T细胞的作用，通过对由植入肿瘤细胞表达的WT1蛋白的免疫应答诱导的 WT1特异性细胞毒性T细胞在体内强烈地放大。因此，结果表明了 WT135辅助肽的有用性。
[0104] 接下来，在上述WT135辅助肽(MHC II类)免疫组和对照组的小鼠中，分析特异性细 胞溶解。简单地说，将靶细胞是RMAS细胞时的细胞溶解率（％)从靶细胞是上述实验中用 WT1126肽(MHC I类)进行脉冲的RMAS细胞时的细胞溶解率(％)中减去而得到的细胞溶解程度 (%)用作特异性细胞溶解(％)(图11，左）。同样，将上述制备的脾细胞和荧光标记的WT1四聚 体(H-2Db WT1四聚体-RFMPNAPYL-PE)于4°C温育20分钟，洗涤，然后用荧光标记的CD3和CD8 抗体染色，再次洗涤，并通过FACS进行分析。CD3阳性、CD8阳性和WT1四聚体阳性细胞充当 WT1特异性细胞毒性T细胞（图11，右）。结果，与对照组小鼠的脾细胞相比，在WT135辅助肽 (MHC II类)免疫组的小鼠脾细胞中诱导显著高的WT1特异性细胞毒性T细胞(p〈0.05)(图 11)〇
[0105] 实施例4 人的m特异性细胞毒性τ细胞(ctl)的增殖能力的测定 从6名具有图12所示DRB1、DPB1、DQB1或DRB5亚类分子的健康受试者中制备外周血单核 细胞。向外周血单核细胞中加入WT135辅助肽，并将细胞培养一周。然后，对这些外周血单核 细胞，使用用WT1 35辅助肽进行脉冲和照射的得自同一受试者的外周血单核细胞作为刺激 物，以一周的间隔进行刺激共4次，在第6天测定 3H掺入。在所有6名健康受试者中，外周血单 核细胞对WT135辅助肽所出应答并增殖（图12)。这就表明WT1 35辅助肽具有与所提及的HLA II类分子结合并引起增殖反应的功能。就此而论，对于在方框包围位置上的一个氨基酸，小 鼠 WT186肽和WT1294肽不同于人WT186肽（SEQ ID N0:4)和WT1294肽（SEQ ID N0:5)，如表8所 不。
[0106] [表 8] 小鼠和人WT135、WT186和WT1294肽之间的序列的差异
[0107] 实施例5 WT135肽的HLA II类分子限制性 为了测定WT135肽的HLA II类分子限制性，通过下面简述的本领域技术人员熟知的方 法进行进一步实验。首先，对得自健康受试者[DRBl*0101/0405、DPBl*0201/0402和DQB1* 0401/0501阳性健康受试者（下文称为健康受试者A)]的外周血单核细胞(PBMC)，用WT1 35肽 刺激5次以制备应答物。接下来，对得自HLA II类类型不同的另一名健康受试者[DRBf 0405/0901、DPBl*0201/0501和DQB1*0303/0401阳性健康受试者（称为健康受试者B)]的外周 血单核细胞(PBMC)，用訂1 35肽进行脉冲以制备刺激物，并测定细胞增殖[所掺入的3H-胸苷 的量(cpm)]。在未加入抗体、加入抗HLA-DR抗体(+a-DR)、加入抗HLA-DP抗体(+a-DP)或加入 抗HLA-DQ抗体(+a-DQ)的条件下进行了测定。对应答物和刺激物两者呈阳性的共同HLA II 类类型显示WT135肽的限制性。实验结果表明，WT135肽是DRB1*0405限制性的，因为在加入抗 DR抗体的条件下增殖被抑制，而且DRB1*0405是健康受试者A和B中共同的，如图13所示。
[0108] 接下来，除了使用从不同于健康受试者A的健康受试者[DRB1*0405/0803、DPB1* 0202/0501和DQB1*0401/0601阳性健康受试者(称为健康受试者G)]中得到的PBMC为刺激物 以外，在与上述实验相同的条件下进行了实验。结果表明，WT1 35肽是DRB1*0405、DPB1*0201 和DPB1$0202限制性的，因为在加入抗HLA-DR抗体或抗HLA-DP抗体的条件下增殖受抑制，而 且DRB1*0405、DPB1*0201和DPB1*0202在健康受试者A和健康受试者G中是共同的（DPB1*0201 和DPB1M202具有高相似性，并是交叉反应性的，因此，它们被认为是共同的分子），如图14 所示。
[0109] 接下来，除了使用从不同于健康受试者A的健康受试者[DRB1*0101/0803、DPB1* 0501/-、DQB1*0501/0601阳性(称为健康受试者Η)]得到的PBMC作为刺激物以外，在与上述 实验相同的条件下进行实验。结果表明，WT1 35肽是DRBP0101限制性的，因为在加入抗HLA-DR抗体的条件下增殖被抑制，而且DRBP0101在健康受试者A和健康受试者Η中是共同的，如 图15所示。
[0110] 此外，为了测定WT135肽的限制性，将得自健康受试者G的PBMC用作应答物，导入 DQB1*0601基因的L细胞用作刺激物。测定了在用L细胞的WT135肽进行的脉冲存在或不存在 时产生的IFN-γ的量的差异。采用作为本领域技术人员熟知技术的FACS，测定了胞内IFN-γ产生的比例。结果表明，WT1 35肽是DQB1*0601限制性的，因为通过用WT135肽对L细胞进行脉 冲激活了应答物，如图16所示。
[0111] 接下来，使用得自相同健康受试者的PBMC作为应答物和刺激物如上所述进行了实 验。将用于本实验的健康受试者所具有的HLA II类分子类型概括于下表9中。
[0112] [表 9] 用于本实验的健康受试者所具有的HLA II类分子的类型
[0113] 结果发现，当使用得自健康受试者A-E的PBMC进行实验时，加入抗DR抗体或抗DP抗 体，导致所掺入的3H-胸苷的量(cpm)降低，因此导致抑制增殖。同样，当使用得自健康受试 者F的PBMC时，加入仅抗DR抗体导致增殖受抑制。此外，当使用得自健康受试者G的PBMC时， 加入仅抗HLA-DP抗体导致增殖受抑制。使用健康受试者A的实验表明，WT1 35肽是DRB1*0101 或0405限制性的，并是DPB1*0201或0402限制性的。使用健康受试者B的实验表明，WT1 35肽是 DRB1*0405或0901限制性的，以及是DPB1*0201或0501限制性的。健康受试者C的实验表明， WT135肽是DRB1*0802或1201限制性的，并且是DPB1*0201或0501限制性的。使用健康受试者D 的实验表明，WT135肽是DRB1*1502限制性的，因为DRB1*1502是纯合子（图17)。另外表明WT1 35 肽是DPB1*0201或0901限制性的。使用健康受试者E的实验表明，WT135肽是DRB1*0405或0901 限制性的，并且是DPBP0202或0501限制性的。使用健康受试者F的实验表明，WT1 35肽是 DRB1*1403或1502限制性的。使用健康受试者G的实验表明，WT135肽是DPB1*0202或0501限制 性的。
[0114] 同样，使用得自健康受试者I的PBMC作为应答物和刺激物，测定了在用WT135肽进行 的脉冲存在或不存在时所产生的IFN-γ的量的差异。采用作为本领域技术人员熟知技术的 FACS，测定了胞内IFN- γ产生的比例。结果，通过WT135肽进行脉冲，IFN- γ的量的比例显著 提高（图 18)。这表明 WT135 肽受以下任一种的限制：DRB1*0101、DRB1*1501、DPB1*0201、DPB1* 0402、DQB1*0501 和 DQB1*0602。
[0115] 工业实用性 本发明提供受许多类型的MHC II类分子限制的WT1肽、编码所述肽的多核苷酸、含有它 们的药物组合物等。因此，可将其用于药物领域，例如用于各种高表达WT1基因的造血器官 肿瘤和实体肿瘤的预防性或治疗性药物的开发和制备领域。
【主权项】
1. 一种肽，其具有由来源于WT1蛋白的连续氨基酸组成的氨基酸序列并且通过与MHC II类分子结合诱导WT1特异性辅助性T细胞，其中所述氨基酸序列选自： (a) SEQ ID NO:3所述氨基酸序列； (b) SEQ ID NO:4所述氨基酸序列； (c) SEQ ID NO:5所述氨基酸序列；和 (d) 其中在(a)-(c)所述氨基酸序列中一个或几个氨基酸被取代、缺失或添加的氨基 酸序列。2. 权利要求1的肽，其中所述氨基酸序列是SEQ ID N0:4所述氨基酸序列。3. 权利要求1的肽，其中所述氨基酸序列是SEQ ID N0:5所述氨基酸序列。4. 权利要求1-3中任一项的肽，其中所述MHC II类分子选自DRB1*0101、DRB1*0405、 DRB1*0802^DRB1*0803^DRB1*090UDRB1*120UDRB1*1403^DRB1*150UDRB1*1502^DPB1*020U DPB1*0202、DPB1*0402、DPB1*0501、DPB1*0901、DQB1*0301、DQB1*0302、DQB1*0401、DQB1*0501、 DQB1*0601、DQB1*0602 和 DRB5*0102。5. 权利要求1-3中任一项的肽，其中所述MHC II类分子选自DRB1*0101、DRB1*0405、 01^1*1502、0?81*0201、0卩81*0202和0〇81*0601。6. -种编码权利要求1 - 5中任一项的肽的多核苷酸。7. -种包含权利要求6的多核苷酸的表达载体。8. -种抗体，其为针对权利要求1-5中任一项的肽或权利要求6的多核苷酸的抗体。9. 权利要求8的抗体，其中所述肽具有选自以下的氨基酸序列： (a) SEQ ID NO:3所述氨基酸序列；和 (b) 其中在(a)所述氨基酸序列中一个或几个氨基酸被取代、缺失或添加的氨基酸序 列。10. -种用于治疗或预防癌症的药物组合物，其包含权利要求1-5中任一项的肽、权利 要求6的多核苷酸或权利要求7的载体。11. 权利要求1-5中任一项的肽、权利要求6的多核苷酸或权利要求7的载体在制备用于 治疗或预防癌症的药物中的用途。12. 权利要求11的用途，其中所述药物用于治疗或预防具有权利要求4或5的MHC II类 分子的患者的癌症。13. -种抗原呈递细胞，其为通过权利要求4或5的MHC II类分子展示权利要求1-5中任 一项的肽的抗原呈递细胞。14. 一种用于诱导抗原呈递细胞的方法，所述方法包括在权利要求1-5中任一项的肽存 在下培养不成熟的抗原呈递细胞，并且由所述不成熟的抗原呈递细胞诱导通过权利要求4 或5的MHC II类分子展示所述肽的抗原呈递细胞。15. -种WT1特异性辅助性T细胞，其为由权利要求1-5中任一项的肽诱导的WT1特异性 辅助性T细胞。16. -种用于诱导WT1特异性辅助性T细胞的方法，所述方法包括在权利要求1-5中任一 项的肽存在下培养外周血单核细胞，并且由所述外周血单核细胞诱导WT1特异性辅助性T细 胞。17. -种诱导WT1特异性辅助性T细胞的药盒，其包含权利要求1-5中任一项的肽作为必 需成分。18. -种用于预防或治疗癌症的药盒，其包含权利要求1-5中任一项的肽、权利要求6的 多核苷酸或权利要求7的载体作为必需成分。19. 一种用于测定具有权利要求4或5的MHC II类分子的患者的WT1特异性辅助性T细胞 的存在情况或量的方法，所述方法包括以下步骤： (a) 使权利要求1-5中任一项的肽与得自患者的样品反应;然后 (b) 测定所述样品中包含的细胞因子的存在情况或量。20. 权利要求19所述的方法，其中所述肽具有选自以下的氨基酸序列： (a) SEQ ID NO:3所述氨基酸序列；和 (b) 其中在(a)所述氨基酸序列中一个或几个氨基酸被取代、缺失或添加的氨基酸序 列。
【专利摘要】本发明涉及WT1肽和包含WT1肽的药物组合物等，所述WT1肽具有由来源于WT1蛋白的连续氨基酸组成的氨基酸序列，并通过与MHC？II类分子结合而诱导WT1特异性辅助性T细胞。
【IPC分类】A61K48/00, C12N5/0781, G01N33/68, C12N5/0786, A61P35/00, C07K16/32, C07K14/82, C12N5/0784, C12N5/0783, A61K38/10, C12N15/12
【公开号】CN105622749
【申请号】CN201610024502
【发明人】杉山治夫
【申请人】株式会社癌免疫研究所
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2010年4月22日
【公告号】CA2757764A1, CN102803487A, CN102803487B, EP2423310A1, EP2423310A4, EP2423310B1, US9266932, US20120045465, US20160176939, WO2010123065A1