荠菜Ca²⁺/H⁺反向转运蛋白基因及其在改良植物抗寒性中的应用

荠菜Ca²⁺/H⁺反向转运蛋白基因及其在改良植物抗寒性中的应用
【专利摘要】本发明属于植物生物技术领域，具体为一种荠菜Ca2+/H+反向转运蛋白基因及其在改良植物抗寒性中的应用。该基因的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示，Ca2+/H+反向转运蛋白基因是具有SEQ ID No:1中碱基第34?3105位碱基的核酸序列，该核苷酸序列编码一个受低温诱导表达，在正常温度下不表达或低表达，表达后能做为信号分子调控逆境基因表达，促进细胞产生抗冷力的基因。利用该基因片段构建的过表达载体可以在植物受到低温胁迫时调控抗冷基因表达，保护植物细胞免受低温伤害。本发明还提供了基于上述基因培育抗寒植物的应用方法，用于有经济价值农作物的品种改良。
【专利说明】
莽菜Ca2+/H+反向转运蛋白基因及其在改良植物抗寒性中的 应用
技术领域
[0001] 本发明属于分子生物学、植物生物技术领域，具体设及一种莽菜Ca2vr反向转运 蛋白基因、及其制备方法，还设及包括该基因的重组质粒的应用，将其应用于植物逆境基因 特别是用于植物抗寒基因的遗传转化，达到提高植物抗寒性的目的。
【背景技术】
[0002] 溫度是很非常重要的环境因子，是植物生长发育、地域分布的主要影响因子。冷 害、冻害会直接影响农作物的产量及分布面积，因此提高农作物抗寒、抗冷能力是农作物稳 产增产的有效方式。由于植物的固着性，生长在寒冷地区的植物为了适应低溫环境，必须形 成一套感知和传导信号的通路，并且产生一系列的变化W确保细胞不受低溫损害。许多研 究证实，植物耐寒能力的获得是植物在分子水平上对逆境产生迅速应答、转导逆境信号，调 控应答和抵御基因表达综合作用的结果。近年来随着基因分离技术的不断发展，从多个物 种中发现了多种冷调节相关基因，如调节植物细胞膜脂相变的甘油-3-憐酸酷基转移酶 (GPAT)基因，调节植物细胞内活性氧(R0S)的各种抗氧化酶基因 W及一些低溫调节蛋白和 转录因子，运些基因的植物转化均在一定程度上提高了植物的抗寒力。低溫逆境信号传导 系统是一个复杂的调控网络，由此产生的植物的抗寒力是由多基因控制的性状，运往往需 要一系列相关基因的共同表达才能表现出较高的抗寒性（Xin Z, Browse J. Cold comfort farm: acclimation of plants to freezing temperatures. Plant, Cell and 化viro皿ent, 2000, 23:893-902)。因此从抗寒的植物中挖掘新的低溫诱导基因，有助于 拓宽抗寒基因的来源，也可为利用生物技术培育抗寒新品种奠定基础。
[0003] 植物在遇到低溫信号后，首先由细胞膜上的低溫信号受体识别，然后通过信号中 间传递体传递信号，进一步调控下游转录因子和低溫应答基因的表达，从而提高植物对低 溫胁迫的耐受能力。巧离子做为信号传递过程中的第二信使，在低溫应答网络中起中间传 递体的作用。低溫发生时植物会通过细胞质中巧离子浓度直接或间接的变化对运种溫度刺 激作出反应。如果阻断巧离子向细胞质的流动时，即使对植物进行冷驯化处理也不会增加 冷诱导基因的表达，也不能提高植物的冷耐受能力（Monroy AF,Sa;rhan F,化indsa RS. Cold-induced ch曰nges in freezing tolerance, protein phosphoryl曰tion,曰nd gene expression. Plant F*hysiol. 1993, 102:1227-1235)。同样，常溫下提高未经过冷驯化的 植物细胞内的巧离子向细胞质的流动，则能够诱导冷诱导特异基因的表达量大幅上调 (Monroy AF, Dhindsa RS. Low temperature signal transduction: induction of cold acclimation-specific genes of Alfalfa by calcium at 25° C. The Plant Cell. 1995, 7:321-331)。说明巧离子流动是低溫信号传递途径中一个重要环节，是引发植 物抗寒锻炼，抗寒基因表达和抗寒力提高所必需的的因素。Ca2VH+反向转运蛋白是维持植 物体内的巧离子平衡的重要因子。拟南芥中化2vr反向转运蛋白的研究显示，该基因的表 达受冷诱导的调控，从而调节细胞质中巧离子的浓度，巧离子浓度的改变又激活了转录因 子CBF基因的表达，而CBF则激活植物抗冻途径基因，如COR基因的表达，从而提高植物的耐 寒性（Catala R, Santos E, Alonso JM, Ecker JR, Martinez-Zapater JM, Salinas J. Mutations in the Ca^^/H^ transporter CAXl increase CBF/DREBl expression and the cold-acclimation response in Arabidopsis. Plant Cell. 2003, 15(12):2940- 2951)。
[0004] 莽菜（C a jO s e 7 7 a 6 ursa-pastoris)是一种1或2年野生的草本植物，平铺地 面，喜阴，在南方是处处可见的一种可食用的蔬菜，属于十字花科（Cruciferae)、莽菜属 (化psella)，在较低溫度条件下能够正常生长发育并结实。本发明所设及的莽菜化27H+反 向转运蛋白基因是从莽菜叶片的基因组中克隆得到的。目前尚未发现有关莽菜化27H+反向 转运蛋白的研究和利用该基因培育耐寒植物的相关报道。

【发明内容】

[0005] 本发明的第一目的就是提供一种新的莽菜化27h+反向转运蛋白基因，该基因是从 莽菜的基因组中克隆得到的，是植物在冷诱导和冷驯化下产生的高表达蛋白质。
[0006] 本发明的第二目的是提供一种新的莽菜化27h+反向转运蛋白。
[0007] 本发明的第Ξ目的是提供所述莽菜化2vr反向转运蛋白及其基因在利用转基因 技术改良植物抗逆(耐低溫)上的应用。
[0008] 本发明的一个方面，提供一种从莽菜中分离的具有低溫诱导表达特性的莽菜化27 H+反向转运蛋白基因，所述莽菜化27h+反向转运蛋白基因选自W下之一： (1) 其核巧酸序列如SEQ ID No. 1中第34-3105位碱基所示； (2) 其核巧酸序列与沈Q ID No. 1中从核巧酸第34-292;641-708;1292-1319;1424- 1619; 1785-2009; 2099-2228; 2322-2438; 2538-2709; 2822-2916; 3017-3105位 DNA 分子的核 巧酸序列有至少70%同源性、且编码相同功能蛋白质;或者 (3) 其核巧酸序列在中度严紧条件下与SEQ ID No. 1中从核巧酸第34-3105位的核巧酸 序列杂交、且编码相同功能蛋白质。
[0009] 本发明的另一方面，还提供一种重组质粒，其包含上述莽菜化2vr反向转运蛋白 基因。
[0010] 本发明的另一方面，还提供一种莽菜Ca27H+反向转运蛋白，所述莽菜Ca27H+反向 转运蛋白选自W下之一： (1) 其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示;或者 (2) 具有SEQ ID No.2氨基酸序列之多肤的保守性变异多肤、或其活性片段，或其活性 衍生物。
[ocm]本发明的另一方面，还提供用于制备上述莽菜Ca27H+反向转运蛋白基因的方法， 所述方法包括W下步骤： (1) 将莽菜种子经过70%酒精消毒后，播种于MS培养基上； (2) 待所述莽菜种子长出叶片后，提取所述叶片的基因组DNA，用1%琼脂糖凝胶电泳分 析其质量；W及 (3) 采用基因克隆技术，利用上游引物和下游引物得到所述莽菜Ca27H+反向转运蛋白 基因；所述上游引物为。饥〔4乂:5-4了66口'66441'〔6了44〔4644〇：6-3(记为沈0 10齡.3)，所述 下游引物为RCbCAX:5-TTAAGTTGAAGAAGCTCCTCCT-3(记为沈Q ID No.4)。
[0012]本发明的另一方面，还提供用于制备上述重组质粒的方法，所述方法包括W下步 骤： (1) 设计引物对，扩增出上述莽菜化27H+反向转运蛋白基因的完整DNA片段，所述引物 对的上游引物为FCAX: 5-ATGGCTGGAATCGTAACAGAACCG-3(SEQ ID No. 3)，所述引物对的下游 引物为RCAX: 5-TTAAGTTGAAGAAGCTCCTCCT-3(SEQ ID No. 4) ; W及 (2) 将所述完整DM片段克隆到中间载体PMD19-T，再进一步克隆到植物表达载体pl304 上，得到上述重组质粒。
[OOU]在步骤（1)中，向所述上游引物引入限制性酶切位点WcoI，W及向所述下游引物 引入限制性酶切位点公S t怎II。
[0014]本发明的另一方面，还提供上述莽菜化2vr反向转运蛋白基因或上述重组质粒在 植物抗寒性和耐寒性中的应用。较佳地，所述植物为具有经济价值的作物，更佳地包括水 稻、小麦、玉米、棉花、油菜、番茄和黄瓜。
[001引上述应用中，包括将所述重组质粒转入根癌农杆菌 ? ume/ a ciefts)EHA105中，然后用于转化目的植物，提高植物对寒冷的耐受性。
[0016] 上述应用中，包括利用转基因技术将编码具有莽菜化27H+反向转运蛋白活性多肤 的核巧酸序列转化入植物，W提高植物对寒冷的耐受性，其步骤如下： (1) 将编码具有莽菜化27H+反向转运蛋白活性多肤的纯化的核巧酸序列可操作地连于 植物表达调控序列后，形成含莽菜化27H+反向转运蛋白基因的植物表达载体，所述的核巧 酸序列与SEQ ID No. 1中从核巧酸第34-3105位的核巧酸序列有至少70%的同源性； (2) 将步骤(1)中的表达载体转入农杆菌，将含表达载体的农杆菌同真核宿主细胞共培 养，在22-28Γ条件下，暗培养l-2d后，通过筛选如抗生素筛选，获得含有莽菜化27H+反向 转运蛋白基因的转化细胞并最终再生转基因植株及其后代，包括植物种子及植物组织。含 有莽菜化27H+反向转运蛋白基因的转基因植株对植物寒冷耐受特性具有增强的作用。
[0017] 较佳地，在该方法中使用的核巧酸序列为SEQ ID No. 1中第34-3105位的序列。
[0018] 本发明的另一方面，还提供一种用上述重组质粒转化的宿主细胞。在实例中该宿 主细胞是拟南芥、烟草和其它植物细胞等。
[0019] 在本发明的另一方面中，还提供了一种产生具有莽菜化27H+反向转运蛋白活性的 多肤的方法，其步骤如下： (1) 将编码具有莽菜化27h+反向转运蛋白活性多肤的纯化的核巧酸序列可操作地连于 表达调控序列，形成莽菜化27H+反向转运蛋白表达载体，所述的核巧酸序列与SEQ ID No. 1 中从核巧酸第34-3105位的核巧酸序列有至少70%的同源性； (2) 将步骤(1)中的表达载体转入原核宿主细胞，形成莽菜化27H+反向转运蛋白的重组 细胞； (3) 在适合表达莽菜化27H+反向转运蛋白多肤的条件下，培养步骤(2)中的重组细胞； (4) 分离出具有莽菜化27H+反向转运蛋白活性的基本纯的多肤。
[0020] 较佳地，在该方法中使用的核巧酸序列为SEQ ID No. 1中34-3105位的序列。
[0021] 本发明的另一方面，还提供一种利用转基因技术将编码具有莽菜化27H+反向转运 蛋白活性多肤的核巧酸序列转化入植物W提高植物对寒冷的耐受性的方法，其步骤如下： (1) 将编码具有莽菜化27h+反向转运蛋白活性多肤的纯化的核巧酸序列可操作地连于 植物表达调控序列后，形成含莽菜化27h+反向转运蛋白基因的植物表达载体，所述的核巧 酸序列与SEQ ID No. 1中从核巧酸第34-3105位的核巧酸序列有至少70%的同源性； (2) 将步骤(1)中的表达载体转入农杆菌，将含表达载体的农杆菌同真核宿主细胞共培 养，在22-28Γ条件下，暗培养l-2d后，通过筛选如抗生素筛选，获得含有莽菜化27H+反向 转运蛋白基因的转化细胞并最终再生转基因植株及其后代，包括植物种子及植物组织。含 有莽菜化27H+反向转运蛋白基因的转基因植株对植物寒冷耐受特性具有增强的作用。
[0022] 较佳地，在该方法中使用的核巧酸序列为SEQ ID No. 1中第34-3105位的序列。
[0023] 本发明的另一个方面，还提供与莽菜Ca2Vr反向转运蛋白多肤特异性结合的抗 体，它包括多克隆抗体和单克隆抗体。
[0024] 本发明的另一个方面，还提供上述莽菜化27H+反向转运蛋白基因或上述重组质粒 在植物抗寒性和耐寒性中的应用。较佳地，所述植物为具有经济价值的作物;更佳地，包括 水稻、小麦、玉米、棉花、油菜、番茄和黄瓜。
[0025] 在本发明中，术语"分离的"、"纯化的"或"基本纯的"DNA是指，该DNA或片段己从天 然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核巧酸 的组份分开，而且己经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。
[0026] 在本发明中，术语"莽菜化2vr反向转运蛋白（或多肤）基因序列"指包含编码莽 菜化27Η+反向转运蛋白活性的多肤的核巧酸序列，如SEQ ID No. 1中第34-292:641-708; 1292-1319；1424-1619；1785-2009；2099-2228；2322-2438；2538-2709；2822-2916；3017- 3105位核巧酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID No.1序列的基因编码框内 的核巧酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序 列。由于密码子的简并性，所W与沈Q ID No. 1 中:34-292;641-708; 1292-1319; 1424-1619; 1785-2009; 2099-2228; 2322-2438; 2538-2709; 2822-2916; 3017-3105 编码区内的核巧酸序 列同源性低至约70%的简并序列也能编码出SEQ ID No. 2所述的序列。该术语还包括能在 中度严紧条件下，更佳的在高度严紧条件下与SEQ ID No. 1中从核巧酸第34-3105位核巧 酸序列杂交的核巧酸序列。该术语还包括与SEQ ID No. 1中从核巧酸第34-3105位的核巧 酸序列的同源性至少70%，较佳地至少80%，更佳地至少90%，最佳地至少95%的核巧酸序列。
[0027] 该术语还包括能编码具有与天然的莽菜化2vr反向转运蛋白相同功能的蛋白的 SEQ ID No. 1中开放阅读框序列的变异形式。运些变异形式包括(但并不限于）：若干个(通 常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核巧酸的缺失、插入和/或取代， W及在5'和/或3'端添加数个(通常为60个W内，较佳地为30个W内，更佳地为10个W内，最 佳地为5个W内）核巧酸。
[002引在本发明中，"基本纯的"蛋白质或多肤是指其至少占样品总物质的至少20%，较佳 地至少50%，更佳地至少80%，最佳地至少90%(按干重或湿重计）。纯度可W用任何合适的方 法进行测量，如用柱层析、PAGE或HPLC法测量多肤的纯度。基本纯的多肤基本上不含天 然状态下伴随其的组分。
[0029]在本发明中，术语"莽菜化27h+反向转运蛋白或多肤"指具有莽菜化2vr反向转运 蛋白活性的SEQ ID No. 1序列编码区内编码的多肤。该术语还包括具有与天然莽菜化27H+ 反向转运蛋白相同功能的SEQ ID No. 2序列的变异形式。运些变异形式包括(但并不限 于）:若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、 插入和/或取代，W及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个W内，较佳地为10个 W内，更佳地为5个W内）氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代 时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常 也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括莽菜化27H+反向转运蛋白的活性片段和活性衍生 物。
[0030] 本发明的莽菜化27H+反向转运蛋白多肤的变异形式包括：同源序列、保守性变异 体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与莽菜化27h+反向转 运蛋白DNA杂交的DNA所编码的蛋白、W及利用莽菜化27H+反向转运蛋白多肤的血清获得的 多肤或蛋白。
[0031] 在本发明中，"莽菜化27H+反向转运蛋白保守性变异多肤"指与SEQ ID No. 1编码 区内的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸性质相似或相 近的氨基酸所替换而形成多肤。运些保守性变异多肤最好根据表1进行替换而产生。
[0032] 发明还包括莽菜化27h+反向转运蛋白或多肤的类似物。运些类似物与天然化27h+ 反向转运蛋白多肤的差别可W是氨基酸序列上的差异，也可W是不影响序列的修饰形式上 的差异，或者兼而有之。运些多肤包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可W通过各种 技术得到，如通过福射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知 分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然レ氨基酸的残基（如D-氨基酸）的类似 物，W及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、T-氨基酸）的类似物。应理解，本发明的 多肤并不限于上述列举的代表性的多肤。
[0033] 修饰(通常不改变一级结构)形式包括:体内或体外的多肤的化学衍生形式如乙酷 化或簇基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肤的合成和加工中或进一步加工步骤中进行 糖基化修饰而产生的多肤。运种修饰可W通过将多肤暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物 的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有憐酸化氨基酸残基（如憐酸酪氨 酸，憐酸丝氨酸，憐酸苏氨酸）的序列。还包括被修饰从而提高了其蛋白水解性能或优化了 溶解性能的多肤。
[0034] 在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在 生产本发明的莽菜化27Η+反向转运蛋白多肤时，可W将莽菜化27Η+反向转运蛋白编码序列 可操作地连于表达调控序列，从而形成莽菜化27Η+反向转运蛋白表达载体。
[0035] 表 1
如本发明所用，"可操作地连于"指运样一种状况，即线性DM序列的某些部分能够影响 同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肤DNA作为前体表达并参与多肤的分泌， 那么信号肤(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肤DNA;如果启动子控制序列的转录， 那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么 它是可操作地连于编码序列。一般，"可操作地连于"意味着相邻，而对于分泌前导序列则意 味着在阅读框中相邻。
[0036] 在本发明中，术语"宿主细胞"为真核细胞。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、拟 南芥细胞、烟草细胞和其它植物细胞。
[0037] 还可用Nodhern印迹法或巧光定量PCR技术分析莽菜化2VH+反向转运蛋白基因产 物的表达，即分析莽菜化27H+反向转运蛋白的RNA转录物在细胞中的存在与否和数量。
[0038] 莽菜Ca27H+反向转运蛋白基因的Nodhern印迹分析和莽菜化2 VH+反向转运蛋白 特异抗体的Western印迹分析可W联合使用，W证实莽菜化2Vr反向转运蛋白在生物样本 中的表达。
[0039] 此外，本发明中可用作探针的核酸分子，该分子通常具有莽菜Ca2Vr反向转运蛋 白基因序列的8-100个连续核巧酸，较佳地具有15-50个连续核巧酸。该探针可用于检测样 品中是否存在编码莽菜化27H+反向转运蛋白的核巧酸分子。
[0040] 本发明设及检测样品中是否存在莽菜冷化27H+反向转运蛋白核巧酸序列的方法， 它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是 PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于莽菜Ca27H+反向转运蛋白核巧酸序列，并可位 于该序列的两侧或中间。引物长度一般为15-50个核巧酸。
[0041] 此外，根据本发明的莽菜Ca2Vr反向转运蛋白基因序列和氨基酸序列，可W在核 酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选莽菜化27H+反向转运蛋白同源基因或同源蛋 白。
[0042] 为了得到与莽菜Ca27H+反向转运蛋白基因相关的莽菜DNAs的点阵，可W用DNA探 针筛选莽菜基因组文库，运些探针是在低严紧条件下，用32P对莽菜化27h+反向转运蛋白的 全部或部分做放射活性标记而得的。最适合于筛选的基因组文库是来自莽菜的文库。构建 来自感兴趣的细胞或者组织的基因组文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外，许 多运样的基因组文库也可W购买到，例如购自Clontech，S化atagene，化1〇 Alto,化1.。运 种筛选方法可W识别与莽菜化27H+反向转运蛋白基因家族同源的核巧酸序列。
[0043] 本发明的莽菜Ca2Vr反向转运蛋白基因全长序列或其片段通常可W用PCR扩增 法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核巧酸序 列，尤其是一些保守序列来设计引物，并用市售的基因组文库或按本领域技术人员已知的 常规方法所制备的基因组文库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行 两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
[0044] -旦获得了有关的序列，就可W用重组法来大批量地获得有关序列。运通常是将 其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。 此外，还可用人工化学合成的方法来合成有关序列。在本申请之前，现有技术已完全可W通 过先合成多个多核巧酸小片段，然后再进行连接而获得带有编码本发明莽菜化27H+反向转 运蛋白的全长基因序列。然后，可将该基因序列引入本领域中各种现有的DNA分子(如载 体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明的氨基酸序列中。
[0045] 除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肤而 方口W生产（Guan X, Chaffey ΡΚ, Zen邑 C, Tan Z. New methods for chemical protein synthesis. Top Curr Chem. 2015, 363:155-92)。在体外合成蛋白质可W用手工或自动 进行。例如，可W用Applied Biosystems的431A型肤合成仪(Foster City, CA)来自动合成 肤。可W分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加 W连接W产生全长的分子。
[0046] 本发明的莽菜Ca2Vr反向转运蛋白可通过生物技术用来提高经济作物的抗寒能 力，在全球±地日趋紧缺人口爆炸的情况下，本发明具有很好的应用前景。
【附图说明】
[0047]图1为各种处理条件下莽菜化27h+反向转运蛋白基因在莽菜叶、根、茎中的表达分 析。其中，A.低溫诱导;B.低溫驯化;C.各种激素处理;D.各种离子处理。
[004引图2转基因烟草植株中潮霉素抗性基因的分子鉴定。泳道M. DNA marker;1,野生 型烟草;2.阳性质粒;3.转空载体烟草;4.空白对照;5-12.转基因烟草抗性苗。
[0049] 图3转莽菜Ca27H+反向转运蛋白基因烟草阳性苗中目的基因的PCR鉴定结果。泳 道M. DNA marker; 1-8转基因烟草阳性苗;9.野生型烟草；10.转空载体烟草；11.空白对照； 12.阳性质粒。
[0050] 图4转基因烟草阳性植株中莽菜化27H+反向转运蛋白表达量测定结果。
[0051] 图5冷胁迫下转基因烟草阳性植株的表型观察。
[0052] 图6转基因烟草阳性植株的耐寒生理指标测定。其中，A.叶片电解质渗出率的测定 结果;B.相对含水量的测定结果;C葡萄糖含量的测定结果。
[0053] 图7转基因烟草阳性植株中內源冷诱导基因的表达量测定结果。
【具体实施方式】
[0054] 下面结合结合具体实施例，进一步阐述本发明。运些实施例仅用于说明本发明而 不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件， 例如（例如萨姆布鲁克（著），黄培堂（主译）.分子克隆验指南（精编版），化学工业出版 社，2008)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0055] 实施例1莽菜化27H+反向转运蛋白基因的分离和鉴定 1.莽菜幼苗培养 莽菜种子来源于上海市种子公司，莽菜种子经过消毒处理，播种于1/2MS培养基上，置 于22°C下培养两周后移栽入±壤(赔石：黑±:珍珠岩=9:3:1)中，1化光照，她黑暗条件下培 养。
[0化6] 2.莽菜叶片DNA和RNA提取 取4周左右大小的莽菜叶片，在液氮中研磨成粉，分别采用植物RM提取试剂盒 (CW0588 )(北京康为世纪生物科技有限公司）和CTAB法提取莽菜的总RNA和全基因组DNA。琼 脂糖凝胶电泳分别检测RNA和DNA的质量。
[0057] 3.莽菜化27H+反向转运蛋白基因编码区核屯、序列的克隆 根据拟南芥和油菜中的化2Vr反向转运蛋白氨基酸序列的编码区（GenBank登陆号分 别为匪_20 1 90 1 . 3和XM_009 1 43477 . 1 )，分别设计一对引物（CbCAXl : 5- TGTTAGGTTCGATTTTGTCAAA-3(记为沈Q ID No.5)和CbCAX2: 5-GTTCAGCGGCATTTCCAACAA-3 (记为SEQ ID No.6))，利用RT-PCR技术进行编码区核屯、序列的扩增。扩增到的PCR产物经 1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，得到一条特异性很强的片段，长度为500bp左右。回收该片段 并连接到PMD-19T载体上，将连接产物转化^ 0册3感受态细胞，测序得到序列长度 为53化P。用Blast分析发现，该片段的核巧酸序列与拟南芥CAX1(NM_201901.3)的CDS序列 同源性为87%，与甘蓝CAX1-1化e(公rassi ca oJeracea)的CDS序列的同源性为87%，与欧洲 油菜CAX1 (公rassi ca na/ws)的CDS序列的同源性为86%，证实该序列的正确性。
[0化引4.莽菜化27H+反向转运蛋白基因组序列的克隆 W步骤3获得的片段为模板设计引物，采用基因组步移的方法进行莽菜化2vr反向转 运蛋白基因的克隆，克隆分Ξ步进行： (1) 使用步骤3的引物，W步骤帥所提取的DNA作为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系 为aOXPCR Buffer 5化;]\%(：12 (25mM) 10^;(1ΝΤΡ Mix (lOmM) 5化；Taq DNA聚合酶（5U/ 化）1化；Primerl (10 μΜ) liiLsPrimerf (10 μΜ) 1化；DNAl 化；地2〇 26 化；总体积 50 化。使用程序为：94°C for 5 min，30 巧cles (94°C for 30 sec, 56°C for 30 sec, 72 °C for 50 sec)。扩增到的PCR产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，得到一条特异性很强的 片段，长度为900bp左右。回收该片段并连接到PMD-19T载体上，将连接产物转化^ . coi7 D册a感受态细胞，测序得到序列长度为878bp。与步骤3序列比对分析，发现除了多出的Ξ段 内含子序列外，其余序列与步骤3均相同，说明我们得到的序列为化27H+反向转运蛋白基因 组中间序列； (2) 根据步骤(1)获得的序列分别设计扩增中间序列上游和下游的引物，其中两个上游 引物分别记为饥CAX5-U5-CCATTTAGGCAGTAAGAAGAAGT-3(记为SEQ ID 齡.7)和饥〔4乂5-2 巧-(：〔661^644〇：6圳6(：了666-3(记为沈9 10齡.8))，两个下游引物分别记为化〔4乂3-1巧- GATCGGTTACATTGCATATCT-3(记为沈Q ID No. 9)和CbCAX3-2巧-CCGCGGTGATTAGTTTTTG-3(记 为沈Q ID No.lO))。^提取的莽菜基因组DNA为模板，利用CI0NTECH公司提供的化iversal GenomeWalker Kit(Clontech)试剂盒中的接头引物API和AP2分别与上游基因特异引物和 下游基因特异引物组合进行巢式扩增，所得目的条带即包含有向中间序列的5'或3'外移了 一定距离的序列。PCR的反应体系和程序均按试剂盒的说明书进行。上游序列的扩增经1.0% 的琼脂糖凝胶电泳检测，得到一条特异性很强的片段，长度为leOObp左右。下游序列的扩增 经1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，得到一条特异性很强的片段，长度为95化P左右。分别回收 运两个片段并连接到PMD-19T载体上，将连接产物转化反0册3感受态细胞，测序得 到上游序列长度为1620bp，下游序列长度为97化P; (3) 根据步骤(1)和(2)扩增片段进行序列拼接，然后根据拼接序列设计扩增全长引物， 引物序列分别为FCbCAX巧-TTTTGAGTCAGTGCGTGCCTCAGG-3(记为沈Q ID No. 11))和R饥CAX 巧-TTAAGTTGAAGAAGCTCCTCCTGTTCC-3(记为沈Q ID No. 12))。W莽菜基因组DNA为模板进行 PCR扩增获得全长序列。PCR反应体系和程序与步骤（1)相同，扩增到的PCR产物经1.0%的琼 脂糖凝胶电泳检测，得到一条特异性很强的片段，长度为3000bp左右。回收该片段并连接到 PMD-19T载体上，将连接产物转化^ 0册3感受态细胞，测序得到序列长度为3105bp。 与步骤(1)和步骤(2)拼接的序列相同，说明我们获得的序列为莽菜化27H+反向转运蛋白基 因组完整序列。
[0059] 实施例2莽菜化27H+反向转运蛋白基因的生物信息学分析 1.基因结构分析 将获得的序列与莽菜化27H+反向转运蛋白基因的CDS序列(AY660870)进行比对，发现 莽菜基因组序列包含8个内含子，8个内含子均包含gt-ag内含子保守序列，除去内含子，莽 菜Ca27H+反向转运蛋白的CDS序列包含140化口。
[0060] 2.同源性分析 使用ht1:p://www.ncbi .nlm.n;Lh. gov/blast网站通过Protein-Protein BLAST捜索与 莽菜化27h+反向转运蛋白基因同源的基因序列，结果显示该序列与同属十字花科植物亚麻 莽（CameJina saiira)、甘蓝（公.oJeracea)、欧洲油菜（公.na/ws)、拟南芥（儿 iAaJia打a) C A X1和C A X 3的氨基酸序列的同源性为分别为9 5 % ; 9 0 % ; 9 0 % ; 9 0 %和8 1 %。与木本棉 (G ossjjoit/m ar6cLTet/m)CAX3-like的同源性为73%，推测莽菜化2+/H+反向转运蛋白基因可 能具有拟南芥和母本棉中同源基因的相似的功能。
[0061] 实施例3莽菜化27H+反向转运蛋白基因的表达特性分析 1.莽菜植株的处理 (1) 冷诱导处理：将26°C长日照条件下生长4w的莽菜幼苗，移至4°C分别处理4h，8h， 2地，4她； (2) 冷驯化处理:将26 °C长日照条件下生长4w的莽菜幼苗，依次放入12 °C处理4d，4°C处 理4d，0°C处理化； (3) 激素处理:将在26°C长日照条件下生长4w的莽菜幼苗，分别经浸泡在扣Μ GA，300μΜ MeJA，20yM ΙΑΑ,100μΜ ΑΒΑ水溶液处理化，6h，24h; (4) 离子溶液处理：将在26°C长日照条件下生长4w的莽菜，分别使用80mM KCl，50mM MgCl2,5mM ZnCl2,30mM LiCl，0.1mM CuCl2,80mM CaCb水溶液浸泡处理4h，8h，24h。
[0062] 2.莽菜叶、根、茎Ξ种组织的总RNA提取 采用植物RNA提取试剂盒(CW0588K北京康为世纪生物科技有限公司）分别提取莽菜 根、茎、叶Ξ种组织的总RNA,步骤与实施例1(2)相同。
[0063] 3.巧光定量PCR 采用实时巧光定量PCR检测各种处理条件下莽菜化27H+反向转运蛋白基因表达量的变 化，实验设置Ξ组重复，W莽菜18s rRNA基因 （GenBank Accession No.:AY662285)为内参。 结果显示，莽菜化2vr反向转运蛋白基因在莽菜的根、茎和叶中都有表达，叶、茎中的表达 量略高于根。冷诱导（图1A)和冷驯化（图1B)处理后均能显著提高莽菜根、茎和叶中化27r 反向转运蛋白基因在各组织中的表达量，叶中提高最显著；不同激素处理对莽菜化2vr反 向转运蛋白基因的表达调控结果不同。ΑΒΑ和GA处理都能短暂上调莽菜化2vr反向转运蛋 白基因的表达水平，而持续的处理反而会降低表达水平;Me JA处理能抑制莽菜化27H+反向 转运蛋白基因的表达；IAA对其基因的表达没有影响（图1C);金属离子处理发现，钟离子和 儀离子能抑制莽菜化27H+反向转运蛋白基因的表达，抑制作用随着处理时间变长会增强； 锋离子和裡离子的短时间处理会增强莽菜化27H+反向转运蛋白基因的表达，而长时间的处 理反而会使其表达量下调;巧离子和铜离子能上调莽菜化27H+反向转运蛋白基因的表达水 平（图1D)。
[0064] 实施例4农杆菌介导的叶盘法转化烟草 1.植物表达载体的构建： 在本方案中，莽菜化27H+反向转运蛋白基因被置于35S启动子之后，构建一个植物表达 载体，用于植物转化。
[0065] 2.农杆菌介导法对烟草的转化 (1)农杆菌的培养。挑取单菌落，加入2mL液体培养基中，28Γ培养过夜;取ImLW上培养 物，加入50mL液体培养基中，28 °C培养至0〇6日日=0.6-1.0; SOOOrpm离屯、lOmin，收集菌体，用 MSo重悬，使0〇6日日=1.0; (2) 共培养。取烟草无菌苗的幼嫩、健壮叶片，去主脉，将叶片剪成O.ScmXO.8cm左右的 叶盘，放在MSi培养基上，防止叶盘脱水;将叶盘放入农杆菌培养液中，190rpm，28 °C摇床上 浸染lOmin;用药勺拱出叶盘，放在灭菌的吸水纸上，吸干叶盘上的多余菌液;将吸干的叶盘 平放在加盖一层滤纸的MSi培养基上，化Γ左右，于暗处共培养约2d; (3) 诱导丛生芽。共培养后，按W下步骤将叶盘表面的农杆菌洗掉，其间不时摇动，使叶 盘充分接触下列溶液:无菌水，15min;无菌水+簇节青霉素巧OOmg/L)，15min; MSo +簇节青霉 素（500mg/L)，20min。用药勺拱出叶盘，放在吸水纸上，吸干多余水分;将叶盘放在MS2培养 基上，叶盘边缘轻压入培养基中；25 °C左右，1化光照培养； (4) 诱导生根。在MS2培养基上诱导约4w后，将叶缘长出的幼芽从基部与叶盘切开，将幼 芽插入MS3培养基中诱导生根，化°C左右，1化光照培养。
[0066] 实施例5转基因烟草的分子检测 1.转基因烟草DNA提取及抗性基因的PCR检测 转基因烟草DNA的提取步骤可参照实施例1(2)的方法。W提取的转基因烟草基因组DNA 为模板，使用潮霉素基因的特异性引物(Hyg-F 5-GTCGAGAAGTTTCTGATCG-3 (记为沈Q ID No.13)和 Hyg-R 5-GTTTCCACTATCGGCGAGTACT-3(记为沈Q ID 齡.14))进行？0?扩增，^野 生型和转空载体的烟草样品为阴性对照，1%琼脂糖凝胶检测转基因烟草基因组中是否含有 潮霉素抗性基因（700bp)，结果显示在图2,检测结果显示共获得35棵转基因抗性苗。
[0067] 2.转基因烟草中目的基因的PCR检测 W提取的转基因烟草基因组DNA为模板，使用莽菜化2vr反向转运蛋白基因的特异性 引物进行PCR扩增，引物序列为:CbCAXFl (5-TCTGCGACTCAGATTGGCTTATTCGTCG-3(记为SEQ ID No. 15))和RCbCAX巧-TTAAGTTGAAGAAGCTCCTCCTGTTCC-3(记为沈Q ID No. 12))。W野生型和 转空载体的烟草样品为阴性对照，1%琼脂糖凝胶检测转基因烟草基因组中是否含有化27H+ 反向转运蛋白目的基因巧40bp)，结果显示在图3,检测结果显示共获得28棵转基因阳性苗。
[0068] 3.转基因烟草的RNA提取及目的基因表达量测定 转基因烟草RNA的提取可参照实施例1 (2 )的方法。用巧光定量PCR检测28株转基因烟草 中莽菜Ca27H+反向转运蛋白基因的表达量，使用的引物序列为:Realtime-CbCAX51-F(5- CTTACTCCTAATGGGTTTGTTGTGTCA-3(记为SEQ ID No. 16)和Realtime-CbCAX51-R(5- AGGCAAAAATGATGGCTCCAGCGTGTT-3(记为沈Q ID No. 17)。结果显示不同的转基因株系其表 达量不同，图4显示的是其中2株转基因烟草阳性植株的表达量。
[0069] 实施例6转基因烟草阳性植株的耐寒性试验 选取表达量较高的2个株系，继续种植后获得纯系。将所述的2个转基因纯系植株置于 12°C光照培养，冷适应4d，然后置于-4°C暗处理lh-2h，统计存活率。W同时期栽培生长的野 生型烟草苗和转入空载体的植株同样处理作为对照组。实验设置Ξ组重复，通过t-检验评 价实验组和对照组的显著性差异。通过低溫处理检测烟草苗存活率可见，-4°C处理化后，转 基因阳性植株存活率显著高于野生型对照；化后存活率降低，但依然明显高于野生型植株。 说明转入莽菜Ca27ir反向转运蛋白基因在提高烟草植株的耐寒性和抗冻性方面有重要作用。
[0070] 实施例7冷胁迫下转基因烟草的表型观察 选取转基因阳性烟草2个株系，置于12°C光照培养，冷适应4d，之后依次置于4°C处理 24h，-4°C处理化，在22°C恢复3d，拍摄记录转基因阳性烟草与非转基因的野生型烟草和转 入空载体烟草植株的表型差异（图5)。结果显示22°C正常溫度下转基因烟草无生长延迟、矮 化等现象;4°C冷处理下转基因烟草阳性苗和对照都出现轻微冻害的表型，少数叶片萎缩。- 4°C处理后对照组的烟草植株受冷害严重，出现更严重的叶萎缩和茎干倒伏现象;转基因烟 草阳性植株仅出现部分叶片萎缩现象。将转基因烟草阳性植株和对照放回在26°C恢复生 长，Ξ天后转基因烟草阳性植株可恢复到正常生长状态，而对照幼苗则会萎缩、死亡。
[0071 ]实施例8转基因烟草的耐寒生理指标的测定 取将实施例7处理后的烟草叶片测定叶片电导率、相对含水量与葡萄糖含量。实验设置 Ξ组重复，通过t-检验评价转基因组和对照组的显著性差异。
[0072] 1.叶片电导率的测定 使用8mm口径打孔器在各烟草植株同一部位叶片的主脉两侧取叶盘8个，浸于10ml d地2〇中抽真空化，使用电导仪孤S-11A(上海索申）检测表观电导率。100°C煮沸后冷却至室 溫，检测绝对电导率。相对电导率=表观电导率/绝对电导率X 100%。结果显示在冷胁迫下对 照组烟草叶片在冷胁迫下电导率显著增大，质膜透性显著增加;而转基因烟草阳性植株叶 片质膜透性增加明显较缓慢，且幅度也小，说明其细胞质膜受损程度较轻。统计显示两者差 异显著（图6A)。
[007引2.相对含水量测定 使用6 mm口径打孔器在各种处理过的烟草植株同一部位叶片的主脉两侧取叶盘8个， 称取鲜重(FW);将叶盘放入Milli-Q水中抽真空4 h，称取湿重(TW);将叶盘用吸水纸吸干， 85°C干燥24 h，称取干重(DW);相对水含量(％)= (FW - DW)/(TW - DW) X100%。结果显示 在冷胁迫下转基因烟草阳性植株叶片中的相对水含量明显高于对照组烟草植株，说明转基 因烟草阳性植株自由水丧失较少，受冷害较轻。统计结果显示两者差异显著（图6B)。
[0074] 3.葡萄糖含量测定 使用葡萄糖含量(服法)测定试剂盒(51旨1113-41化1证，111(3.，肥4)用来检测烟草叶片相 对葡萄糖的含量。用打孔器从处理的烟草叶片取直径为8mm小圆片，浸润在1ml d加 2〇中， 65° C处理化，然后抽真空化后测定用分光光度计（E邮endow,Germany)测定％0 nm处 NADH产物的吸光值。W去离子水做为对照。葡萄糖含量的计算公式为：葡萄糖含量=0.319 X[Atest-(Asample blank +Areagent blank)]。结果显示在冷胁迫下转基因烟草阳性植 株叶片细胞中的葡萄糖含量有显著提高，提高幅度明显大于对照组(图60。
[0075] 实施例9转基因烟草的植株的抗冷性形成的分子机制分析 由W上冷驯化的表型可W看出转基因烟草阳性植株的冷耐受能力有了较大程度的提 高，运种能力的提高必然与植物细胞膜保护蛋白等物质有关，也就是说转基因烟草阳性植 株中的莽菜化2vr反向转运蛋白可能通过激活冷响应的信号途径的关键基因而提高烟草 的抗冷性。烟草中存在与拟南芥中相似的冷响应途径相关基因，其中公7和 W 怎公J编码C公戶/ 怎公类转录因子，在冷信号途径中起重要作用；W ?份化和 Wi怎化? 则编码下游的一些aw基因;WirS/J是与病害等有关的一个转录因子。转基因烟 草RNA的提取可参照实施例1 (2 )的方法。用巧光定量PCR技术检测转基因烟草植株中5个内 源冷响应基因的表达量变化。检测结果发现，除了W ? Γ 7，冷处理前后，其它4个与冷信 号转导有关的基因表达量都有明显的提高，其中W 7?怎公7和W ? 07?怎公J表达量上调 最为明显（图7)。
【主权项】
1. 一种从荠菜中分离的具有低温诱导表达特性的荠菜Ca2+/H+反向转运蛋白基因，其特 征在于，所述荠菜Ca 2+/H+反向转运蛋白基因选自以下之一： (1) 其核苷酸序列如SEQ ID No. 1中第34-3105位碱基所示； (2) 其核苷酸序列与SEQ ID No. 1 中从核苷酸第34-292;641-708;1292-1319;1424-1619; 1785-2009; 2099-2228; 2322-2438; 2538-2709; 2822-2916; 3017-3105位 DNA 分子的核 苷酸序列有至少70%同源性、且编码相同功能蛋白质;或者 (3) 其核苷酸序列在中度严紧条件下与SEQ ID No. 1中从核苷酸第34-3105位的核苷酸 序列杂交、且编码相同功能蛋白质。2. -种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒含有权利要求1所述的荠菜Ca2+/H+反向转 运蛋白基因。3. -种荠菜Ca2+/H+反向转运蛋白，其特征在于，所述荠菜Ca2+/H+反向转运蛋白选自以 下之一： (1) 其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示;或者 (2) 具有SEQ ID No. 2氨基酸序列之多肽的保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性 衍生物。4. 制备权利要求1所述的荠菜Ca2+/H+反向转运蛋白基因的方法，其特征在于，具体步骤 为： (1) 将荠菜种子经过70%酒精消毒后，播种于MS培养基上； (2) 待所述荠菜种子长出叶片后，提取所述叶片的基因组DNA，用1%琼脂糖凝胶电泳分 析其质量；以及 (3) 采用同源克隆技术，利用上游引物和下游引物得到所述荠菜Ca2+/H+反向转运蛋白 基因，所述上游引物为FCbCAX: 5-TTTTGAGTCAGTGCGTGCCTCAGGGGTGG-3，所述下游引物为 RCbCAX:5-TTAAGTTGAAGAAGCTCCTCCT-3。5. 制备权利要求2所述的重组质粒的方法，具体步骤为： (1) 设计引物对，扩增出权利要求1所述的荠菜Ca2+/H+反向转运蛋白基因的完整DNA片 段，所述引物对的上游引物为FCbCAX: 5-TTTTGAGTCAGTGCGTGCCTCAGGGGTGG-3，所述下游引 物为RCbCAX: 5-TTAAGTTGAAGAAGCTCCTCCT-3;以及 (2) 将所述完整DNA片段克隆到中间载体pMD19-T，再进一步克隆到植物表达载体pl304 上，得到所述重组质粒。6. 根据权利要求5所述的方法，还包括向所述上游引物引入限制性酶切位点#C〇I，以 及向所述下游引物引入限制性酶切位点5 s Μ II。7. 权利要求1所述的荠菜Ca2+/H+反向转运蛋白基因或权利要求2所述的重组质粒在植 物抗寒性和耐寒性中的应用。8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述植物为具有经济价值的作物，包括水 稻、小麦、玉米、棉花、油菜、番茄和黄瓜。9. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，将所述重组质粒转入根癌农杆菌EHA105 中，然后用于转化目的植物，提高植物对寒冷的耐受性。10. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，利用转基因技术将编码具有荠菜Ca2+/H+ 反向转运蛋白活性多肽的核苷酸序列转化入植物，以提高植物对寒冷的耐受性，其步骤如 下： (1) 将编码具有荠菜Ca2+/H+反向转运蛋白活性多肽的纯化的核苷酸序列可操作地连于 植物表达调控序列后，形成含荠菜Ca 2+/H+反向转运蛋白基因的植物表达载体，所述的核苷 酸序列与SEQ ID No. 1中从核苷酸第34-3105位的核苷酸序列有至少70%的同源性； (2) 将步骤(1)中的表达载体转入农杆菌，将含表达载体的农杆菌同真核宿主细胞共培 养，在22-28Γ条件下，暗培养l-2d后，通过筛选，获得含有荠菜Ca 2+/H+反向转运蛋白基因 的转化细胞并最终再生转基因植株及其后代，包括植物种子及植物组织。
【文档编号】C12N15/29GK106011148SQ201610531137
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月7日
【发明人】林娟, 陈虎, 李伟伟, 魏东晖
【申请人】复旦大学