桑树铵转运蛋白MmAMT2及其应用
【技术领域】
[0001 ]本发明属于植物基因工程领域，涉及到一种桑树铵转运蛋白MmAMT. 2基因克隆和 其在不同氮素条件下的表达应用。
【背景技术】
[0002] 在作物所有必需营养元素中，氮素是作物从土壤中吸收量最多的元素，是限制植 物生长和形成产量的首要因素。土壤中植物所利用的主要氮素形式是铵态氮(nh 4+)和硝态 氮(NOf)。氮素利用效率低的现象在农作物生长过程中普遍存在，引发氮肥的大量施用，造 成巨大的环境影响，需从深入研究植物氮素吸收机制，才能从分子生物学途径改良植物品 种，提尚氣素吸收效率。
[0003] 桑树是喜铵植物，研究表明，在铵态氮和硝态氮同时存在的情况下，植物对铵态氮 表现出明显的偏好性。目前，国内外对拟南芥、水稻等植物的铵转运蛋白（ammonium transporters，AMT)基因进行表达分析和功能研究的比较多，而在桑树这方面研究甚少。 AMT位于细胞膜上，通过与与其偶联的H+-ATPase所提供的细胞质膜内外化学渗透梯度来介 导植物对铵态氮的吸收以及体内运转。植物铵转运蛋白家族可分为两大类:AMT1和AMT2。根 据吸收动力学分析，铵转运蛋白又可分为高亲和体系（high affinity transporter system,HATs)和低亲和体系（low affinity transporter system，LATs)。其中被集中报道 研究的AMT1大都属于HTTs，但随着研究的深入，AMT2家族的意义愈发重要。AMT1和AMT2成员 之间可能存在功能上的相互重叠、重复或互补。目前已经在水稻、番茄、百脉根、甘蓝型油菜 等多种植物中分离鉴定了铵转运蛋白，其中以水稻中鉴定出的具有铵转运功能的AMT种类 最多、达12种。其中4种AMT基因属于AMT 1，剩下的8种属于AMT2。各植物中AMT 1与AMT2所占比 例不一。AMT位于细胞膜上，植物对铵的吸收和铵在细胞间的转运是AMT介导的需能主动运 输过程。
[0004] 在氮素缺乏环境中，植物增强特定铵转运蛋白基因的表达，是植物适应氮素胁迫 环境的重要内在机制之一。硝态氮也是影响铵转运蛋白基因表达因素之一。研究表明， AtAMTl. 1表达随环境中硝态氮的浓度变化作快速反馈调节，当土壤中硝态氮含量严重缺乏 时，AtAMTl. 1的表达明显增加。植物体内AMT之间的表达也能相互影响，某一AMT功能缺失 后，植物通过调节其它某些铵转运蛋白基因的表达来弥补蛋白功能缺失后对植物造成的不 利影响。
[0005] 不同氮素条件下，AMT基因的转录水平均有变化。同种氮源不同浓度，同种浓度不 同氮源，对植物生长与发育都有一定影响。研究发现在缺氮条件下，植物体内AMT基因的表 达有不同程度的增加，缓解缺氮对植物的影响，维持正常的生长。
[0006] 我国是桑树的起源中心，种质资源极为丰富。经过桑树种质资源及育种工作者几 十年的努力，现在全国已收集保存有近3000份桑树种质资源，其中不少资源都具有果用价 值、药用价值、经济价值等。
【发明内容】
[0007] 解决的技术问题:本发明提供一种桑树铵转运蛋白MmAMT. 2及其应用，可以用于桑 树中的铵转运蛋白基因在不同氮素条件下的表达调控。
[0008] 技术方案:桑树铵转运蛋白MmAMT.2,序列如SEQ ID N0.2所示。
[0009] 编码桑树铵转运蛋白MmAMT.2的基因，序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0010] 上述桑树铵转运蛋白MmAMT. 2在不同氮素条件中的应用。
[0011]所述不同氮素条件为200μΜ KN〇3、2m M KN〇3、20m Μ KN〇3处理、100yM(NH4)2S〇4、lm M(NH4)2S〇4、10m M(NH4)2S〇4处理、20m M KN〇3处理、10m M(NH4)2S〇4处理和 10m Μ NH4NO3处 理。
[0012] 所述植物为桑树(Morus multicaul is)。
[0013] 上述编码桑树铵转运蛋白MmAMT. 2的基因在作为植物不同氮素条件表达标志物中 的应用。
[0014] 有益效果:氮素是植物生长与发育过程中的重要营养元素之一。植物从土壤中所 吸收的主要氮素形式是铵态氮和硝态氮。植物体内氮代谢以铵态氮为主，铵态氮可被吸收 后直接，转变成氨基酸，进而合成蛋白质，维持植物正常生命活动。在植物的生长过程中，为 了适应铵离子浓度变化大的机制，植物发展形成了铵转运蛋白家族。该蛋白家族又分为两 大类:AMT1和AMT2。在缺氮情况下，AMT基因的表达呈不同程度增加，相互协作，共同维持植 物机体氮代谢的正常运行。研究发现，在不同氮素条件下，植物体内的AMT基因表达变化也 较为明显。本发明所述桑树铵转运蛋白MmAMT. 2,完善桑树基因组同时提供了桑树铵转运蛋 白在不同氮素条件的表达分析和应用，可以用于桑树中的铵转运蛋白基因在不同氮素条件 下的表达调控。
【附图说明】
[0015] 图1为桑树铵转运蛋白馳411\2基因的？0財广增结果图：1.200(^?0财分子标记 1.RT-PCR 产物；
[0016] 图2为桑树铵转运蛋白馳411\2基因的？0財广增结果图：1.200(^?0财分子标记； 1PCR扩增产物；
[0017] 图3为桑树铵转运蛋白MmAMT.2基因的3'-RACE扩增结果图：M.2000bpDNA分子标 记1.RT-PCR产物；
[0018] 图4为桑树铵转运蛋白MmAMT. 2基因推导的氨基酸序列保守区预测软件截图；
[0019] 图5为定量RT-PCR检测MmAM 2基因在200μΜ KN〇3处理下桑苗嫩叶中的相对表达量 图；对照，处理6小时，处理12小时，处理1天，处理2天，处理3天;每组数据左侧为200μΜ KN〇3 实验处理结果，右侧为对照组；
[0020] 图6为定量RT-PCR检测MmAMT. 2基因在2m M KN〇3处理下桑苗嫩叶中的相对表达量 图；对照，处理6小时，处理12小时，处理1天，处理2天，处理3天;每组数据左侧为2m Μ KN〇3 实验处理结果，右侧为对照组；
[0021] 图7为定量RT-PCR检测MmAMT. 2基因在20m M KN〇3处理下桑苗嫩叶中的相对表达 量图；对照，处理6小时，处理12小时，处理1天，处理2天，处理3天；每组数据左侧为20m Μ KN〇3实验处理结果，右侧为对照组；
[0022] 图8为定量RT-PCR检测MmAMT.2基因在100yM(NH4)2S〇4处理下桑苗嫩叶中的相对表 达量图；对照，处理6小时，处理12小时，处理1天，处理2天，处理3天;每组数据左侧为100μΜ (NH4)2S04实验处理结果，右侧为对照组；
[0023] 图9为定量RT-PCR检测MmAM胶-2基因在lm M(NH4)2S〇4处理下桑苗嫩叶中的相对表 达量图；对照，处理6小时，处理12小时，处理1天，处理2天，处理3天;每组数据左侧为lm Μ (NH4)2S04实验处理结果，右侧为对照组；
[0024] 图10为定量RT-PCR检测MmAMT.2基因在10m M(NH4)2S〇4处理下桑苗嫩叶中的相对 表达量图；对照，处理6小时，处理12小时，处理1天，处理2天，处理3天;每组数据左侧为10m M(NH4) 2S〇4实验处理结果，右侧为对照组；
[0025] 图 11 为定量RT-PCR检测MmAMT.2基因在20m Μ KN〇3处理、10m M(NH4)2S〇4处理和 10m Μ NH4NO3处理下桑苗嫩叶中的相对表达量图；10m M(NH4)2S〇4处理4天、20m M KN〇3处理 4天和10m M NH4N〇3处理4天;每组数据左侧各为实验处理结果，右侧为各自的对照组。
【具体实施方式】
[0026] 实施例1桑树铵转运蛋白MmAMT.2基因的克隆
[0027] 供试桑树品种为鲁桑品种(Morus multicaulis)育71-1苗，保存于中国农业科学 院蚕业研究所国家种质镇江桑树圃。利用已获得的包含桑树铵转运蛋白MmAMT.2基因 cDNA 片段的ESTs序列，设计引物，并加以验证，引物序列如下：
[0028] MmAMT·2-F:5 '-CCTTGTGATCCTCTACGC-3 '；
[0029] MmAMT·2-R:5，-GACAAAAGCCATCCAAGC-3，；
[0030] MmAMT.2-S:5'-ATGGCGCTCCCAGAGGCC-3'；
[0031] MmAMT·2-A:5，-ACGGCGGCGAAGGCATAGAG-3，；
[0032]根据已克隆并验证的基因中间片段结果，设计3'RACE扩增所需目的基因的上游特 异性引物，引物序列如下：
[0033] GSP1:5，-GCCAGAACTTCCTCATCAACC-3，；
[0034] GSP2:5，-TGGCGACGCTGGTCTACT-3，；
[0035] 3'RACE的通用引物为：
[0036] 3，外侧：5，-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3，；
[0037] 3，接头：5，-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTGTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3，；
[0038] 根据已获得的基因全长序列设计进行荧光定量分析的引物，引物序列如下：
[0039] qMmAMT·2-F:5，-CGGTCAACTCGGCCTTCA-3，；
[0040] qMmAMT·2-R:5 '-AAACGGCACGGTCTCCCT-3