癌抗原辅助肽的制作方法
【专利说明】
[0001 ]本申请是以下申请的分案申请：申请日：2010年4月22日；【申请号】 201080028991.4 ;发明名称：同上。
技术领域
[0002] 本发明涉及WT1辅助肽、编码所述肽的多核苷酸、由所述肽诱导的WT1特异性辅助 性T细胞、包含它们的用于治疗/预防癌症的药物组合物。本申请要求2009年4月23日申请的 日本专利申请号2009-105286的优先权，日本专利申请号2009-105286的公开内容通过引用 结合到本文中。
【背景技术】
[0003] WT1基因（维尔姆斯瘤(Wilms' tumor) 1基因）是一种被鉴定为儿童期肾癌维尔姆 斯瘤诱发基因的基因（非专利文献1和2)，并且是具有锌指结构的转录因子。WT1基因最初被 认为是癌症抑制基因。然而，随后的研究表明，上述基因更合适充当造血器官肿瘤和实体癌 的癌基因（非专利文献3_6)。
[0004] 由于WT1基因在许多恶性肿瘤中高表达，因此已经证实作为没有突变的自身蛋白 的WT1基因产物是否存在体内免疫原性。结果表明，来源于在肿瘤细胞中高表达的WT1基因 的蛋白质被胞内加工成片段，所得到的肽与展示在细胞表面上的MHC I类分子形成复合物， 通过WT1肽疫苗接种可诱导识别这类复合物的细胞毒性T细胞(下文亦称CTL)(非专利文献 7-9)。研究还表明，用WT1肽或WT1 cDNA免疫的小鼠以高比率排斥植入的表达WT1基因的肿 瘤细胞(非专利文献7和10)，但内源性表达WT1基因的正常组织不被诱导的CTL破坏(非专利 文献7)。在此之前，有研究强有力的表明，不仅仅在小鼠中而且还在人中可诱导WT1特异性 CTL，而且这类CTL具有针对高表达WT1基因的肿瘤细胞的细胞毒活性，但对于内源性表达 WT1基因的正常细胞没有细胞毒活性(非专利文献7和10-14)。
[0005] 另一方面，据报道，为了有效地诱导CTL，对癌抗原有特异性的辅助性T细胞的存在 十分重要(非专利文献15)。辅助性T细胞(CD4阳性T细胞)通过识别MHC II类分子与抗原呈 递细胞上的抗原肽的复合物被诱导、增殖和激活。活化的辅助性T细胞产生IL-2、IL-4、IL-5、IL-6或干扰素（IFN)等细胞因子并促进B细胞和其它T细胞亚群的增殖、分化和成熟。因 此，有研究认为，与MHC II类分子结合的抗原肽通过诱导辅助性T细胞，有效地激活CTL等， 并提高免疫功能（非专利文献16)。在此之前，有关WT1仅报道了与MHC II类分子的HLA-DRB1*0401和HLA-DRB1*0405结合的抗原肽(非专利文献17和专利文献1)，有必要寻找针对其 它亚型的抗原肽。
[0006] 现有技术文献 专利文献 专利文献1:国际公开号W0 2005/045027 非专利文献： 非专利文献l:Daniel A. Haber等，Cell. 1990年6月29日；61(7):1257-69。
[0007] 非专利文献2:Call KM等，Cell. 1990年2月9日；60(3): 509-20。
[0008] 非专利文献3:Menke AL等，Int Rev Cytol. 1998; 181: 151-212。综述。
[0009] 非专利文献4:Yamagami T等，Blood. 1996年4月1 日；87(7):2878-84。
[0010] 非专利文献5:Inoue K等，Blood. 1998年4月 15日；91(8):2969-76〇
[0011] 非专利文献6:TsuboiA等，LeukRes. 1999年5月；23(5):499-505。
[0012] 非专利文献7:0ka Y等，J Immunol. 2000年2月 15日；164(4): 1873-80。
[0013] 非专利文献8:Melief CJ等，Immunol Rev. 1995年6月；145:167-77。
[0014] 非专利文献9:Ritz J, J Clin Oncol. 1994年2月；12(2):237-8。
[0015] 非专利文献l〇:Tsuboi A等，J Clin Immunol. 2000年5月；20(3): 195-202。
[0016] 非专利文献ll:〇ka Y等，Immunogenetics. 2000年2月；51(2):99-107。
[0017] 非专利文献 12:0hminami Η等，Blood. 2000年 1月1 日；95(1): 286-93。
[0018] 非专利文献13:Gao L等，Blood. 2000年4月1 日；95(7): 2198-203。
[0019] 非专利文献14:0hminami Η等，Blood. 2000年1月1 日；95(1): 286-93。
[0020]非专利文献 15:Cancer. Res. 62: 6438，2002〇
[0021] 非专利文献 16:J. Immunol. Immunother. , 24: 195, 2001 〇
[0022] 非专利文献 17:Cancer. Immunol. Immunother. 51: 271, 2002〇
【发明内容】
[0023]发明要解决的技术问题 因此，本发明要达到的目的是提供通过与各种MHC II类分子结合而诱导WT1特异性辅 助性T细胞的肽、编码所述肽的多核苷酸、由所述肽诱导的WT1辅助性T细胞以及包含它们的 用于治疗/预防癌症的药物组合物。
[0024]解决技术问题的技术手段 本发明人进行了深入研究以达到上述目的。结果发现，具有编码WT1蛋白的连续氨基酸 序列的一部分的肽起癌抗原辅助肽的作用，换句话说，所述肽通过与MHC II类分子结合而 展示在抗原呈递细胞上，并且诱导WT1特异性辅助性T细胞，且显示该肽可用于治疗/预防癌 症的药物组合物。
[0025]因此，本发明提供： (1) 一种肽，其具有由来源于WT1蛋白的连续氨基酸组成的氨基酸序列，并通过与MHC II类分子结合诱导WT1特异性辅助性T细胞，其中氨基酸序列选自： (a) SEQ ID N0:3所述氨基酸序列； (b) SEQ ID N0:4所述氨基酸序列； (c) SEQ ID N0:5所述氨基酸序列；和 (d) -种氨基酸序列，其中(a)-(c)所述氨基酸序列中一个或几个氨基酸被取代、缺失 或添加； (2) (1)中的肽，其中氨基酸序列是SEQ ID N0:3所述氨基酸序列； (3) (1)或（2)中的肽，其中MHC II类分子选自DRB1*0101、DRB1*0405、DRB1*0802、DRB1* 0803^DRB1*090UDRB1*120UDRB1*1403^DRB1*150UDRB1*1502^DPB1*020UDPB1*0202^DPB1* 0402、DPB1*0501、DPB1*0901、DQB1*0301、DQB1*0302、DQB1*0401、DQB1*0501、DQB1*0601、DQB1* 0602和DRB5*0102; (4) (1)或（2)中的肽，其中MHC II类分子选自DRB1*0101、DRB1*0405、DRB1*1502、DPB1* 0201、DPB1*0202和 DQB1*0601; (5) 编码（1)-(4)中任一项的肽的多核苷酸； (6) 包含(5)中的多核苷酸的表达载体； (7) 抗(1) - (4)中任一项的肽或(5)的多核苷酸的抗体； (8) -种用于治疗或预防癌症的药物组合物，其包含（1)-(4)中任一项的肽、（5)中的 多核苷酸或(6)中的载体； (9) 一种用于治疗或预防癌症的方法，所述方法包括将有效量的（1)-(4)中任一项的 肽、（5)中的多核苷酸或(6)中的载体给予具有(3)或(4)中的MHC II类分子的受试者； (10) (1)-(4)中任一项的肽、（5)中的多核苷酸或(6)中的载体在治疗或预防癌症中的 用途； (11) 通过(3)或(4)中的MHC II类分子展示（1)-(4)中任一项的肽的抗原呈递细胞； (12) -种用于诱导抗原呈递细胞的方法，所述方法包括在（1)-(4)中任一项的肽的存 在下培养不成熟的抗原呈递细胞，并从不成熟的抗原呈递细胞中诱导通过(3)或(4)中的 MHC II类分子展示肽的抗原呈递细胞； (13) (1)-(4)中任一项的肽所诱导的WT1特异性辅助性T细胞； (14) 一种用于诱导WT1特异性辅助性T细胞的方法，所述方法包括在(1)-(4)中任一项 的肽的存在下培养外周血单核细胞，并从外周血单核细胞中诱导WT1特异性辅助性T细胞； (15) -种诱导WT1特异性辅助性T细胞的药盒，其包括(1)-(4)中任一项的肽作为必需 成分； (16) -种用于预防或治疗癌症的药盒，其包括(1)-(4)中任一项的肽、（5)中的多核苷 酸或(6)中的载体作为必需成分； (17) -种在具有(3)或(4)中的MHC II类分子的受试者中测定WT1特异性辅助性T细胞 的存在情况或量的方法，所述方法包括以下步骤： (a) 使（1)-(4)中任一项的肽与得自受试者的样品反应;然后 (b) 测定样品中所包含的细胞因子的存在情况或量。
[0026] 发明的有益效果 按照本发明，可获得与以下多种类型的MHC II类分子结合的WT1辅助肽：例如DRB1* 010UDRB1*0405^DRB1*0802^DRB1*0803^DRB1*090UDRB1*120UDRB1*1403^DRB1*150UDRB1* 1502、DPB1*0201、DPB1*0202、DPB1*0402、DPB1*0501、DPB1*0901、DQB1*0301、DQB1*0302、DQB1* 0401、DQB1*0501、DQB1*0601、DQB1*0602 和 DRB5*0102;还可获得一种包含所述 WT1 辅助肽的 用于治疗/预防癌症的药物组合物。因此，在各类受试者(具体地讲大多数日本人具有上述 分子）中体内和体外诱导WT1特异性辅助性T细胞是可能的。因为本发明诱导了 WT1特异性辅 助性T细胞，因此也可能在高表达WT1的癌中有效地激活T细胞和B细胞。
[0027] 附图简述 图1表示通过在用各种肽刺激各肽特异性T细胞系后测定细胞增殖得到的结果，所述细 胞系通过用3种肽(mWTl35、mWTl86和mWTl294)的每一种进行脉冲来制备。图中，符号表示 无肽刺激。
[0028] 图2表示通过在抗MHC I类或II类抗体存在下用各种相应肽刺激各肽特异性T细胞 系后测定细胞增殖得到的结果，所述细胞系通过用3种肽(mWTl 35、mWTl86和mWTl294)进行脉 冲制备。图中，符号表示无肽刺激。纵坐标中的符号"cpm"表示每分钟计数。
[0029] 图3表示通过测定各WT1肽特异性T细胞系响应以下细胞进行的细胞增殖而得到的 结果：C1498细胞、用3种肽(mWTl 35、mWTl86和mWTl294)进行脉冲的C1498细胞以及强制表达 WT1蛋白的C1498细胞。纵坐标中的符号"cpm"表示每分钟计数。
[0030] 图4表示通过在用3种肽(mWTl35、mWTl86和mWTl294)进行脉冲制备的各肽特异性T细 胞系中测定产IFN-γ能力得到的结果。
[0031] 图5表示通过测定3种肽(mWTl35、mWTl86和mWTl294)的CTL细胞毒活性而得到的结 果。?表示使用用WT1126肽(MHC I类限制性肽)进行脉冲的RMAS细胞进行实验的结果。?表 示使用对照RMAS细胞进行实验的结果。
[0032] 图6表示在肿瘤植入实验中进行肿瘤植入和免疫的时间序列的示意图。在给小鼠 皮下植入表达WT1的白血病细胞后第7、14和21天用mWTl 35辅助肽进行免疫，以及在第29天进 行解剖。向下的白色箭头表示皮内给予对照(PBS) (IFA/30 μL)的时间点。向下的黑色箭头 表示皮内给予mWTl35辅助肽(50 yM/IFA/30 μL)的时间点。
[0033] 图7表示用m W Τ13 5辅助肽免疫的小鼠中的肿瘤大小和无病小鼠群的比例。在用 mWTl35辅助肽免疫的小鼠中，10只小鼠中有4只无病。另一方面，在用对照免疫的小鼠中，9只 小鼠中不存在无病小鼠。
[0034]图8表示在用mWTl35辅助肽免疫的小鼠中的无病存活率。
[0035]图9表示CTL在用mWTl35辅助肽免疫的小鼠中的细胞毒活性。籲表示使用用mWTl126 肽(MHC I肽)进行脉冲的RMAS细胞进行实验的结果。?表示使用对照RMAS细胞进行实验的 结果。圆括号内的数字表示肿瘤大小(mm)。
[0036]图