端粒酶蛋白质或肽。
根据本发明的第三个方面，我们提供了一种药物组合物，其含有至少一种如本发明第一或第二方面所提供的端粒酶蛋白质或肽，以及药学可接受的载体或稀释剂。
根据本发明的第四个方面，我们提供了一种制备如本发明第三方面提供的药物组合物的方法，该方法包括将至少一种如本发明第一或第二方面所提供的端粒酶蛋白质或肽或核酸与药学可接受的载体或稀释剂混合。
根据本发明的第五个方面，提供了一种药物组合物，其含有至少一种如本发明第一方面所提供的端粒酶蛋白质或肽，和至少一种能诱导针对癌基因或突变的肿瘤抑制基因蛋白质或肽的T细胞反应的肽，以及药学可接受的载体或稀释剂。
根据本发明的第六个方面，我们提供了一种制备如本发明第五方面所提供的药物组合物的方法，该方法包括将至少一种如本发明第一方面所提供的端粒酶蛋白质或肽，和至少一种能诱导针对癌基因或突变的肿瘤抑制基因蛋白质或肽的T细胞反应的肽，以及药学可接受的载体或稀释剂混合。
根据本发明第七方面，我们提供了端粒酶蛋白质或肽，或能编码端粒酶蛋白质或肽的核酸，在制备治疗或预防癌症的药物中的用途。
根据本发明的第八方面，提供了一种产生在哺乳动物中能识别并破坏肿瘤细胞的T淋巴细胞的方法，包括从哺乳动物中提取T淋巴细胞样本，在存在足以产生端粒酶蛋白质或肽特异性T淋巴细胞的量的端粒酶蛋白质或肽的条件下培养T淋巴细胞样本。
本发明结合如下附图仅以举例方式进一步描述本发明
图1显示，如Meyerson等(1997，细胞，90,785-795)和Nakamura等(1997，科学，277,955-959)所鉴定的人端粒酶催化亚基中的保守氨基酸基序的序列。显示了基序T、1、2、3(A,Nakamura)、4(B′,Nakamura)、5(C,Nakamura)、6(D,Nakamura)和E。可以用任何相应于或涵盖任一括号中区域的序列合成肽。名称A2、A1、A3和B7分别表示可能由HLA-A2、HLA-A1、HLA-A3和HLA-B7呈递的肽。
我们提供了用于癌症治疗或预防的方法中的端粒酶蛋白质或肽。在一个优选实施方案中，该方法包括产生针对端粒酶的T细胞反应。方法可包括向罹患或易于罹患癌症的哺乳动物，优选为人，施用治疗有效量的端粒酶蛋白质或肽，从而在哺乳动物中诱导针对端粒酶的T细胞反应。
端粒酶特异性T细胞可用于靶定表达端粒酶的细胞。因此，由于生物机体中大多数细胞不表达端粒酶，这些细胞将不受影响。然而，表达端粒酶的肿瘤细胞将被靶定并破坏。由于目前鉴定的大多数癌症中已检测到端粒酶活性，我们预期本发明的材料和方法具有广泛的实用性。
适于治疗的癌症包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、结肠-直肠癌、肺癌、恶性黑素瘤、白血病、淋巴瘤、卵巢癌、颈癌和胆道癌。
如此处所用，术语端粒酶表示一种核糖核蛋白酶，其具有端粒延伸活性。此处所用的端粒酶蛋白质表示端粒酶的任何蛋白质成分，包括具有催化活性的任何亚基。
优选地，端粒酶蛋白质是哺乳动物端粒酶蛋白质，最优选地为人端粒酶蛋白质。人端粒酶蛋白质优选是由Nakamura等，(1997，科学，277,955-959)鉴定的hTRT，和由Meyerson等，(1990，细胞，1197,785-795)鉴定的hEST2，其cDNA序列分别保藏为GenBank保藏号AF015950和AFO18167。
如此处所用的术语端粒酶肽是指一种具有与端粒酶蛋白质之氨基酸序列中存在的序列相应的氨基酸序列的肽。端粒酶肽优选地含有8-25个氨基酸。更优选地，端粒酶肽含有9-25个氨基酸。例如端粒酶肽含有个9、12、13、16或21个氨基酸。
选择端粒酶蛋白质或肽，使其能产生针对端粒酶蛋白质(或针对由端粒酶肽所衍生的端粒酶蛋白质)的T细胞反应。在一优选实施方案中，诱导的T细胞反应是细胞毒性T细胞反应。细胞毒性T细胞反应可为CD4+T细胞反应，或可为CD8+T反应。任一情况中，肽必须能以肿瘤细胞或抗原呈递细胞表面上的带有Ⅰ或Ⅱ型MHC蛋白质的复合体形式被呈递，如需要可事先进行抗原加工。
端粒酶肽可包括来自端粒酶蛋白质之生物学功能必需的氨基酸基序的一个或多个氨基酸残基；换言之，其可覆盖至少部分这样的氨基酸基序。这样的氨基酸基序的实例有如Meyerson等，(1990，细胞，1197,785-795)所鉴定的人端粒酶催化亚基序列hEST2之基序1-6，换言之，来自基序LLRSFFYVTESRLRFIPK,LRPIVNMDYVVG,PELYFVKVDVTGAYDTI,KSYVQCQGIPQGSILSTLLCSLCY,LLLRLVDDFLLVT和GCVVNLRKTVV或来自任一如Nakamura等(1997，科学，277,955-959)所鉴定的hTRT序列中的基序T、1、2、A、B’、C、D或E，即基序WLMSVYVVELLRSFFYVTETTFQKNRLFFYRKSVWSKLQSIGIRQHLK,EVRQHREARPALLTSRLRFIPKPDG,LRPIVNMDYVVGARTFRREKRAERLTSRV,
PPPELYFVKVDVTGAYDTIPQDRLTEVIASIIKP,KSYVQCQGIPQGSILSTLLCSLCYGDMENKLFAGI,LLRLVDDFLLVTPHLTH,AKTFLRTLVRGVPEYGCVVNLRKTVV和HGLFPWCGLLL。
可用于此处所述方法和组合物中的适当的肽示于表1以及所附的序列表。
可用于此处所述方法和组合物中的来源于端粒酶序列之其它处的另一套适当的肽示于表2。
还包括了这类蛋白质和肽，其具有与四膜虫端粒酶相关蛋白质p80和p95的哺乳动物同源物之氨基酸序列中存在的氨基酸序列相应的氨基酸序列。例如，p80同源性TP1和TLP1(Harrington等，1997，科学，275,973-977；Nakayama等，1997，细胞88,875-884)。
还包括了这样的较大的肽片段，其在N-末端或C-末端之任一端带有数个氨基酸置换，如已确定的这样的肽可引发具有适当特异性的T细胞克隆。
此处描述的肽尤其适合用于能安全地引发CD4+或CD8+T细胞免疫的疫苗中(a)所述肽为合成的，因此不包含转化癌症基因或其它位点及可产生有害作用的材料，(b)所述肽可单独使用以诱导细胞免疫，(c)所述肽可被靶定用于T细胞反应的特定类型，而无其它不期望反应的副作用。
此处所述的端粒酶肽或蛋白质可以1微克(1μg)至1克(1g)范围的量施用于普通患者或待接种的个体。优选地每次施用采用1微克(1μg)至1毫克(1mg)范围内的较少剂量。
在一优选实施方案中，以药物组合物的形式向患者提供端粒酶蛋白质或肽。端粒酶蛋白质或肽可以以蛋白质混合物或蛋白质与肽的混合物或肽混合物的形式施用。药物组合物可另外包含本领域已知的常用的添加剂、稀释剂、稳定剂等。
药物组合物可包含一种或多种端粒酶蛋白质或肽。蛋白质或肽混合物可为如下任一种(a)具有不同序列，例如相应于端粒酶蛋白质序列的不同部位之肽的混合物；(b)具有重叠序列但适于符合不同HLA等位基因的肽的混合物；(c)(a)和(b)混合物二者的混合物；(d)数种(a)混合物的混合物；(e)数种(b)混合物的混合物；(f)数种(a)混合物与数种(b)混合物的混合物。
在每一情况中，也可以采用相应于不同端粒酶蛋白质的蛋白质或肽混合物，例如相应于端粒酶催化亚基和四膜虫p80或p90的同源物。
或者，混合物中的端粒酶肽彼此可共价连接，以形成较大的多肽或甚至环状肽。可通过将一种或多种端粒酶蛋白质或肽与药学可接受的载体或稀释剂混合制备药物组合物。
药物组合物也可包含至少一种能诱导针对癌基因或突变肿瘤抑制基因蛋白质或肽的T细胞反应的肽。或者，可同时或以任选地顺序与这些肽一起施用端粒酶蛋白质或肽。癌基因蛋白质的实例有p21-ras蛋白质、H-ras、K-ras和N-ras、abl、gip、gsp、ret和trk。优选地，癌基因蛋白质或肽是p21-ras蛋白质或肽，例如，在我们的国际申请PCT/NO92/00032(公开号WO92/14756)中所述的p21-ras肽。肿瘤抑制基因蛋白质包括p53和Rb(成视网膜细胞瘤)。可通过将一种或多种端粒酶蛋白质或肽与突变的肿瘤抑制基因或癌基因蛋白质或肽，以及药学可接受的载体或稀释剂混合，制备这样的药物组合物。
如此处所用，术语突变体是指具有一种或多种如下情况的野生型序列点突变(转换或颠换)、缺失、插入、复制易位或翻转。术语药物组合物不仅包括可用于癌症患者治疗的组合物，也包括可用于预防的组合物，即疫苗组合物。
将端粒酶肽或蛋白质施用于需要这种治疗或预防的人类个体。可适当地单次或数次施用，以建立和/或维持希望的T细胞免疫。本领域知晓，肽可以同时或分别与诸如细胞因子和/或生长因子一起施用，以增强免疫反应。所述细胞因子和/或生长因子即白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素12(IL-12)、粒细胞巨嗜细胞集落刺激因子(GM-CSF)等。在疫苗或治疗组合物中端粒酶蛋白质或肽可单独使用，或与其它物质一起使用。例如，肽或多种肽可以已知可诱导高亲和性细胞毒性T细胞反应的脂肽形式提供(Deres,1989，自然，342)。
作为药物组合物中可能的组分之肽和蛋白质可以以编码特定肽或蛋白质的核酸形式提供。因此，药物组合物可仅由肽和/或蛋白质组成，或与核酸一起组成，或其可由核酸混合物组成。
端粒酶肽或蛋白质可以DNA疫苗的形式施用于个体。编码端粒酶肽或蛋白质的DNA可呈克隆的质粒DNA或合成的寡核苷酸形式。DNA可与细胞因子(如IL-2)，和/或与其它共刺激分子一起递送。细胞因子和/或共刺激因子自身可以质粒或寡核苷酸DNA形式递送。
对DNA疫苗的反应已证实随免疫刺激性DNA序列(ISS)的存在而加强。其可呈含有甲基化CpG的六聚体基序形式，如下式5’-嘌呤-嘌呤-CG-嘧啶-嘧啶-3’。因此，我们的DNA疫苗可在编码端粒酶肽或蛋白质的DNA中，在编码细胞因子或其它共刺激分子中，或这二者中，掺入这些或其它ISS。DNA免疫接种的优点之综述见Tighe等(1998，今日免疫学(Immunology Today),19(2),89-97)。
我们描述了一种治疗罹患癌症的患者的方法，该方法包括通过用端粒酶蛋白质或肽体内或离体刺激引发T细胞反应。端粒酶蛋白质或肽也可用于为了获得针对癌症的抗性之患者免疫接种方法中。免疫接种的适当方法包括用端粒酶蛋白质或肽体内或离体刺激引发T细胞反应。我们还描述了一种治疗或预防癌症的方法，包括向罹患或易于罹患癌症的哺乳动物施用治疗有效量的端粒酶蛋白质或肽，从而在哺乳动物中诱导针对端粒酶的T细胞反应。
此处描述的肽可通过常规方法制备，例如，通过本领域已知的多种肽合成方法。或者，可通过例如利用溴化氰裂解，及随后的纯化制备端粒酶蛋白质的片段。也可采用酶促裂解。端粒酶蛋白质或肽也可呈重组表达的蛋白质或肽的形式。
可通过寡核苷酸合成制备编码端粒酶肽的核酸。这可通过本领域周知的多种方法之任一种进行。利用常规文库筛选可从基因组或cDNA文库中克隆编码端粒酶蛋白质的核酸。探针可相应于已知端粒酶基因的任一序列的一个部分。或者，可利用聚合酶链反应(PCR)获得核酸。核酸优选为DNA，且可适当地被克隆入载体。可利用适当的限制性酶产生亚克隆。可在适当的宿主，例如细菌宿主中扩增克隆或亚克隆的DNA。或者，宿主可为真核生物，诸如酵母或杆状病毒。可通过在适当宿主中表达制备端粒酶蛋白质或肽。在这种情况中，将DNA克隆入表达载体。已有多种商业化表达试剂盒。描述于Maniatis等(1991，分子克隆实验室手册，Cold Spring Harbor,NewYork,Cold Spring Harbor Laboratory Press)和Harlow及Lane(1988，抗体实验室手册Cold Spring Harbor,New York,Cold SpringHarbor Laboratory Press)中的方法可用于此目的。实验方法采用连续流固相肽合成法合成肽。使用带有适当侧链保护的N-α-Fmoc-氨基酸。Fmoc-氨基酸被活化以五氟苯基酯用于偶联，或在偶联前利用TBTU或二异丙基碳二亚胺活化。每次偶联后使用20％哌啶的DMF溶液选择性除去Fmoc。利用含95％TFA的适当清除剂进行从树脂的切割以及侧链保护的最后去除。利用反相(C18)HPLC纯化并分析肽。利用电子喷射质谱(Finnigan mat SSQ710)证实肽的相同性。
为了使肿瘤疫苗及基于T细胞免疫的特异性癌症治疗方法有效，须满足以下三个条件(a)肽至少为8个氨基酸长，且为端粒酶蛋白质的片段，及(b)以其全长或由抗原呈递细胞加工后，肽能够诱导T细胞反应。
如下实验方法可用于确定特定肽是否满足了这三个条件。首先，应确定是否特定肽可在体外引发T细胞免疫反应。也需要确定是否合成的肽相应于(或经加工后能产生)这样的肽片段，所述肽片段相当于带有端粒酶的癌症细胞(或者已加工天然存在的端粒酶的抗原呈递细胞)中存在的肽片段。也可确定由端粒酶肽免疫接种体内诱导的T细胞特异性。
需要确定表达端粒酶的肿瘤细胞系是否能够被从经端粒酶肽免疫接种后的癌症患者外周血中获得的T细胞克隆杀死。在端粒酶肽免疫接种后，从癌症患者中克隆存在于外周血单核细胞的T细胞胚(blast)后获得T细胞克隆。肽免疫接种方案包括数次肽与GM-CSF或其它常用佐剂皮内注射的体内注射。以每孔5个胚将应答的T细胞胚接种至Terasaki平板进行T细胞克隆。每孔含有2×104自体的、经辐照(30Gy)的PBMC作为饲喂细胞。在总体积20mL中用25mM候选物端粒酶肽和5U/ml重组白细胞介素-2(rIL-2)(Amersham,Aylesbury，英国)增殖细胞。9天后，将T细胞克隆转移至平底96孔板上(Costar,Cambridge,MA)，其中每孔带有1mg/ml植物凝集素(PHA,Wellcome,Dartford，英国)、5U/ml rIL-2和同种异体的经辐照的(30Gy)PBMC(2×105)作为饲喂细胞。用PHA/rIL-2和1×106同种异体的经辐照的PBMC作为饲喂细胞进一步扩增生长的克隆，在4-7天后筛查肽特异性。
选择T细胞克隆用于进一步表征。测定T细胞克隆的细胞表面表型以确定T细胞是CD4+或CD8+。以不同的效应物与靶标之比将T细胞克隆与自体肿瘤细胞温育，以确定是否发生肿瘤细胞的裂解。裂解表明T细胞具有针对肿瘤衍生的抗原，例如端粒酶蛋白质的反应性。
为了确证识别的抗原与端粒酶蛋白质相关，且为了鉴定将推定的端粒酶肽呈递至T细胞克隆的Ⅰ型或Ⅱ型HLA分子，在细胞毒性分析实验中使用带有一种或多种所用的那些患者中共同的Ⅰ型或Ⅱ型HLA分子的不同的表达端粒酶的肿瘤细胞系作为靶细胞。用51Cr或3H-胸腺嘧啶(9.25×104Bq/mL)标记靶细胞过夜，洗涤一次，以每孔5000个细胞接种在96孔板中。以不同的效应物与靶之比加入T细胞，于37℃温育平板4小时。收获后在液体闪烁计数器(PackardTopcount)中计数。例如，可将膀胱癌细胞系T24(12Val+,HLA-A1+,B35+)、黑色素瘤细胞系FMEx(12Val+,HLA-A2+,B35+)和结肠癌细胞系SW480(12Val+,HLA-A2+,B8+)或任何其它端粒酶阳性肿瘤细胞系用做靶细胞。可将不表达端粒酶蛋白质的适当细胞系用做对照，且不应当被裂解。特定细胞系的裂解表明，所测试的T细胞克隆在由该细胞表达的Ⅰ型或Ⅱ型HLA分子范围中识别一种内源性加工的端粒酶表位。
T细胞克隆的Ⅰ型或Ⅱ型HLA限制性可通过封闭实验确定。可使用针对Ⅰ型HLA抗原的单克隆抗体，例如泛反应性(panreactive)Ⅰ型HLA单克隆抗体W6/32，或针对Ⅱ型抗原的单克隆抗体，例如针对Ⅱ型DR、DQ和DP抗原(B8/11,SPV-L3和B7/21)HLA的单克隆抗体。利用终浓度为10mg/ml的针对Ⅰ型和Ⅱ型HLA分子的单克隆抗体评估针对自体肿瘤细胞系的T细胞克隆活性。如上述以3个重复样本在96孔板中设置分析实验，在添加T细胞之前将靶细胞在37℃预温育30分钟。
利用肽脉冲实验可确定T细胞克隆的精确特异性。为鉴定事实上可被T细胞克隆识别的端粒酶肽，测试了一组九碱基肽。以每孔2500个细胞将51Cr或3H-胸腺嘧啶标记的、温和酸洗脱的自体成纤维细胞接种于96孔板，在加入T细胞之前，用浓度为1mM的肽以及β2-微球蛋白(2.5mg/mL)在5％CO2培养箱于37℃脉冲。以3个重复样本在96孔板中设置分析实验，用效应物与靶之比为5∶1温育4小时。对照可包括单独培养的T细胞克隆，以及不含肽的APC或不相关的黑色素瘤相关肽MART-1/Melan-A肽。
测定T细胞克隆的精确特异性的另一种替代方法也可使用。在此替代方法中，使用TAP缺陷T2细胞系作为抗原呈递细胞。此细胞系仅表达少量HLA-A2抗原，但是通过添加β2-微球蛋白可在细胞表面诱导Ⅰ型HLA抗原的水平增加。以1mM浓度之不同的测试肽和对照肽同β2-微球蛋白(2.5mg/mL)一起与3H标记的靶细胞在37℃下温育1小时。肽脉冲后，充分洗涤靶细胞，计数，在加入T细胞之前以每孔2500个细胞接种于96孔板。收获前在37℃于5％CO2培养箱中将孔板温育4小时。对照包括单独培养的T细胞克隆或在不存在肽的条件下与靶细胞一起培养的T细胞。以3个重复样本在96孔板中设置分析实验，效应物与靶之比为20∶1。
还可利用剂量-反应实验测定T细胞克隆对上述鉴定的特定肽的敏感性。可使用肽敏化的成纤维细胞作为靶细胞。将靶细胞用如上述特定的肽脉冲用于精确特异性的测定，不同的是在加入T细胞前以不同的浓度加入肽。对照包括单独的靶细胞以及用不相关的黑色素瘤相关肽MART-1/Melan-A脉冲的靶细胞。生物学实验/附图描述图1图1(Fig.1)描述了用带有序列号9和10的端粒酶肽免疫的HLA-A2(A2/Kb)转基因小鼠中端粒酶(hTERT)反应性细胞毒性T淋巴细胞(CTL’s)的诱导。使用标准HLA-A2限制性流感(58-66)肽作为对照。三组中的五只小鼠的每一只注射107个辐照的肽脉冲(100μg/ml)的有血缘关系的脾细胞，每周一次，共两次。第二次注射后，处死小鼠，收获其脾。利用标准技术制备脾细胞，在51Cr释放分析实验中测试针对用HLA-A2(A2/Kb)转染的表达hTERT的靶细胞(Jurkat)的细胞毒性之前，用来自引发动物的细胞体外再刺激5天，方法是通过与肽脉冲(10μg/ml)的辐照的自体脾细胞(作为抗原呈递细胞)共培养。
图1的左侧柱显示，在以不同的效应物与靶之比用具有序列号9的肽引发小鼠后，用所得T细胞杀死对照肽(流感58-66)脉冲的HLA-A2转染的Jurkat细胞。在所有效应物与靶之比中均观察到高于背景的特异性细胞毒性。中间的柱显示来自用具有序列号10的肽引发的小鼠之T细胞具有相似的数据。仅在当用来自端粒酶肽脉冲的小鼠之脾细胞用做效应物细胞时，观察到Jurkat细胞的显著杀伤，因此，当来自流感肽引发的小鼠之脾细胞用做效应物时，仅观察到背景水平的Jurkat细胞杀伤当靶细胞用不相关肽(melanocortin受体1肽MC1R244)脉冲时如图1右侧柱所示。这些结果证实，具有序列号9和10的肽为体内免疫原性，一经免疫可在带有共同人MHC分子HLA-A2的温血动物中引发免疫反应。这一发现表明，具有SEQ IDNO.9和10的肽也可在带有HLA-A2或能结合这些肽的其它Ⅰ型HLA分子之人中用做癌症疫苗。此外，这些结果证实，由T细胞白血病系Jurkat表达的hTERT可通过细胞系的蛋白质裂解机制被加工，以产生与具有序列号9和10的肽相同或类似的肽片段。上述这些观察结果表明，用这些肽免疫接种癌症患者或具有形成癌症风险的患者后获得的免疫反应，可足以杀死表达端粒酶hTERT亚基的肿瘤细胞。
图1显示HLA-A2转染的Jurkat细胞与效应物细胞的细胞毒性，所述效应物细胞获自如图所示免疫的小鼠。用51Cr(0,151Ci/100μl细胞悬液)37℃标记靶细胞1小时，洗涤两次，洗涤前用肽(1μg/ml)于37℃脉冲1小时。以每孔2000个标记的肽脉冲的靶细胞接种入96孔V-底微滴定板中，每孔中加入效应物细胞(2,5×104至2×105)。37℃下温育培养物4小时，收集悬液于γ-计数器中测试。图1中的结果以如下式计算的比细胞毒性表示 图2图2(Fig.2)显示用具有序列号2、3、4和7序列的端粒酶(hTERT)衍生肽体外刺激外周血T细胞的结果，所述T细胞来自患有结肠癌的患者(TT)。如下进行体外培养在5％CO2的潮湿培养箱中于X-VIVO 10培养基中培养3个重复样本的105单核细胞6天，所述培养基中补加15％合并的热灭活人血清。在培养基中以终浓度30μg/ml在整个培养过程中存在肽。不合肽的培养物作为对照。当T细胞用具有序列号4的肽刺激时可见高于背景的增生反应。这些结果证实来自癌症患者的血中含有特异于端粒酶(hTERT)衍生肽之循环性T细胞。这些结果证实，端粒酶(hTERT)的酶促亚基在人类中是免疫原性的，当由患者中生长的肿瘤过度表达时可自发地引起端粒酶特异性T细胞反应。此外，在此患者中的端粒酶特异性反应的一个组分针对此处描述的具有SEQ ID NO.4的肽。这一发现表明，具有SEQ IDNO.4的肽也可在人类中用做癌症疫苗。图中显示常规T细胞增殖的分析鉴定结果，其中在收获前3份重复样本的外周血单核细胞(105)与所示肽培养7天。为测定培养物的增殖能力，收获前将3H-胸腺嘧啶(3,7×104Bq/孔)加入培养物中过夜。所得值以3个重复样本的每分钟平均计数(cpm)表示。图3和4图3和4(Fig.3和Fig.4)显示获自晚期胰腺癌患者的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的反应性。T细胞获自肿瘤活检样本，在体外成功增殖以建立一T细胞系。T细胞系为CD3+、CD4+和CD8-，应答端粒酶肽而特异性增生。图3的结果显示当与仅带有培养基的对照相比，T细胞识别具有SEQ ID NO.2和3的肽。图4的结果显示T细胞识别具有SEQ ID NO.2的肽。通过与重组人白细胞介素2(rIL-2)共培养扩增TIL，并在14天后利用具有SEQ ID NO.2、3、4和7的肽在标准增生分析鉴定中测试。
表1LMSVYVVEL FLHWLMSVYVVELLRSFFYVTEELLRSFFYV EARPALLTSRLRFIPKYVVELLRSF DGLRPIVNMDYVVGARVVELLRSFF GVPEYGCVVNLRKVVNFSVYVVELLRVELLRSFFYYVTETTFQKRLFFYRKSVSIGIRQHLKRPALLTSRLALLTSRLRFLLTSRLRFIRPIVNMDYVLRPIVNMDYYVVGARTFRVVGARTFRRGARTFRREKARTFRREKPPPELYFVKVELYFVKVDVFVKVDVTGAIPQDRLTEVDRLTEVIASRLTEVIASIIPQGSILSTLILSTLLCSLLLRLVDDFLRLVDDFLLVVPEYGCVVNVPEYGCVVNLTLVRGVPEYFLRTLVRGVGVPEYGCVVVVNLRKTVVGLFPWCGLL
表2YAETKHFLYISDTASLCYDTDPRRLVQAQDPPPELYLTDLQPYMRQSDYSSYARILAKFLHWLELLRSFFYVLLARCALFVWLCHQAFLLRLVDDFLLVRLFFYRKSVLQLPFHQQVRLGPQGWRLSLQELTWKMNVLAFGFALVLLKTHCPLFLLVTPHLTTLTDLQPYMRLTEVIASIFLDLQVNSLSLNEASSGLILSTLLCSLLLGASVLGLVLAFGFALLLQPYMRQFVLMSVYVVELRLPQRYWQMRQHSSPWQVYLPNTVTDANMRRKLFGVRLTSRVKALLLQAYRFHALLDTRTLEVYMRQFVAHLLLTSRLRFICLVCVPWDALLSSLRPSL
表2(续)FMCHHAVRILQVNSLQTVLVAQCLVCVCLKELVARVFLRNTKKFIALPSDFKTIVLVHLLARCVQSDYSSYASVWSKLQSIKLPGTTLTAQLSRKLPGTELYFVKVDVGLLLDTRTLWMPGTPRRLSLTGARRLVVVIEQSSSLLPSEAVQWLQAYRFHACVGLFDVFLRFKLFGVLRLKRLREEILAKTLVRGVPEYGLPAPGARRGLFPWCGLLKLTRHRVTYVLPLATFVRELVARVLQRDPRRLVQLLFVRACLRRLSVREAGVPLAGRNMRRKLLARCALFVLRPAEEATSLLPSDFKTILLPSEAVQWLLPGTTLTALRPSFLLSSLLPNTVTDALRPALLTSRL
表2(续)RCRAVRSLLMPRAPRCRAGIRRDGLLLVLRLKCHSLYMRQFVAHLSLRTAQTQLQMRPLFLELLLRLVDDFLFVQMPAHGLHASGPRRRLVVIEQSSSLRVISDTASLCVPAAEHRLRVKALFSVLNVLAFGFALLVARVLQRLFAGIRRDGLHAQCPYGVLRAQDPPPELAYRFHACVLHAKLSLQELGAKGAAGPLTASLCYSILAPRCRAVRSGARRLVETIAQCPYGVLLHAKTFLRTLEATSLEGALKAKNAGMSLAQTQLSRKLAGIRRDGLLVLRLKCHSLILKAKNAGMDPRRLVQLLGAKGAAGPLFAGIRRDGLGARRRGGSAHAKTFLRTLHAKLSLQEL
表2(续)LARCALFVLEHRLREEILNMRRKLFGVCAREKPQGSLTRHRVTYVRRFLRNTKKRRDGLLLRLRREKRAERLRRLVETIFLLRFMCHHAVRRYAVVQKAKRAERLTSRRRKLFGVLRRRRGGSASRRRLPRLPQRRRLGPQGWRLRGSGAWGLHREARPALLVRRYAVVQKARTSIRASLHRVTYVPLLLRSHYREVLMRPLFLELLHRAWRTFVLMRRKLFGVLLRLVDDFLLLRRVGDDVLYRKSVWSKLQRLCERGAKFRALVAQCLSRKLPGTTLLRRLVPPGLRRSPGVGCVRRVGDDVLVVRGCAWLRRVRSLLRSHYARTFRREKRSRSLPLPKRIRASLTFNR
表2(续)LREEILAKFIRRDGLLLRQRGDPAAFRLRPIVNMDYARRLVETIFARPALLTSRLRPSLTGARLRLKCHSLFFRREKRAERARGGPPEAFCRAVRSLLRGRTRGPSDRRRRLGCERALRELSEAEVARCALFVLVRPAEEATSLDPRRLVQLLRPSFLLSSLLPSEAVQWLRPALLTSRLLPSDFKTILRPPPAAPSFLPRLPQRYWLPNTVTDALLPGTTLTALLAKFLHWLMKAKNAGMSLGSRHNERRFKALFSVLNYSPLRDAVVIRAQDPPPELMPAHGLFPWAEVRQHREAREAGVPLGLEEATSLEGALEAAANPALQETSPLRDAREVLPLATF
表2(续)KEQLRPSFLREKPQGSVALEVQSDYSSREARPALLTEEDTDPRRLREEILAKFLCERGAKNVLDDVLVHLLAGDMENKLFAYERARRPGL
序列相同性列表序列表所有序列共同。序列类型肽序列单位氨基酸拓扑学线性SEQ ID NO:1序列长度22个氨基酸F L H W L M S V Y V V E L L R S F F Y V T E1 510 1520SEQ ID NO:2序列长度16个氨基酸E A R P A L L T S R L R F I P K1 5 1015SEQ ID NO:3序列长度16个氨基酸D G L R P I V N M D Y V V G A R1 5 1015SEQ ID NO:4序列长度18个氨基酸G V P E Y G C V V N L R K T V V N F1 5 1015SEQ ID NO:5序列长度23个氨基酸K F L H W L M S V Y V V E L L R S F F Y V T E1 5 101520SEQ ID NO:6序列长度17个氨基酸K F L H W L M S V Y V V E L L R S1 5 1015SEQ ID NO:7序列长度18个氨基酸L M S V Y V V E L L R S F F Y V T E1 5 1015SEQ ID NO:9序列长度9个氨基酸I L A K F L H W L15SEQ ID NO:10序列长度9个氨基酸E L L R S F F Y V1 5SEQ ID NO:11序列长度9个氨基酸L M S V Y V V E L1 5SEQ ID NO:12序列长度9个氨基酸T S R L R F I P K1 5SEQ ID NO:13序列长度9个氨基酸L T S R L R F I P1 5SEQ ID NO:14序列长度9个氨基酸L L T S R L R F I1 5SEQ ID NO:15序列长度9个氨基酸A L L T S R L R F1 5SEQ ID NO:16序列长度9个氨基酸P A L L T S R L R1 5SEQ ID NO:17序列长度9个氨基酸R P A L L T S R L1 5SEQ ID NO:18序列长度9个氨基酸A R P A L L T S R1 5SEQ ID NO:19序列长度9个氨基酸E A R P A L L T S1 权利要求
1．一种用于治疗或预防癌症的方法中的端粒酶蛋白质或肽。
2．用于如权利要求1中所确定的用途的权利要求1中的端粒酶蛋白质或肽，端粒酶蛋白质或肽能够产生针对端粒酶蛋白质的T细胞反应。
3．用于如权利要求1或2中所确定的用途之权利要求1或2中的端粒酶蛋白质或肽，其中的方法包括向罹患或易于罹患癌症的哺乳动物使用治疗有效量的端粒酶蛋白质或肽，从而在哺乳动物中诱导针对端粒酶的T细胞反应。
4．用于如权利要求2或3中所确定的用途之权利要求2或3中的端粒酶蛋白质或肽，其中诱导的T细胞反应是细胞毒性T细胞反应。
5．用于如前述权利要求中任一项所确定的用途之前述权利要求任一项中的端粒酶蛋白质或肽，其中的端粒酶蛋白质或肽是人端粒酶蛋白质或肽。
6．用于如前述权利要求中任一项所确定的用途之前述权利要求任一项中的端粒酶肽，其中的端粒酶肽是长度为8-25的氨基酸。
7．用于如权利要求6中所确定的用途之权利要求6的端粒酶肽，其中的肽长度为9、12、13、16或21个氨基酸。
8．用于如前述权利要求1-5中任一项所确定的用途之前述权利要求1-5中任一项的端粒酶肽，其中肽长度至少为9个氨基酸。
9．用于如前述权利要求中任一项所确定的用途之前述权利要求任一项中的端粒酶肽，其中的端粒酶肽具有与选自下列序列中的任一种序列部分或全部重叠的氨基酸序列LLRSFFYVTE,SRLRFIPK,LRPIVNMDYVVG,PELYFVKVDVTGAYDTI,KSYVQCQGIPQGSILSTLLCSLCY,LLLRLVDDFLLVT,GCVVNLRKTVV,WLMSVYVVELLRSFFYVTETTFQKNRLFFYRKSVWSKLQSIGIRQHLK,EVRQHREARPALLTSRLRFIPKPDG,LRPIVNMDYVVGARTFRREKRAERLTSRV,PPPELYFVKVDVTGAYDTIPQDRLTEVIASIIKP,KSYVQCQGIPQGSILSTLLCSLCYGDMENKLFAGI,LLRLVDDFLLVTPHLTH,AKTFLRTLVRGVPEYGCVVNLRKTVV和HGLFPWCGLLL。
10．用于如前述权利要求中任一项所确定的用途之前述权利要求任一项中的端粒酶肽，其中的端粒酶肽具有氨基酸序列LMSVYVVEL,ELLRSFFYV,YVVELLRSF,VVELLRSFF,SVYVVELLR,VELLRSFFY,YVTETTFQK,RLFFYRKSV,SIGIRQHLK,RPALLTSRL,ALLTSRLRF,LLTSRLRFI,RPIVNMDYV,LRPIVNMDY,YVVGARTFR,VVGARTFRR,GARTFRREK,ARTFRREKP,PPELYFVKV,ELYFVKVDV,FVKVDVTGA,IPQDRLTEV,DRLTEVIAS,RLTEVIASI,IPQGSILSTL,ILSTLLCSL,LLRLVDDFL,RLVDDFLLV,VPEYGCVVN,VPEYGCVVNL,TLVRGVPEY,FLRTLVRGV,GVPEYGCVV,VVNLRKTVV 或GLFPWCGLL。
11．用于如前述权利要求中任一项所确定的用途之前述权利要求任一项中的端粒酶肽，其中的端粒酶肽具有氨基酸序列FLHWLMSVYVVELLRSFFYVTE,EARPALLTSRLRFIPK,DGLRPIVNMDYVVGAR或GVPEYGCVVNLRKVVNF,即分别是SEQ ID NO.1、2、3或4。
12．用于如前述权利要求中任一项所确定的用途之前述权利要求任一项中的端粒酶肽，其中的端粒酶肽具有氨基酸序列YAETKHFLY,ISDTASLCY,DTDPRRLVQ,AQDPPPELY,LTDLQPYMR,QSDYSSYAR,ILAKFLHWL,ELLRSFFYV,LLARCALFV,WLCHQAFLL,RLVDDFLLV,RLFFYRKSV,LQLPFHQQV,RLGPQGWRL,SLQELTWKM,NVLAFGFAL,VLLKTHCPL,FLLVTPHLT,TLTDLQPYM,RLTEVIASI,FLDLQVNSL,SLNEASSGL,ILSTLLCSL,LLGASVLGL,VLAFGFALL,LQPYMRQFV,LMSVYVVEL,RLPQRYWQM,RQHSSPWQV,YLPNTVTDA,NMRRKLFGV,RLTSRVKAL,LLQAYRFHA,LLDTRTLEV,YMRQFVAHL,LLTSRLRFI,CLVCVPWDA,LLSSLRPSL,FMCHHAVRI,LQVNSLQTV,LVAQCLVCV,CLKELVARV,FLRNTKKFI,ALPSDFKTI,VLVHLLARC,VQSDYSSYA,SVWSKLQSI,KLPGTTLTA,QLSRKLPGT,ELYFVKVDV,GLLLDTRTL,WMPGTPRRL,SLTGARRLV,VVIEQSSSL,LPSEAVQWL,QAYRFHACV,GLFDVFLRF,KLFGVLRLK,RLREEILAK,TLVRGVPEY,GLPAPGARR,GLFPWCGLL,KLTRHRVTY,VLPLATFVR,ELVARVLQR,DPRRLVQLL,FVRACLRRL,SVREAGVPL,AGRNMRRKL,LARCALFVL,RPAEEATSL,LPSDFKTIL,LPSEAVQWL,LPGTTLTAL,RPSFLLSSL,LPNTVTDAL,RPALLTSRL,RCRAVRSLL,MPRAPRCRA,GIRRDGLLL,VLRLKCHSL,YMRQFVAHL,SLRTAQTQL,QMRPLFLEL,LLRLVDDFL,FVQMPAHGL,HASGPRRRL,VVIEQSSSL,RVISDTASL,CVPAAEHRL,RVKALFSVL,NVLAFGFAL,LVARVLQRL,FAGIRRDGL,HAQCPYGVL,RAQDPPPEL,AYRFHACVL,HAKLSLQEL,GAKGAAGPL,TASLCYSIL,APRCRAVRS,GARRLVETI,AQCPYGVLL,HAKTFLRTL,EATSLEGAL,KAKNAGMSL,AQTQLSRKL,AGIRRDGLL,VLRLKCHSL,ILKAKNAGM,DPRRLVQLL,GAKGAAGPL,FAGIRRDGL,GARRRGGSA,HAKTFLRTL,HAKLSLQEL,LARCALFVL,EHRLREEIL,NMRRKLFGV,CAREKPQGS,LTRHRVTYV,RRFLRNTKK,RRDGLLLRL,RREKRAERL,RRLVETIFL,LRFMCHHAV,RRYAVVQKA,KRAERLTSR,RRKLFGVLR,RRRGGSASR,RRLPRLPQR,RRLGPQGWR,LRGSGAWGL,HREARPALL,VRRYAVVQK,ARTSIRASL,HRVTYVPLL,LRSHYREVL,MRPLFLELL,HRAWRTFVL,MRRKLFGVL,LRLVDDFLL,LRRVGDDVL,YRKSVWSKL,QRLCERGAK,FRALVAQCL,SRKLPGTTL,LRRLVPPGL,RRSPGVGCV,RRVGDDVLV,VRGCAWLRR,VRSLLRSHY,ARTFRREKR,SRSLPLPKR,IRASLTFNR,LREEILAKF,IRRDGLLLR,QRGDPAAFR,LRPIVNMDY,ARRLVETIF,ARPALLTSR,LRPSLTGAR,LRLKCHSLF,FRREKRAER,ARGGPPEAF,CRAVRSLLR,GRTRGPSDR,RRRLGCERA,LRELSEAEV,ARCALFVLV,RPAEEATSL,DPRRLVQLL,RPSFLLSSL,LPSEAVQWL,RPALLTSRL,LPSDFKTIL,RPPPAAPSF,LPRLPQRYW,LPNTVTDAL,LPGTTLTAL,LAKFLHWLM,KAKNAGMSL,GSRHNERRF,KALFSVLNY,SPLRDAVVI,RAQDPPPEL,MPAHGLFPW,AEVRQHREA,REAGVPLGL,EEATSLEGA,LEAAANPAL,QETSPLRDA,REVLPLATF,KEQLRPSFL,REKPQGSVA,LEVQSDYSS,REARPALLT,EEDTDPRRL,REEILAKFL,CERGAKNVL,DDVLVHLLA,GDMENKLFA 或YERARRPGL。
13．一种用于癌症的治疗或预防的方法中的核酸，该核酸能够编码如前述权利要求中任一项的端粒酶蛋白质或肽。
14．一种药物组合物，其含有至少一种如权利要求1-12中任一项的端粒酶蛋白质或肽，或者至少一种权利要求13中的核酸，以及药学可接受的载体或稀释剂。
15．一种药物组合物，其含有至少一种如权利要求1-12中任一项的端粒酶蛋白质或肽，和至少一种能够引发针对癌基因或突变的肿瘤抑制基因蛋白质或肽的T细胞反应的肽，以及药学可接受的载体或稀释剂。
16．如权利要求14或15中的药物组合物，其用于治疗或预防选自下列的任一种癌症乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、结肠-直肠癌、肺癌、恶性黑素瘤、白血病、淋巴瘤、卵巢癌、颈癌和胆道癌。
17．一种制备权利要求14的药物组合物的方法，其中该方法包括将至少一种权利要求1-12中任一项的端粒酶蛋白质或肽，或至少一种权利要求13中的核酸与药学可接受的载体或稀释剂混合。
18．一种制备权利要求15的药物组合物的方法，其中该方法包括将至少一种权利要求1-12中任一项的端粒酶蛋白质或肽，与至少一种能够诱导针对癌基因或突变的肿瘤抑制基因蛋白质或肽的T细胞反应，以及药学可接受的载体或稀释剂混合。
19．一种权利要求15的药物组合物或制备权利要求18的药物组合物的方法，其中的癌基因蛋白质或肽是突变的p21-ras蛋白质或肽。
20．一种权利要求15的药物组合物或制备权利要求18的药物组合物的方法，其中的肿瘤抑制基因蛋白质或肽是成视网膜细胞瘤或p53蛋白质或肽。
21．一种端粒酶蛋白质或肽，或者能编码端粒酶蛋白质或肽的核酸在制备用于治疗或预防癌症的药物中的用途。
22．一种产生能识别并破坏哺乳动物中肿瘤细胞的T淋巴细胞的方法，其中该方法包括从哺乳动物中取样，在足以产生端粒酶T淋巴细胞的量的端粒酶蛋白质或肽存在的条件下培养T淋巴细胞样本。
23．基本上如此前描述的并参考且如附图所示的用于癌症的治疗或预防方法中的端粒酶蛋白质或肽。
24．基本上如此前描述的并参考且如附图所示的端粒酶蛋白质或肽，或能够编码端粒酶或肽的核酸在制备治疗或预防癌症的药物中的用途。
25．一种核酸，其能够编码基本上如此前描述的并参考且如附图所示的用于癌症的治疗或预防的方法中的端粒酶蛋白质或肽。
26．一种药物组合物，或一种制备这类药物组合物的方法，该药物组合物包括至少一种基本上如此前描述的并参考且如附图所示的端粒酶蛋白质或肽。
27．一种产生基本上如此前所述的端粒酶T淋巴细胞的方法。
全文摘要
本发明涉及引发介导免疫的T细胞的蛋白质或肽,还涉及癌症疫苗和用于抗癌治疗的组合物,所述组合物包含这类蛋白质或肽片段。本发明还涉及包含蛋白质或肽的药物组合物,以及产生能够在哺乳动物中识别并破坏肿瘤细胞的T淋巴细胞的方法。更具体地,提供了一种用于癌症的治疗或预防的方法中的端粒酶蛋白质或肽。在一个优选实施方案中,该方法包括产生针对端粒酶的T细胞反应。
文档编号A61P35/00GK1313773SQ99809954
公开日2001年9月19日 申请日期1999年6月30日 优先权日1998年7月8日
发明者G·高德奈克, J·A·艾里克森, M·莫勒, M·K·戈捷尔特森, I·赛特代尔, S·塞博-拉尔森 申请人:诺尔斯海德公司